生防菌株bs101在防治植物灰霉病中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生防菌株BS101在防治植物灰霉病中的應(yīng)用，所述的生防菌株BS101為枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）BS101，保藏編號為CGMCC?No.7727。所述的應(yīng)用包括：制備含所述生防菌株BS101的生防菌劑；將所述的生防菌劑噴施在所述的植物上。本發(fā)明的生防菌株對灰葡萄孢的拮抗作用強(qiáng)烈，可用于灰霉病的防治。且本發(fā)明提供了灰霉病的生物防治方法，不使用化學(xué)農(nóng)藥，具有無毒、不易產(chǎn)生抗藥性、環(huán)境和生物安全等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】生防菌株BS101在防治植物灰霉病中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于作物病害防控【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種生防菌株BSlOl在防治植物灰霉病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蘋果儲存期的灰霉病是一類由灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.:Fr.)引起的植物真菌病害。病菌侵染后，果面呈現(xiàn)圓形或近圓形水潰狀病斑，不凹陷，隨后擴(kuò)大為淺黃色不規(guī)則形軟腐病斑。由于水分的不斷喪失，病斑表皮逐漸皺縮、凹陷，引起全果軟腐皺縮。目前，由于我國產(chǎn)后水果的儲存條件非常有限，而且對產(chǎn)后病害的防控比較薄弱，所以當(dāng)儲存環(huán)境中條件適宜時(shí)，灰霉病迅速蔓延，給蘋果的生產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，使用化學(xué)藥劑是防治多種經(jīng)濟(jì)作物灰霉病的主要措施，常見藥劑有多菌靈、撲海因、嘧霉胺等。但由于產(chǎn)后水果病害的防控是病害控制的最后一道防線，目前可使用的殺菌劑非常有限。此外，灰葡萄孢產(chǎn)孢量大，生長周期短，很容易對殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，已有研究發(fā)現(xiàn)，我國灰霉病菌已對多種殺菌劑如多菌靈、撲海因等產(chǎn)生嚴(yán)重抗藥性問題。因此，對于灰霉病的防控，我們急需尋找更為有效的防治方法。此外，由于化學(xué)殺菌劑具有廣譜性，其大量使用不僅容易破壞微生態(tài)環(huán)境，而且還導(dǎo)致非靶標(biāo)抗性。
[0004]在非化學(xué)性防治措施中，生物防治為最有前途的方法之一，其具有環(huán)境友好、無農(nóng)殘、防效較好等優(yōu)點(diǎn)。目前雖已有一些灰葡萄孢拮抗微生物的報(bào)道，如藤黃灰鏈霉素(Sti^ptomyces luteogriseus) EC000001 (專利 CN200610048662.1)、粉紅粘帚菌(Bionectria ochroleuca)WY_l (專利CN200910072862.4)等，但尚未出現(xiàn)對芽孢桿菌的報(bào)道。另外，國內(nèi)已有利用拮抗細(xì)菌生物防治由灰葡萄孢引起的番茄和百合的灰霉病(如專利CN200610048662和CN200710014340)，但尚缺乏其他作物灰霉病生防菌株的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種生防菌株BSlOl在防治植物灰霉病中的應(yīng)用。
[0006]所述的生防菌株BSlOl的分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，完整命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BS101,已于2013年6月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為=CGMCC N0.7727。
[0007]該生防菌株BSlOl在LB培養(yǎng)基上菌落表面粗糙、不透明，呈現(xiàn)皺縮、白色，能夠形成芽抱，能移動(dòng)，需氧型。
[0008]所述的植物具體可以為蘋果。
[0009]蘋果的品種可以為富士或嘎啦。
[0010]所述應(yīng)用具體包括:
[0011](I)制備含所述生防菌株BSlOl的生防菌劑；
[0012](2)將所述的生防菌劑噴施在所述的植物上。
[0013]噴施生防菌劑時(shí)，噴施至植物表面水珠流動(dòng)即可。[0014]如對蘋果灰霉病進(jìn)行防治時(shí)，可在儲藏期將所述的生防菌劑噴施在蘋果上，噴施至蘋果表面水珠流動(dòng)即可，噴施結(jié)束后可將蘋果20~25°C保濕20~24h。
[0015]為達(dá)到較好的防治效果，所述的生防菌劑中，所述生防菌株BSlOl的濃度優(yōu)選為I X IO8 ~10lclCFU/mL，更優(yōu)選為 I X 108CFU/mL。 [0016]所述生防菌劑可通過如下方法進(jìn)行制備:
[0017](I)將所述生防菌株BSlOl于培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6tltl為0.5~0.8，獲得種子液；
[0018](2)將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)，調(diào)節(jié)發(fā)酵液中生防菌株BSlOl的濃度至I X IO8~101(lCFU/mL，獲得所述生防菌劑。
[0019]所述的培養(yǎng)基可選用LB液體培養(yǎng)基。
[0020]其中，所述種子液的接種量優(yōu)選為I~2% (v/v)，優(yōu)選為1% (v/v)。
[0021]以每升計(jì)，所述發(fā)酵培養(yǎng)液的配方為:葡萄糖，18~22g ；L-谷氨酸，2.4~2.6g ;L-天門冬酰胺，2.4 ~2.6g ;ΚΗ2Ρ04，0.8 ~1.2g ；MgS04.7Η20，0.4 ~0.6g ;KC1，0.4 ~0.6g ；酵母粉，0.8 ~1.2g ;L-苯丙氨酸，2 ~3X 10_3g ；MnS04.H2O, 5 ~6X IO^3g ；CuSO4.5H20,
0.16 ~0.18X10、；FeS04.7Η20，0.15 ~0.17 X l(T3g ;調(diào)節(jié) pH 值為 7.0。
[0022]作為進(jìn)一步優(yōu)選，以每升計(jì)，所述發(fā)酵培養(yǎng)液的配方為:葡萄糖，20g ;L_谷氨酸，
2.5g ;L-天門冬酰胺，2.5g ；KH2PO4, Ig ;MgS04.7H20，0.5g ；KC1,0.5g ;酵母粉，Ig ;L_ 苯丙氨酸，2 X l(T3g ；MnSO4.H2O, 5 X l(T3g ；CuSO4.5H20,0.16 X l(T3g ；FeS04.7H20,0.15 X l(T3g ；調(diào)節(jié)pH值為7.0。該發(fā)酵培養(yǎng)基由Landy培養(yǎng)基改良而來，更有利于本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌的增殖。
[0023]本發(fā)明中，所述擴(kuò)大培養(yǎng)是在發(fā)酵罐中進(jìn)行的，所述擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度為28~30°C，時(shí)間為20~24h。在該培養(yǎng)條件下，在保證菌活力的同時(shí)使其具有較快的增殖速度。
[0024]擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液pH值維持在7.0,溶氧量為20%，通氣量5_7m3/小時(shí)，轉(zhuǎn)速240~260r/min，罐壓0.05-0.1KPa0發(fā)酵液出罐后梯度稀釋涂板檢測并調(diào)節(jié)菌懸液濃度為 IXlO8 ~10lclCFU/mL。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0026](I)本發(fā)明的生防菌株BSlOl為枯草芽孢桿菌，生防菌BSlOl菌體和上清在平板拮抗試驗(yàn)中顯示對灰葡萄孢菌菌絲生長、孢子萌發(fā)有較好的抑制作用，可將其應(yīng)用于植物灰霉病的生物防治。
[0027](2)光照培養(yǎng)箱進(jìn)行的蘋果灰霉病防治試驗(yàn)效果顯示，本發(fā)明的生防菌株BSlOl能有效抑制病菌在蘋果表面的病斑擴(kuò)展，防效高達(dá)97%，在貯藏條件下，本發(fā)明的生防菌株BSlOl對蘋果灰霉病的防效仍可達(dá)到71%左右，防治效果好，因此可利用該生防菌株BSlOl防治蘋果灰霉病。
[0028](3)本發(fā)明生防菌株BSlOl應(yīng)用于植物灰霉病的防治，可完全克服因化學(xué)農(nóng)藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利于農(nóng)產(chǎn)品的無公害生產(chǎn)，農(nóng)民可以不用或減少其他化學(xué)農(nóng)藥的用量，這不僅可為農(nóng)民節(jié)省開支，而且有利于提高產(chǎn)品質(zhì)量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為生防菌BSlOl的菌落形態(tài)圖。
[0030]圖2為BSlOl平板拮抗灰葡萄孢菌菌絲生長。[0031]圖3為BSlOl無菌上清抑制灰葡萄孢菌菌絲生長。
[0032]圖4為BSlOl無菌上清抑制灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)。
[0033]圖5為BSlOl生防菌劑光照培養(yǎng)箱防治富士灰霉病效果。
[0034]圖6為BSlOl生防菌劑光照培養(yǎng)箱防治嘎啦灰霉病效果。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡釋。
[0036]實(shí)施例1BS101生防菌株的采集、分離和鑒定
[0037]BSlOl菌株分離自江蘇省海安縣小麥麥穗上。取小麥麥穗磨碎，80°C水浴10分鐘后涂布于LB平板上；次日挑取菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。
[0038]菌株BSIOI在LB培養(yǎng)基上菌落表面粗糙、不透明，呈現(xiàn)皺縮、白色(見圖1 )，能夠形成芽抱，能移動(dòng)，需氧型。
[0039]提取該菌株的DNA，擴(kuò)增16S rDNA序列，進(jìn)行測序，該菌株的16SrDNA如SEQ IDN0.1所示,序列在NCBI中的比對結(jié)果顯示與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的同源性最聞。
[0040]該菌株已保存在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2013年6月18日，保藏編號為=CGMCCN0.7727。
[0041]實(shí)施例2生防菌劑的制備
[0042]1、生防菌劑的制備
[0043](I)將生防菌株BSlOl接種到LB培養(yǎng)液中，30°C，180r/min振蕩培養(yǎng)，12~16小時(shí)后在超凈工作臺中分別取樣測600nm處的OD值，OD測定過程中以未接菌的培養(yǎng)液來調(diào)零；
[0044](2)當(dāng)振蕩培養(yǎng)至菌液的OD值為0.5~0.8之間時(shí)即為種子菌液，將種子菌液以體積比為1:100加入裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的200L發(fā)酵罐中，30°C 250r/min振蕩培養(yǎng)20~24小時(shí)，發(fā)酵液PH值維持在7.0，溶氧量為20%，通氣量5-7m3/小時(shí)，罐壓為0.05-0.1KPa0發(fā)酵液出罐后梯度稀釋涂板檢測并調(diào)節(jié)菌懸液濃度約為I X 109cfu/ml。
[0045]發(fā)酵培養(yǎng)液的配方(每升)為:葡萄糖，20g ;L_谷氨酸，2.5g ;L_天門冬酰胺，2.5g ；KH2PO4, Ig ；MgS04.7Η20，0.5g ；KC1,0.5g ;酵母粉，Ig ;L_ 苯丙氨酸，2X 10_3g ；MnSO4.H2O,5X 10_3g ；CuSO4.5Η20，0.16X 10_3g ；FeS04.7Η20，0.15X10、；調(diào)節(jié) pH 值為 7.0。
[0046]實(shí)施例3BS101生防菌株對灰葡萄孢菌的拮抗活性測定
[0047]UBSlOl對灰葡萄孢菌平板拮抗活性測定
[0048](I)試驗(yàn)方法
[0049]采用對峙培養(yǎng)法，將保存于4°C中的灰葡萄孢菌GZ22 (模式菌)接種到PDA平板上活化，待真菌長滿平板后用滅菌的打孔器從菌落外邊緣均勻的打成直徑為6_的圓形菌塊。將菌絲塊接種在WA平板(WA培養(yǎng)基/L:蛋白胨5g，葡萄糖10g，肉汁浸膏3g，氯化鈉5g，瓊脂20g，pH=7.0)的中心，在其四周距中心約25mm處分別接種BS101，試驗(yàn)以枯草芽孢桿菌模式菌株P(guān)Y79、清水和0.3μ g/ml環(huán)酰菌胺為對照組。25°C培養(yǎng)，待菌絲接近長滿平板時(shí)測量抑菌圈的大小(從細(xì)菌菌落中心算起)。[0050]根據(jù)抑菌圈的大小對BSlOl的拮抗灰葡萄孢菌活性進(jìn)行評估:0mm無抑制作用；< 2mm有輕微的抑制作用；2-5mm中等抑制作用；> 5mm較強(qiáng)的抑制作用。
[0051]抑制率根據(jù)以下公式進(jìn)行計(jì)算:
[0052]抑制率=100 (R「R2) /R1, R1為對照病原菌在清水方向上的菌落半徑；R2為病原菌在細(xì)菌方向的菌落半徑 。
[0053](2)結(jié)果分析
[0054]如圖2所示，平板拮抗試驗(yàn)表明:生防菌BSlOl對灰葡萄孢菌菌絲生長具有較強(qiáng)的抑制效果，抑制圈半徑為15.0mm,菌絲抑制率為71.4%，而陰性對照PY79、清水和環(huán)酰菌胺處理組無拮抗效果。
[0055]2、生防菌BSlOl無菌上清抑制灰葡萄孢菌菌絲活性測定
[0056](I)試驗(yàn)方法
[0057]取實(shí)施例2的生防菌BSlOl菌株發(fā)酵液，10，000r/min,離心IOmin后取上清。上清經(jīng)細(xì)菌濾器(0.22 μ m)過濾后待用。
[0058]向50°C WA培養(yǎng)基中加入灰葡萄孢菌GZ22的孢子，至孢子終濃度為IO5個(gè)/ml。將含灰葡萄孢菌GZ22孢子的WA培養(yǎng)基倒入9cm直徑的平板中，每平板倒入20mL。待冷卻凝固后，用7mm直徑的打孔器在平板的對稱位置打3個(gè)孔，每孔分別加入25 μ L制備的無菌上清，以培養(yǎng)液和環(huán)酰菌胺為對照組。25°C靜止培養(yǎng)后觀察拮抗圈大小(從孔中心算起)。
[0059](2)結(jié)果分析
[0060]生防菌BSlOl無菌上清能有有效抑制菌絲生長，抑制圈半徑為10.4mm，3倍濃縮無菌上清的抑菌圈半徑為12.5mm，見圖3。
[0061]3、生防菌BSlOl無菌上清抑制灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)活性測定
[0062]( I)試驗(yàn)方法
[0063]取實(shí)施例2的生防菌BSlOl菌株發(fā)酵液，10，000r/min,離心IOmin后取上清。上清經(jīng)細(xì)菌濾器(0.22 μ m)過濾后待用。
[0064]在上述無菌上清中加入果糖，使果糖終濃度至10mM，加入灰葡萄孢菌GZ22的孢子。對照組為含IOmM果糖的培養(yǎng)液。取置于果糖溶液中的孢子懸浮液10 μ I置于載玻片上，每處理5次重復(fù)。玻片置于保濕盒中，25°C靜止培養(yǎng)，每個(gè)I小時(shí)觀察各處理組孢子萌發(fā)情況，計(jì)算萌發(fā)率。
[0065](2)結(jié)果分析
[0066]生防菌BSlOl無菌上清能強(qiáng)烈抑制灰葡萄孢菌孢子的萌發(fā)，處理后的孢子不能形成芽管(圖4)。誘導(dǎo)萌發(fā)后，8、16、24小時(shí)分別統(tǒng)計(jì)各處理組的萌發(fā)率，結(jié)果顯示當(dāng)陰性對照組萌發(fā)率為100%時(shí)，BSlOl處理組孢子仍無萌發(fā)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。
[0067]表1各處理組灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)率[0068]
【權(quán)利要求】
1.生防菌株BSlOl在防治植物灰霉病中的應(yīng)用，其特征在于，所述的生防菌株BSlOl為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BS101，保藏編號為 CGMCC N0.7727。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的植物為蘋果。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述蘋果的品種為富士或嘎啦。
4.如權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用包括: (1)制備含所述生防菌株BSlOl的生防菌劑； (2)將所述的生防菌劑噴施在所述的植物上。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的生防菌劑中，所述生防菌株BSlOl的濃度為 IXlO8 ~ 1010CFU/mL。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述生防菌劑通過如下方法進(jìn)行制備:(1)將所述生防菌株BSlOl于培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD_為0.5~0.8，獲得種子液； (2)將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)，調(diào)節(jié)發(fā)酵液中生防菌株BSlOl的濃度至I X IO8~101QCFU/mL，獲得所述生防菌劑。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述種子液的接種量為I~2%。
8.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，以每升計(jì)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖，18~22g ;L-谷氨·酸，2.4~2.6g ；L-天門冬酰胺，2.4~2.6g ；KH2PO4,0.8~·1.2g ；MgS04.7Η20，0.4 ~0.6g ；KC1,0.4 ~0.6g ;酵母粉，0.8 ~1.2g ；L-苯丙氨酸，2 ~·3X l(T3g ；MnSO4.H2O, 5 ~6 X l(T3g ；CuSO4.5H20,0.16 ~0.18 X l(T3g ；FeS04.7H20,0.15 ~·0.17 X 10_3go
【文檔編號】C12R1/125GK103563995SQ201310494922
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月18日
【發(fā)明者】尹燕妮, 陳云, 馬忠華 申請人:浙江大學(xué)