一種防治核桃基腐病的生防菌劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生防治劑，特別涉及一種以拮抗核桃基腐病病原菌的枯草芽孢桿 菌為主要成分的生防治劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 核桃（Juglans regia L.)屬落葉喬木，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，具有豐富的營(yíng)養(yǎng) 價(jià)值和保健功能，可制取食用油和制作各種食品。核桃作為新疆的第二大果樹(shù)，栽培面積占 全疆林果總面積的四分之一，核桃產(chǎn)業(yè)已成為新疆農(nóng)民致富增收的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一。核 桃適生范圍廣，常被栽植于山區(qū)和田園，是重要的用材樹(shù)種和生態(tài)樹(shù)種。近幾年，隨著新疆 核桃種植面積逐漸擴(kuò)大，大面積種植單一品種、管理粗放以及栽培模式等原因，病蟲(chóng)害問(wèn)題 日益增多，核桃基腐?。≒ythium oligandrum Drechsler)的大面積嚴(yán)重發(fā)生制約了新疆核 桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，核桃基腐病與腐爛病有本質(zhì)的區(qū)別，核桃腐爛病主要危害支桿的皮層， 皮層上面產(chǎn)生小黑點(diǎn)。
[0003] 目前，防治核桃基腐病的方法主要以化學(xué)方法為主，通過(guò)大田試驗(yàn)篩選出了咪酰 胺等防效較好的藥劑。常規(guī)的化學(xué)藥劑在防治核桃基腐病方面，有經(jīng)濟(jì)、高效和方便等優(yōu) 勢(shì)，但其易環(huán)境污染，不利于打造生態(tài)健康果園。最近幾年通過(guò)生防菌株防治果樹(shù)病害已成 為一種重要的防治手段，目前應(yīng)用較多的拮抗細(xì)菌主要有芽孢桿菌Bacillus SUbtiliS、假 單胞桿菌Pseudomonas spp·、土壤放射桿菌Agrobacterium radiobacter等。然而通過(guò)詰 抗菌株防治核桃基腐病的研宄尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，篩選出抗菌譜廣、生防活性高及對(duì)環(huán)境安 全的新型拮抗細(xì)菌，制備成高效的生防菌劑，對(duì)該病害的防治具有重要意義。本申請(qǐng)從分離 核桃基腐病病原菌過(guò)程中得到的細(xì)菌與病原菌通過(guò)平板對(duì)峙培養(yǎng)法篩選出抑制效果較好 的生防細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行種類鑒定，將分離得到的生防細(xì)菌制備成生防菌株，實(shí)現(xiàn)菌株的應(yīng) 用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，提供一種防治核桃基腐病 的菌株。
[0005] 本發(fā)明進(jìn)一步提供利用上述菌株制備的生防菌劑。
[0006] 本發(fā)明進(jìn)一步提供上述生防菌劑的制備方法。
[0007] 本發(fā)明進(jìn)一步提供利用上述生防菌劑的防治方法。
[0008] 本發(fā)明人等從新疆和田地區(qū)墨玉縣采集得的核桃基腐病病害標(biāo)本中分離出一種 屬于枯草芽孢桿的菌株，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)植物生長(zhǎng)無(wú)不良影響，具有抑制核桃基腐病病原菌 的效果，并由此完成了本發(fā)明。
[0009] 本發(fā)明涉及以下的菌株和核桃基腐病生防菌劑、生防菌劑的制備方法以及利用生 防菌劑防治核桃基腐病的方法。
[0010] (1)枯草芽孢桿菌菌株GY-11。
[0011] (2)含有芽孢桿菌菌株GY-Il作為有效菌的核桃基腐病生防菌劑。
[0012] (3)使用上述（2)中記載的核桃基腐病生防劑進(jìn)行防治核桃基腐病的防治方法，。
[0013] [枯草芽孢桿菌菌株GY-11的分離與保藏]
[0014] 本發(fā)明的枯草芽孢桿菌菌株GY-Il是從新疆和田地區(qū)墨玉縣采集的核桃基腐病 病害標(biāo)本中分離出的菌株。
[0015] 具體的，本發(fā)明是通過(guò)以下步驟得到核桃基腐病拮抗菌菌株GY-Il的：
[0016] (1)拮抗菌株的分離：將核桃基腐病病害標(biāo)本材料的病健交界部位切成5mm的組 織塊，先用75%乙醇消毒該組織塊30s，立即取出，再置于1 %次氯酸鈉消毒90s，最后用無(wú) 菌水沖洗3次后利用滅菌濾紙將組織塊表面的水吸干，得到消毒后的組織塊。將消毒后的 組織塊在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C恒溫培養(yǎng)，每24h觀察一次，當(dāng)觀察到 組織塊周圍出現(xiàn)抑菌圈時(shí)，使用劃線法將抑菌圈的的細(xì)菌菌落純化在NA平板上，得到單菌 落，最后將得到的單菌落于4°C保存。
[0017] (2)拮抗菌株的篩選：將分離得到的單菌落進(jìn)行活化培養(yǎng)，在距離病原菌2. Ocm 處等距離地將所述單菌落劃線至已接種核桃基腐病病原菌的PDA平板上，以只接病原菌的 PDA平板培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。28°C恒溫培養(yǎng)，待對(duì)照的平板培養(yǎng)基的菌絲即 將長(zhǎng)滿時(shí)，測(cè)量細(xì)菌菌株與病原菌之間的抑菌帶寬度，得到對(duì)核桃基腐病病菌抑菌帶最寬 的拮抗菌株GY-Il。
[0018] 其中，所述PDA培養(yǎng)基的配方是去皮土豆200g，葡萄糖17g，瓊脂15g，蒸餾水 lOOOmL，pH 自然。
[0019] 其中，所述NA培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaC15g，瓊脂15g，蒸餾水 1000mL ? pH 7. 2〇
[0020] 該菌株根據(jù)其后所述的培養(yǎng)特征和生理生化特征，參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》 和《芽孢桿菌屬》的描述，結(jié)合分子生物學(xué)結(jié)果，確定拮抗菌株GY-11為枯草芽孢桿菌的新 菌株，于2015年5月14日作為"枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)GY_ll"保藏于中國(guó)微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（簡(jiǎn)稱CGMCC);保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西 路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所。
[0021] (a)形態(tài)學(xué)性質(zhì)
[0022] 形態(tài)：桿狀
[0023] 大?。?· 7 ~0· 8X2 ~3 μπι
[0024] 運(yùn)動(dòng)性：+
[0025] 鞭毛著生狀態(tài)：周生
[0026] 芽孢形態(tài)：橢圓
[0027] 芽抱大?。?· 6 ~0· 9 X I. 0 ~L 5 μ m
[0028] (b)培養(yǎng)性質(zhì)
[0029] 菌落形狀：圓形
[0030] 菌落顏色：乳白色
[0031] 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)：乳白色，白色邊緣不圓滑似圓形，表層不規(guī)則突起，褶皺明顯。
[0032] (c)生理學(xué)性質(zhì)
[0033] 革蘭氏染色：+
[0034] 接觸酶試驗(yàn)：+
[0035] VP 實(shí)驗(yàn)：+
[0036] 甲基紅試驗(yàn)：+
[0037] 淀粉水解：+
[0038] 檸檬酸的利用：+
[0039] 卵磷脂試驗(yàn)：_
[0040] 菌膜形成試驗(yàn)：+
[0041] 吲哚物質(zhì)的生成：_
[0042] 好氧兼性厭氧測(cè)定：_
[0043] 硫化氫的產(chǎn)生：_
[0044] 硝酸鹽的還原：-
[0045] 2% NaCl ：++
[0046] 5% NaCl ：++++
[0047] 7 % NaCl ：++++
[0048] 10% NaCl ：++
[0049] 需要說(shuō)明的是，" + "代表陽(yáng)性，代表陰性，"++"代表生長(zhǎng)一般，"++++"代表生 長(zhǎng)最適。
[0050] (d)分類學(xué)性質(zhì)
[0051] 菌株GY-11與枯草芽抱桿菌Bacillus subtilis的16SrDNA序列同源性為99%， 在GenBank注冊(cè)的序列號(hào)為KP876486。從基于鄰接法構(gòu)建的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（如圖 2所不）可以發(fā)現(xiàn)；菌株GY-Il與模式菌株枯草芽孢桿菌（KF496886)聚類在同一大分支內(nèi) (支持率99% )，并結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化特征，最終確定菌株GY-Il為枯草芽孢桿 菌 Bacillus subtilis。
[0052] [GY-11菌株的培養(yǎng)]
[0053] 有關(guān)本發(fā)明的GY-Il菌株的培養(yǎng)方法可以選擇任何適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。此 外，除液體培養(yǎng)基之外可以使用加入了瓊脂的斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基等固體培養(yǎng)基。通 過(guò)培養(yǎng)使GY-Il菌株增殖以獲得所需的菌體量。
[0054] 培養(yǎng)基中的碳源可以利用所述GY-Il菌株可以同化的所有物質(zhì)。具體地說(shuō)，除葡 萄糖、半乳糖、D-土塘、蔗糖、麥芽糖、麥芽提取物、淀粉水解物等糖之外，還有GY-Il可以利 用的各種合成或天然碳源，但是不包括乙酸。
[0055] 培養(yǎng)基中的氮源，同樣的，除含有有機(jī)氮的蛋白胨、酵母提取物、硫酸銨、谷氨酸、 酵母膏、磷酸二氫銨、硝酸鉀、氯化銨、硝酸鈣、天冬氨酸、亞硝酸鈉之外，還可以是GY-Il菌 株可以利用的各種合成或天然氮源，但是不包括尿素。
[0056] 根據(jù)常規(guī)的微生物培養(yǎng)方法，必要時(shí)可以相應(yīng)地添加 NaCl、磷酸鹽等無(wú)機(jī)鹽類、 鈣、鎂、鐵等金屬鹽，維生素、氨基酸等微量營(yíng)養(yǎng)源。
[0057] 培養(yǎng)可以在搖床培養(yǎng)、震蕩培養(yǎng)、通氣培養(yǎng)等好氧條件下進(jìn)行。培養(yǎng)溫度為20~ 40°C，優(yōu)選25~30°C，進(jìn)一步優(yōu)選為25°C ;pH5~9,優(yōu)選6~7,進(jìn)一步優(yōu)選為7 ;培養(yǎng)時(shí)間 24-48h，優(yōu)選24h為宜，其中，搖床培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為120-220r/min，優(yōu)選160-200r/min，進(jìn)一步 優(yōu)選為180r/min。
[0058] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的另一目的，本發(fā)明提供的一種防治核桃基腐病的生防菌劑是由保 藏號(hào)為CGMCC No. 10809的生防菌株GY-Il制備而成，其中，生防菌劑中的活菌總濃度為 1. 6Χ108-3· 8X1010CFU/mL〇
[0059] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明再一目的，本發(fā)明提供的生防菌劑的制備方法，是將菌種保藏號(hào)為 CGMCC No. 10809的生防菌株GY-Il在培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，經(jīng)離心處理后，將沉淀用滅菌水 稀釋成GY-Il活菌總濃度為I. 6X 108-3. 8X 101(lCFU/mL的菌劑。
[0060] 其中，所述培養(yǎng)基選擇NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基中的一種。
[0061] 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為NB培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基。
[0062] 其中，所述震蕩培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為20°C -40°C。
[0063] 優(yōu)選地，所述震蕩培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為25°C。
[0064] 其中，所述離心處理的轉(zhuǎn)速為120r/min_220r/min。
[0065] 優(yōu)選地，所述離心處理的轉(zhuǎn)速為180r/min。
[0066] 其中，所述培養(yǎng)基的起始pH值為5-9。
[0067] 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基的起始pH值為7。
[0068] 為實(shí)現(xiàn)發(fā)明的再一目的，本發(fā)明提供的利用生防菌劑防治核桃基腐病的方法是： 可以直接施用于核桃基腐病發(fā)病部位，也可以用水等稀釋后施用于核桃基腐病發(fā)病部位。
[0069] 本發(fā)明利用新疆和田地區(qū)墨玉縣采集得的核桃基腐病病害標(biāo)本中分離出一種枯 草芽孢桿菌株GY-Il對(duì)核桃基腐病病原菌具有高效的抑制作用，并且利用該菌株制備的生 防菌劑對(duì)核桃基腐病的防治有良好的