專利名稱：防治人參灰霉病和黑斑病的生物農(nóng)藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及防治人參灰霉病和黑斑病的生物農(nóng)藥。
背景技術(shù)：
人參是一種名貴的中藥材，在我國(guó)具有悠久的藥用歷史，近些年由于市場(chǎng)需求的增長(zhǎng)，人工栽培人參規(guī)模也隨之增加。 在人參種植過(guò)程中，病害的發(fā)生和發(fā)展將會(huì)對(duì)產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重的影響，有效控制病害是人參生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)。目前，防治病害的主要方法是利用化學(xué)農(nóng)藥在病害發(fā)生期進(jìn)行控制，但長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥或不合理使用會(huì)導(dǎo)致人參中農(nóng)藥殘留超標(biāo)、品質(zhì)下降、污染環(huán)境和病原菌產(chǎn)生抗藥性等不良后果的出現(xiàn)。自2007年以來(lái)，我國(guó)人參產(chǎn)品出口數(shù)量呈下降趨勢(shì)，出口的人參常因農(nóng)藥殘留超標(biāo)不時(shí)有被退回的現(xiàn)象發(fā)生，國(guó)際市場(chǎng)信譽(yù)不良。因此開展人參病害生物防治研究，獲得生防菌株和有效產(chǎn)品，減少或替代化學(xué)農(nóng)藥的使用，對(duì)于保障我國(guó)人參生產(chǎn)安全，加快人參產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展進(jìn)程，提高我省人參產(chǎn)品的質(zhì)量及國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力具有重要意義。植物內(nèi)生菌是一類定殖在植物體內(nèi)與植物建立和諧關(guān)系的一類微生物，有些菌株具有拮抗、促生等生物學(xué)功能，可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，特別是在新的抗植物病蟲害物質(zhì)方面，為我們提供了一類新的微生物資源，目前已有多種植物的功能內(nèi)生菌報(bào)道。因此，從人參植株體內(nèi)獲得具有較好抗菌和生防作用的新型細(xì)菌菌株，進(jìn)而生產(chǎn)出高效的生物菌齊U，將有利于人參病害的防治，減少化學(xué)農(nóng)藥的污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服農(nóng)藥殘留超標(biāo)問(wèn)題，而提供一種人參病害防治生物農(nóng)藥。防治人參灰霉病和黑斑病的生物農(nóng)藥，是由下述方法制得，它包括:
1)保藏編號(hào)為CGMCCN0.6679的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌，在種子培基中，培養(yǎng)；制備種子培養(yǎng)液；所述的種子培養(yǎng)基，包括:胰蛋白胨10 g/L、酵母膏10 g/L、NaCl 5 g/L，pHS7.0;
2)種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C恒溫?fù)u床培養(yǎng),制得發(fā)酵液；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括:葡萄糖30 g/L、淀粉15 g/L、酵母浸粉15 g/L、NaCl 5 g/L、K2HPO4 I g/L，pH為
8.0 ；
步驟I)所述的培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為10 h ；
步驟2)所述的搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為96h ；
所述的發(fā)酵液稀釋5倍。本發(fā)明提供了人參內(nèi)生拮抗細(xì)菌NJ13，是一種甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌，是從人參莖部分離、篩選得到的；其發(fā)酵菌液及其濾液能拮抗人參常見7種病害及其它常見植物病害，特別是對(duì)人參灰霉病和人參黑斑病防治效果更佳；它來(lái)源于人參植株，對(duì)人參安全；發(fā)酵過(guò)程中所用原料成本較低；抗菌活性物質(zhì)制備簡(jiǎn)單，操作方便，防治效果好；能有效的解決人參農(nóng)藥防治殘留嚴(yán)重的問(wèn)題，是一種可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的、廣譜、高效的綠色生物農(nóng)藥。


圖1為NJ13菌株菌體對(duì)3種人參病原菌的抑制作用圖，A:人參菌核病菌；B:人參立枯病菌；C:人參黑斑病菌；
圖2為NJ13菌株的抗菌譜的測(cè)定，A:人參灰霉病菌；B:人參立枯病菌；C:人參銹腐病菌；D:人參根腐病菌；
圖3為NJ13菌株菌落形態(tài)和染色觀察，A:菌落形態(tài)；B:革蘭氏染色形態(tài)；
圖4為NJ13菌株的細(xì)胞形態(tài)；
圖5為NJ13菌株的發(fā) 酵稀釋液對(duì)人參灰霉病菌的田間防治作用圖，A:清水對(duì)照；B:發(fā)病后噴施NJ13菌株5倍稀釋液的防治效果；
圖6為NJ13菌株的發(fā)酵稀釋液對(duì)人參黑斑病菌的田間防治作用圖，A:清水對(duì)照；B:發(fā)病后噴施NJ13菌株5倍稀釋液的防治效果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1人參內(nèi)生拮抗細(xì)菌株NJ13的篩選
2010年6 9月，在吉林省5個(gè)地區(qū)分別采集新鮮人參(/ :爐'/ .^/ ^)樣品,采集部位為整個(gè)植株，生長(zhǎng)期為4年。在人參根、莖、葉不同器官中共分離獲得了 152株內(nèi)生細(xì)菌。進(jìn)行人參拮抗內(nèi)生菌的篩選分為初篩和復(fù)篩。其中人參植物莖部分離的NJ13菌株；于2012年10月18日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡(jiǎn)稱為CGMCC，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC N0.6679，保藏單位地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼:100101 ;分類命名:甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)。實(shí)施例2人參內(nèi)生拮抗細(xì)菌株NJ13的抗菌性測(cè)定
采用對(duì)峙法對(duì)分離得到的人參內(nèi)生拮抗細(xì)菌NJ13進(jìn)行菌體抑菌活性的實(shí)驗(yàn)。將7種人參病害IE標(biāo)菌(人參銹腐病菌iCylindrocarpon ofestrueia/75.)、人參灰霉病菌iBotrytiscinerea)> 人參菌核病 HSclerotinia schinseng、、人參疫霉鬼 iPhytophthoracaciora )、人參黑斑病菌(Altorrmria人參根腐菌{Fusarium solani)、人參立枯
病菌菌餅接入PDA培養(yǎng)皿中央，同時(shí)將內(nèi)生細(xì)菌NJ13劃線接入靶標(biāo)菌兩側(cè)，25 0C培養(yǎng)2 4d，人參內(nèi)生拮抗細(xì)菌NJ13菌體對(duì)上述病害均有抑菌作用(圖1)。采用杯碟法對(duì)人參內(nèi)生拮抗細(xì)菌株NJ13，進(jìn)行無(wú)菌發(fā)酵液抗菌譜測(cè)定。①將菌株NJ13接種于裝有50mL NB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28°C振蕩培養(yǎng)IOh (150 r/min)制成種子液；②按3%的接種量，將種子液接入50ml細(xì)菌液體培養(yǎng)基中(葡萄糖20 g/L,胰蛋白胨 5 g/L，酵母粉 5 g/L，牛肉膏 3.8 g/L, NaCl 5 g/L，CaCO3 I g/L, pH 7.0)，于 28°C振蕩培養(yǎng)(150 r/min)3d ;③收集培養(yǎng)液離心(12000 r/min, 4°C) 15 min后得清液，取上清液用0.22 Mffl的無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌后備用，得無(wú)菌發(fā)酵液。④將Iml無(wú)菌水加入靶標(biāo)菌的培養(yǎng)試管中，用接種針將菌絲和孢子刮下制成菌懸液與PDA培養(yǎng)基10 mL混合后到入9 cm的培養(yǎng)皿中制成混菌平板。⑤將滅菌牛津杯放入混好靶標(biāo)菌的PDA平板中央，杯中加入200μ 無(wú)菌發(fā)酵濾液，分別置25°C培養(yǎng)3 d 5 d (真菌)、28°C培養(yǎng)I d (細(xì)菌)后測(cè)定抑菌圈直徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株NJ13的發(fā)酵液對(duì)7種常見人參病菌及其它病原真菌都有不同程度的抑制作用(圖2)，而發(fā)酵液對(duì)8種病原細(xì)菌的抑菌效果明顯小于表I中真菌的抑菌效果，其中對(duì)大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌沒有抑制效果(表I)。證明菌株NJ13所產(chǎn)生的活性物質(zhì)的抑菌譜較廣，且對(duì)不同種類病原菌具有選擇性。表I菌株NJ13發(fā)酵濾液對(duì)22種植物病原菌的抑菌效果
權(quán)利要求
1.防治人參灰霉病和黑斑病的生物農(nóng)藥，是由下述方法制得，它包括: 1)保藏編號(hào)為CGMCCN0.6679的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌，在種子培基中培養(yǎng)；制備種子培養(yǎng)液；所述的種子培養(yǎng)基，包括:胰蛋白胨10 g/L、酵母膏10 g/L、NaCl 5 g/L，pHS7.0; 2)種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C恒溫?fù)u床培養(yǎng),制得發(fā)酵液；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括:葡萄糖30 g/L、淀粉15 g/L、酵母浸粉15 g/L、NaCl 5 g/L、K2HPO4 I g/L，pH為8.0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治人參灰霉病和黑斑病的生物農(nóng)藥，其特征在于:步驟I)所述的培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為10 h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的防治人參灰霉病和黑斑病的生物農(nóng)藥，其特征在于:步驟2)所述的搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為96h。
4.根據(jù)權(quán)利要求3 所述的植物病害防治的生物農(nóng)藥，其特征在于，將所述的發(fā)酵液稀釋5倍。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株人參病害生物防治菌株的獲得及應(yīng)用，它是人參內(nèi)生拮抗細(xì)菌NJ13，一種甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌，是從人參莖部分離、篩選得到的；其發(fā)酵菌液及其濾液能拮抗人參常見7種病害及其它常見植物病害，特別是對(duì)人參灰霉病和人參黑斑病防治效果更佳；它來(lái)源于人參植株，對(duì)人參安全；發(fā)酵過(guò)程中所用原料成本較低；抗菌活性物質(zhì)制備簡(jiǎn)單，操作方便，防治效果好；能有效的解決人參農(nóng)藥防治殘留嚴(yán)重的問(wèn)題，是一種可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的、廣譜、高效的綠色生物農(nóng)藥。
文檔編號(hào)A01P3/00GK103210961SQ20131012811
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2012年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月29日
發(fā)明者陳長(zhǎng)卿, 姜云, 尹望 申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)