光技術和微流控芯片技術，而是通過液體密封設計、溝道設計，把檢測所需所有化學組分集成、內(nèi)置到微流控芯片中，并以磁鐵主動驅(qū)動，實現(xiàn)一鍵式的磁微?；瘜W發(fā)光免疫檢測，從而在便攜配套儀器中實現(xiàn)全血中分析物的快速、高靈敏度、準確定量檢測。
[0063]本發(fā)明的主要優(yōu)點如下:
[0064]1)本發(fā)明采用直接化學發(fā)光方法，具有背景低、靈敏度高、線性范圍寬的優(yōu)點。
[0065]2)本發(fā)明采用磁顆粒技術，具有磁富集功能，增強并放大信號；并能利用磁鐵把磁顆粒轉(zhuǎn)移區(qū)域(如由包被區(qū)-清洗區(qū)-檢測區(qū))，減少樣本基質(zhì)的影響。
[0066]3)本發(fā)明采用微流控芯片技術，把樣本混合、反應、分離和檢測集成在芯片上，并把反應所需的所有試劑組分集成到芯片上。
[0067]4)本發(fā)明操作簡便，檢測時，只需加入樣本，蓋上蓋子，把芯片放入小型便攜配套儀器中即可。
[0068]5)本發(fā)明配套儀器是小型便攜儀器，儀器只與芯片發(fā)生物理接觸，芯片內(nèi)液體不與儀器接觸，不會污染儀器而產(chǎn)生交叉干擾。
【附圖說明】
[0069]圖1為頂部磁鐵操控的微流控芯片雙層結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為頂板，2為底板，3為氣栗，4為加樣口，5為標記配體存儲池，6為過濾區(qū)，7為磁顆粒包被區(qū)，8為檢測區(qū)，9為清洗液存儲池，10為發(fā)光基底液存儲池，11為蓋子，12為樣本填充區(qū)，13為樣本混合區(qū)，14為清洗區(qū)，15為廢液池，16為液體釋放通道，17為發(fā)光基底液和清洗液存儲池讓位孔(于頂板)，18為磁鐵滑軌讓位孔。
[0070]圖2為頂部磁鐵操控的微流控芯片的完整微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為頂板，2為底板，19為雙面膠帶，20為單面膠帶，21為發(fā)光基底液和清洗液存儲池讓位孔(于雙面膠帶)，22為混合液流入過濾區(qū)時的讓位孔。
[0071]圖3為自帶氣栗的微流控芯片頂板結(jié)構(gòu)示意圖，其中23為密封膜。
[0072]圖4為雙發(fā)光基底液的微流控芯片底板結(jié)構(gòu)示意圖，其中24為發(fā)光基底液存儲池A，25為發(fā)光基底液存儲池B，26為發(fā)光液預混合通道。
[0073]圖5為底部磁鐵操控的微流控芯片雙層結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為頂板，2為底板，3為氣栗，4為加樣口，5為標記配體存儲池，6為過濾區(qū)，7為磁顆粒包被區(qū)，8為檢測區(qū)，9為清洗液存儲池，10為發(fā)光基底液存儲池，11為蓋子，12為樣本填充區(qū)，13為樣本混合區(qū)，14為清洗區(qū)，15為廢液池，16為液體釋放通道，27為磁鐵滑軌槽。
[0074]圖6為底部磁鐵操控的微流控芯片的完整微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為頂板，2為底板，19為雙面膠帶，20為單面膠帶，22為混合液流入過濾區(qū)時的讓位孔，28為磁鐵滑軌讓位孔，29為發(fā)光基底液和清洗液存儲池讓位孔(于單面膠帶)。
【具體實施方式】
[0075]本發(fā)明公開了一種磁微?；瘜W發(fā)光雙層微流控芯片，本領域技術人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。
[0076]為了使本領域的技術人員更好地理解本發(fā)明的技術方案，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0077]實施例1:雙抗體夾心測定超敏肌鈣蛋白I(cTnl)
[0078](一 )抗體標記
[0079]取5 μ g HRP溶解于lmL蒸餾水中，再加入0.2mL0.1M新配Na104溶液，室溫避光反應20min后，以ImM pH4.4醋酸鈉緩沖液透析純化溶液。再以0.2M pH9.5碳酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH至9.0，加入10 μ g抗cTnl單抗，室溫避光反應2h。加0.lmL新配的4mg/mL NaBH4液，混勻，于4°C反應2h。將上述溶液裝入透析袋，以0.15M pH7.4 PBS透析，4°C過夜，得到HRP標記cTnl抗體。
[0080]向lml 10mM pH7.4磷酸緩沖液中加入lmg磁顆粒(尺寸為2 μ m)、10 μ g EDC和15 μ g NHS溶液和15 μ g抗cTnl單抗(與HRP標記的抗體不同)溶液，混合均勻并于室溫下反應4h，加入lmg甘氨酸封閉。以磁鐵富集，去除未反應的抗cTnl單抗，得到磁顆粒標記cTnl抗體。
[0081](二)微流控芯片組裝
[0082]HRP標記cTnl抗體溶液中含0.1 %牛血清白蛋白、0.1 %吐溫20和0.01 %Proclin300的pH7.4磷酸緩沖液；磁顆粒標記cTnl抗體溶液為包含0.5%牛血清白蛋白、0.1%酪蛋白、0.2%吐溫20和0.01% Proclin300的pH7.4磷酸緩沖液。
[0083]清洗液為包含0.2% BSA、0.5%吐溫20和0.01% Proclin300的ρΗ7.4磷酸緩沖液。發(fā)光基底液分Α液和B液，A液為含魯米諾的酸性溶液，B液為含苯衍生物的堿性溶液。
[0084]將HRP標記抗體溶液放入頂板酶標配體存儲池(5)中，密封。將磁顆粒標記抗體溶液放入底板包被區(qū)(7)中，室溫干燥。將清洗液注入清洗液存儲池(9)中，將發(fā)光基底液的A液和B液分別注入發(fā)光基底液存儲池A (24)和發(fā)光基底液存儲池B (25)，密封。按圖1所示，將濾血膜粘入底板過濾區(qū)中，將存儲池內(nèi)置入底板。然后按圖2所示，以單面膠帶和雙面膠帶，將頂板和底板組裝成微流控芯片。裝入鋁箔袋中，密封4°保存。
[0085](三)樣本檢測
[0086]用正常人血楽作稀釋液，將cTnl標準品稀釋成如下濃度:0pg/ml、5pg/ml、50pg/ml、500pg/ml、lng/ml、10ng/ml 和 50ng/mlo
[0087]將50 μ 1樣本滴入加樣口后，蓋上蓋子。將微流控芯片放入配套儀器(磁鐵磁感應強度為6000高斯)中，儀器擠出HRP標記單抗，并使樣本和HRP標記單抗混合均勻后注入底板過濾區(qū)。樣本過濾后，到達微通道，并溶解磁顆粒標記單抗，磁鐵加速樣本反應，形成HRP標記單抗-cTnl抗原-磁顆粒標記單抗的三明治結(jié)構(gòu)，然后磁鐵收集磁顆粒。存儲池釋放清洗液，將磁顆粒清洗后，發(fā)光基底液釋放，儀器檢測系統(tǒng)檢測發(fā)光信號強度。總檢測時間15min。每個樣本分別用3個微流控芯片測定3次，取平均值，繪制標準曲線。
[0088]將50 μ 1全血樣本滴入加樣口，15分鐘內(nèi)儀器檢測系統(tǒng)檢測發(fā)光信號強度，依據(jù)標準曲線獲得樣本中cTnl濃度。
[0089]檢測原理為:當全血加入微流控芯片后，全血先與HRP標記抗體混合，然后經(jīng)過濾區(qū)后，混合了 HRP標記抗體的血漿到達微通道，血漿溶解磁標記抗體。當血樣中含有cTnl，則形成HRP標記抗體-cTnl-磁顆粒標記抗體的三明治結(jié)構(gòu)(雙抗體夾心法)。經(jīng)清洗后，再發(fā)光基底液作用下發(fā)光，儀器檢測系統(tǒng)測試發(fā)光信號。依據(jù)配套儀器獲取的標準曲線，進而分析血樣中cTnl濃度。樣本中cTnl含量越高，則發(fā)光信號越強。
[0090]結(jié)果表明，其最低檢測限為10pg/ml，最低定量限為50pg/ml，在定量檢測范圍內(nèi)，相關系數(shù)R2> 0.99，未出現(xiàn)Η00Κ效應，且批內(nèi)與批間重復性均較好，可為心梗心衰疾病診斷提供參考。
[0091]實施例2:競爭法測定他克莫司血藥濃度
[0092](一 )抗體/抗原標記
[0093]稱取ALP 0.lmg溶于0.lml 12.5%戊二醛的ρΗ6.8 0.1Μ PBS溶液中，室溫過夜。反應后的酶溶液經(jīng)SephadexG-25層析柱，用生理鹽水洗脫，收集棕色液。攪拌下將22.5 μ g抗他克莫司抗體逐滴加入酶溶液中，反應3h。加0.2M賴氨酸封閉，混勻后，置室溫2h。在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸錢，置4°C lh。3000rpm/min離心30min，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于0.15M PH7.4 PBS中。將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M pH7.4 PBS緩沖液透析，去除銨離子后，10000rpm/min離心除沉淀，上清液即為ALP標記抗他克莫司抗體。
[0094]向lml 10mM pH7.4磷酸緩沖液中加入lmg磁顆粒(尺寸為0.5 μπι)、10 μ g EDC和15 μ g NHS溶液和20 μ g鏈霉親和素，混合均勻并于室溫下反應4h，加入lmg甘氨酸封閉。以磁鐵吸附富集，去除未反應的鏈霉親和素，得到磁顆粒標記鏈霉親和素。
[0095]將10 μ g他克莫司抗原加入5 μ L 0.25mg/mL Sulfo-NHS-LC-b1tin溶液中，反應lh。以超濾離心管純化，去除未反應的生物素。得到生物素化的抗原。
[0096]通過親和素-生物素間的相互作用，把抗原連接到磁顆粒表面。其中親和素標記的磁顆粒和生物素化的抗體比例為1: 104。
[0097]( 二 )微流控芯片組裝
[0098]ALP標記抗他克莫司抗體溶液中含0.1%牛血清白蛋白、吐溫20和Proclin300的pH7.4 Tris-HCl緩沖液；磁顆粒標記配體溶液包含0.5%牛血清白蛋白、0.2%酪蛋白、0.1%吐溫 20 和 0.02% Proclin300 的 pH7.4 Tris-HCl 緩沖液。
[0099]清洗液為包含0.2%BSA、0.5% 吐溫 20、0.5% 曲拉通 Χ-100