發(fā)光微流控芯片是一種以直接化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)、在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)分析物快速、準(zhǔn)確、高靈敏檢測的新型芯片。
[0032]這種芯片是將分析物的配體(如抗原、抗體等)修飾發(fā)光劑，分析物的另一配體修飾在磁顆粒上，利用配體作用，如雙抗體夾心法原理結(jié)合磁顆粒富集、化學(xué)發(fā)光檢測全血樣本中是否含有分析物。
[0033]本發(fā)明微流控芯片用于定量全血樣本中的分析物。分析物包括藥物、毒品、抗原、抗體、激素、抗生素、細(xì)菌和病毒及其他生化標(biāo)志物。其中其他生化標(biāo)志物包括心血管標(biāo)志物、腫瘤標(biāo)志物和自身免疫性疾病標(biāo)志物。
[0034]本發(fā)明用于全血樣品檢測的磁微粒直接化學(xué)發(fā)光微流控芯片能夠解決現(xiàn)有化學(xué)發(fā)光技術(shù)中儀器昂貴、檢測時(shí)間長的不足和缺陷，可實(shí)現(xiàn)對微量樣本的檢測。由于化學(xué)發(fā)光靈敏度高，其靈敏度是熒光檢測方法的100倍以上。
[0035]本發(fā)明采用的標(biāo)記方法包含物理吸附、化學(xué)交聯(lián)或生物分子間特異性作用將分析物的配體連接到發(fā)光劑或磁顆粒表面，得到配體標(biāo)記的發(fā)光劑或配體標(biāo)記的磁顆粒，其中配體能與分析物特異性結(jié)合或競爭。
[0036]本發(fā)明中所述物理吸附主要為通過顆粒與配體的表面電荷差異，非特異性吸附到顆粒表面，形成配體與磁顆粒的復(fù)合物。
[0037]本發(fā)明中所述化學(xué)交聯(lián)為:當(dāng)磁顆?；虬l(fā)光劑表面有活性基團(tuán)，可與配體或質(zhì)控分子直接反應(yīng)時(shí)，不需用化學(xué)交聯(lián)劑，反之用化學(xué)交聯(lián)劑把配體修飾到磁顆粒表面或發(fā)光劑上。
[0038]在本發(fā)明的實(shí)施例中采用化學(xué)交聯(lián)法對磁顆粒進(jìn)行蛋白質(zhì)分子修飾的方法為:利用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺(EDC)/N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、戊二醛等交聯(lián)劑將磁顆粒表面的官能團(tuán)(如羧基、氨基)與蛋白質(zhì)分子(如抗原、抗體等)表面的官能團(tuán)(如氨基、羧基、醛基等)連接。
[0039]在本發(fā)明的實(shí)施例中采用化學(xué)交聯(lián)法對發(fā)光劑進(jìn)行蛋白質(zhì)分子修飾的方法為:利用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺(EDC)/N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、戊二醛等交聯(lián)劑將發(fā)光劑標(biāo)記到蛋白質(zhì)分子(如抗原、抗體等)上。
[0040]作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，采用EDC/NHS交聯(lián)法對磁顆粒進(jìn)行修飾，一般步驟為:將磁顆粒溶液與EDC和NHS混合，然后加入一定量的蛋白質(zhì)，以緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，培育4h，加入L-甘氨酸封閉，以色譜、層析柱或超濾離心等方式純化，從而得到蛋白質(zhì)修飾的磁顆粒。
[0041]本發(fā)明中所述生物分子間特異性作用包括生物素-親和素系統(tǒng)和抗原-抗體系統(tǒng)。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，采用生物素-親和素系統(tǒng)結(jié)合方式對分析物配體進(jìn)行磁顆粒修飾，該結(jié)合方式具有放大信號(hào)的作用，具體為:以EDC將鏈霉親和素連接到磁顆粒表面，生物素連接到蛋白質(zhì)分子表面，通過親和素-生物素間的相互作用，把蛋白質(zhì)分子連接到磁顆粒表面。
[0042]本發(fā)明的分析物配體包含抗原、半抗原、單克隆抗體、多克隆抗體和激素受體。該配體可與分析物結(jié)合(如雙抗體夾心法)或者與分析物競爭(如競爭法)。其中發(fā)光劑標(biāo)記的抗體與磁顆粒標(biāo)記的抗體可以相同，也可以不同。
[0043]作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，選擇兩種不同抗體，分別標(biāo)記發(fā)光劑和磁顆粒，以雙抗體夾心法檢測分析物。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，選擇一種抗原和一種抗體，分別標(biāo)記發(fā)光劑和磁顆粒，以競爭法檢測分析物。
[0044]本發(fā)明的標(biāo)記配體溶液包含緩沖液、蛋白質(zhì)、甘油、表面活性劑及防腐劑；磁顆粒標(biāo)記配體溶液包含緩沖液、蛋白質(zhì)、糖類、表面活性劑及防腐劑。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的實(shí)施例中，吖啶酯標(biāo)記抗體溶液為包含牛血清白蛋白、甘油、曲拉通X-100、吐溫20和Proclin300的pH7.4磷酸緩沖液；磁顆粒標(biāo)記抗體溶液為包含牛血清白蛋白、酪蛋白、吐溫20和Proclin300的pH7.4磷酸緩沖液。在另一個(gè)實(shí)施例中，吖啶酯標(biāo)記抗體溶液為包含牛血清白蛋白、甘油、曲拉通X-100和Proclin300的pH7.4 Tris-HCl緩沖液；磁顆粒標(biāo)記抗原溶液為包含牛血清白蛋白、酪蛋白、吐溫20和Proclin300的pH7.4 Tris-HCl緩沖液。
[0045]本發(fā)明的微流控芯片如圖2所示，芯片由頂部膠帶、芯片基板和底部膠帶構(gòu)成。成型材料為聚合物，包含但不限于聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、環(huán)氧樹脂等。如圖1所示，芯片基板包含過濾區(qū)(2)、包被區(qū)(3)、清洗區(qū)(4)、檢測區(qū)(5)、清洗液存儲(chǔ)池(7)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(8)和廢液池(11)組成，其中檢測區(qū)分別與清洗液存儲(chǔ)池和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池通過液體釋放通道(9)連接。
[0046]本發(fā)明的存儲(chǔ)池為液體密封池，所用密封材料包含玻璃、塑料、橡膠、鋁箔和高阻隔薄膜，其中密封材料可為同種材料組成，也可為多種材料組合而成。在物理擠壓下，存儲(chǔ)池可局部破裂，從而把密封的液體釋放出來。其中酶標(biāo)配體存儲(chǔ)池、清洗液存儲(chǔ)池、發(fā)光基底液存儲(chǔ)池可采用相同或不同材料和方法制作。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，酶標(biāo)配體存儲(chǔ)池、清洗液存儲(chǔ)池、發(fā)光基底液存儲(chǔ)池均采用塑料和彈性橡膠密封而成。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，酶標(biāo)配體存儲(chǔ)池采用塑料和彈性橡膠密封而成，而清洗液存儲(chǔ)池、發(fā)光基底液存儲(chǔ)池采用高阻隔薄膜密封而成。
[0047]本發(fā)明的過濾區(qū)包含濾血膜，其中濾血膜可通過物理孔徑或生物/化學(xué)試劑使液體與細(xì)胞分離，實(shí)現(xiàn)血漿與紅細(xì)胞分離，血漿流到磁顆粒包被區(qū)，而紅細(xì)胞停留在濾血膜上，從而減少紅細(xì)胞對試驗(yàn)結(jié)果的干擾。其中所述生物/化學(xué)試劑包含凝血?jiǎng)┑?，可使紅細(xì)胞間連接，形成凝塊，增大尺寸，更容易被濾血膜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)阻擋。
[0048]本發(fā)明的微流控芯片，可將磁顆粒標(biāo)記配體溶液和發(fā)光劑標(biāo)記配體溶液混合或先后加入芯片基板上的包被區(qū)(3)，干燥，如圖1所示；當(dāng)兩種溶液存在一定的干擾，或檢測效果不佳時(shí)，可分別加入磁顆粒包被區(qū)(14)和發(fā)光劑標(biāo)記配體包被區(qū)(15)。
[0049]本發(fā)明的微流控芯片，當(dāng)發(fā)光基底液由于不能混合并并長時(shí)間保存等原因，而需拆分為兩種溶液時(shí)，可分別注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A (16)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B (17)中，并在芯片上增加發(fā)光底物液和發(fā)光增強(qiáng)液預(yù)混合通道(18)，該預(yù)混合通道可由蛇形通道或上下結(jié)構(gòu)混合通道，如圖4所示。
[0050]本發(fā)明的清洗液，用于清洗磁顆粒，去除非特異性吸附的分析物、發(fā)光劑標(biāo)記物及其他影響檢測結(jié)果的物質(zhì)。清洗液主要包含緩沖體系、蛋白質(zhì)和表面活性劑，其中緩沖體系包含但不限于硼酸鹽、磷酸鹽、Tris-HCl和醋酸鹽等，清洗液pH 6.0?10.0。其中蛋白質(zhì)包含但不限于牛血清白蛋白、酪蛋白等。其中表面活性包含但不限于可包括吐溫20、吐溫80、曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮等。
[0051 ] 作為優(yōu)選，本發(fā)明實(shí)施例中，使用清洗液為包含牛血清白蛋白、吐溫20和Proclin300的ρΗ7.0磷酸緩沖液。
[0052]在一個(gè)實(shí)施例中，磁顆粒包被區(qū)包被了磁顆粒標(biāo)記抗體，發(fā)光劑標(biāo)記物包被區(qū)包被了吖啶酯標(biāo)記抗體，以雙抗體夾心法檢測降鈣素原(PCT)。另一個(gè)實(shí)施例中，磁顆粒包被區(qū)包被了磁顆粒標(biāo)記抗體，發(fā)光劑標(biāo)記物包被區(qū)包被了吖啶酯標(biāo)記抗原，以競爭法檢測他克莫司。
[0053]本發(fā)明的微流控芯片為快速檢測，檢測時(shí)間應(yīng)小于30分鐘，作為優(yōu)選，實(shí)施例中采用15分鐘。
[0054]本發(fā)明的配體儀器包含擠壓存儲(chǔ)池，磁鐵移動(dòng)，發(fā)光檢測系統(tǒng)等功能，應(yīng)可包含擠壓裝置、磁鐵及移動(dòng)裝置、檢測系統(tǒng)、控制分析模塊和軟件系統(tǒng)。
[0055]本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于病原體、重大疾病(如腫瘤、心血管疾病等)、違禁藥品、毒品檢測、食品安全等多種分析物的定量檢測。
[0056]本發(fā)明的核心是采用磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)在微流控芯片實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的快速、高靈敏度、準(zhǔn)確定量檢測。
[0057]微流控芯片技術(shù)是把生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動(dòng)完成分析全過程。
[0058]本發(fā)明的微流控芯片將檢測過程所需的所有試劑組分(酶標(biāo)配體、磁顆粒標(biāo)記配體、清洗液、發(fā)光基底液等)均集成、內(nèi)置到微流控芯片中，并通過巧妙溝道設(shè)計(jì)，在配套儀器的操作下，實(shí)現(xiàn)微流控芯片的一鍵式操作(只需按開始鍵就能實(shí)現(xiàn)檢測，無需復(fù)雜操作)，實(shí)現(xiàn)全血分離、免疫反應(yīng)、清洗分離、化學(xué)發(fā)光檢測，從而避免了現(xiàn)有微流控芯片中結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)簡單、檢測時(shí)操作復(fù)雜等不足和缺陷。還克服了傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光儀只能進(jìn)行血清或血漿檢測，而不能對全血樣本進(jìn)行檢測的缺點(diǎn)。
[0059]由于磁顆粒易沉淀，傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光儀采用手工混合，并以持續(xù)振蕩維持磁顆粒的懸浮狀態(tài)，但微流控芯片內(nèi)磁顆?；炀僮麟y以在小型便攜儀器中實(shí)現(xiàn)。
[0060]本發(fā)明將磁顆粒包被、干燥于微流控芯片溝道中，并設(shè)計(jì)了磁鐵主動(dòng)驅(qū)動(dòng)磁顆粒(而傳統(tǒng)微流控芯片一般采用流體驅(qū)動(dòng)或電驅(qū)動(dòng))，從而使磁顆粒復(fù)溶，并在微流控芯片不同區(qū)域?qū)崿F(xiàn)免疫反應(yīng)、清洗、發(fā)光。此設(shè)計(jì)不僅解決了磁顆粒應(yīng)用于微流控芯片時(shí)易沉淀、重復(fù)性差等問題，還實(shí)現(xiàn)了更可控的免疫反應(yīng)和物理清洗，提高了靈敏度和重復(fù)性。其中磁鐵磁性和磁顆粒尺寸對檢測效果了明顯影響，本發(fā)明選擇磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為500-30000高斯，優(yōu)選1000-8000高斯；磁顆粒尺寸為0.1-10 μ m，優(yōu)選0.5-3 μ m0
[0061]本發(fā)明中微流控芯片配套儀器與微流控芯片無液體接觸，無需要清洗的部件，避免了傳統(tǒng)大型化學(xué)發(fā)光儀需要攪拌或加樣、清洗等操作而產(chǎn)生的交叉干擾及污染。
[0062]所以本發(fā)明并非簡單疊加磁微?；瘜W(xué)發(fā)