層析介質(zhì)和方法
【專利說明】
[0001] 本申請為一項發(fā)明專利申請的分案申請，其母案的申請日為2011年7月27日、申 請?zhí)枮?01180037517. 2 (PCT/US2011/045519)、發(fā)明名稱為"層析介質(zhì)和方法"。
[0002] 本申請要求2010年7月30日提交的美國臨時申請序列號61/369, 331的優(yōu)先權(quán)， 在此將其公開內(nèi)容引入作為參考。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 在此公開的實施方案涉及適用于例如借助于離子交換層析純化生物分子的層析 介質(zhì)。
【背景技術(shù)】
[0004] 目前使用基于珠粒的層析樹脂實現(xiàn)各種治療生物分子，例如單克隆抗體的商業(yè)規(guī) 模純化。單克隆抗體作為治療和診斷試劑持續(xù)受到重視。為候選的mAB篩選雜交瘤庫的工 藝既耗時又是勞動密集的。一旦確定表達(dá)合適的mAB的雜交瘤細(xì)胞系，則必須研發(fā)純化方 法來產(chǎn)生足夠的mAB用于進(jìn)一步表征。傳統(tǒng)的純化方法包括使用蛋白A或蛋白G親合層析， 以及離子交換層析。純化的抗體被脫鹽并使用滲析交換進(jìn)入生物緩沖劑中。整個方法通常 需要若干天來完成，并且如果同時評價多個mAB，則可能特別煩瑣。
[0005] 層析樹脂目前制備有各種配體結(jié)構(gòu)，其能夠以親合、陽離子交換或陰離子交換方 式使珠粒起作用。這些樹脂顯示高孔隙率和大表面積，提供具有足以用于以生產(chǎn)規(guī)模（例 如10, 000升）成批處理生物分子的吸附容量的材料。層析樹脂通常呈現(xiàn)球形結(jié)構(gòu)，使得有 效的柱填充劑能夠具有最小流量不均勻性。珠粒之間的間隙空間為對流輸送通過層析柱提 供流道。這樣使層析柱能夠在高線速率和最小壓降下以大床深工作。這些因素的組合使層 析樹脂能夠呈現(xiàn)所需的效率、高滲透性和生物分子大規(guī)模純化所需的充足結(jié)合容量。在基 于珠粒的層析中，大部分可用的吸附表面積在珠粒內(nèi)部。因此，由于質(zhì)量輸送速率通常由孔 隙擴(kuò)散控制，所以分離過程固有地緩慢。為將這種擴(kuò)散阻力減到最小和附帶地使動態(tài)結(jié)合 容量最佳化，可以使用小直徑珠粒。但是，使用小直徑珠粒以柱壓降升高為代價。因此，制 備層析分離的優(yōu)化經(jīng)常涉及效率/動態(tài)容量（小珠粒有利）和柱壓降（大珠粒有利）之間 的折中。
[0006] 層析介質(zhì)通常具有很高的成本（> $1000/L)，以及大規(guī)模生產(chǎn)柱需要很大的數(shù) 量。因此，生物制藥生產(chǎn)商將層析樹脂循環(huán)使用數(shù)百次。這些再生循環(huán)每次消耗大量的介 質(zhì)，并且各個步驟產(chǎn)生與檢驗各個清潔、殺菌和柱填充劑操作有關(guān)的額外費用。
[0007] -些技術(shù)在專利文獻(xiàn)中描述，并且商業(yè)銷售這些技術(shù)來用于基于官能化纖維介質(zhì) 和/或復(fù)合材料的生物制藥分離。大多數(shù)依賴于將多孔凝膠插入纖維基質(zhì)，該凝膠提供所 需的表面積以獲得適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合容量。但是，在這種構(gòu)造中，凝膠位置和質(zhì)量中的差的均勻性 通常產(chǎn)生差的效率（淺表穿透（shallow breakthrough)和洗脫鋒面（elution fronts))。 另外，即使對于淺的床深度，流動阻力也可能較高，問題經(jīng)常由于適度壓力載荷下的凝膠壓 縮而加重。采用的另一種方法已經(jīng)在纖維基質(zhì)內(nèi)引入顆粒，該顆粒經(jīng)常是多孔的并且具有 天然的吸附性官能團(tuán)，其實例為活性碳和硅膠。
[0008] 理想的將是在不犧牲床滲透性和可達(dá)到的流速的基礎(chǔ)上，為生物分子層析應(yīng)用提 供具有側(cè)掛吸附性官能團(tuán)的高表面積纖維的組合。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 現(xiàn)有技術(shù)的缺陷已由在此公開的實施方案解決，所述實施方案涉及用于層析，特 別是離子交換層析的吸附性介質(zhì)。公開的層析介質(zhì)衍生自成型的纖維。在某些實施方案 中，成型的纖維呈現(xiàn)纖化或隆脊?fàn)罱Y(jié)構(gòu)。當(dāng)與普通的纖維相比時，這些隆脊可以極大地提高 纖維的表面積。因此，在不降低纖維直徑的基礎(chǔ)上獲得高表面積，纖維直徑降低通常導(dǎo)致床 滲透性顯著降低和相應(yīng)的流動速率減小。根據(jù)某些實施方案的高表面積纖維的實例為由 Allasso Industries，Inc. (Raleigh，NC)市售的"翼狀（winged)" 纖維。Allasso 翼狀纖 維的截面SEM圖像在圖Id中提供。這些纖維呈現(xiàn)大約14米V克的表面積。在此還公開了 一種添加表面?zhèn)葤旃倌軋F(tuán)的方法，例如為高表面積纖維提供陽離子交換或陰離子交換官能 團(tuán)。這種側(cè)掛官能團(tuán)可用于生物分子例如單克隆抗體（mAb)的離子交換層析純化。
[0010] 在此公開的實施方案還涉及用包括高表面積官能化纖維的離析、純化或分離生物 分子的方法。這些方法可以以流過方式或結(jié)合/洗脫方式進(jìn)行。例如，在mAb純化中，通常 實施陽離子交換層析，其中在低于抗體蛋白質(zhì)的等電位點的PH下和少量降低的溶液傳導(dǎo) 率下工作，抗體蛋白質(zhì)將通過離子交換配體以離子鍵方式結(jié)合至載體，同時未結(jié)合的污染 物（宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸等）自由地通過層析床。在用足以屏蔽珠粒樹脂和蛋白之間的 離子相互作用的高導(dǎo)電性緩沖劑剝離結(jié)合的mAb產(chǎn)物之前，通過用適當(dāng)?shù)木彌_劑溶液吹洗 填充的珠粒床進(jìn)一步清除這些污染物。相反，經(jīng)常在單克隆抗體制造下游使用陰離子交換 層析，以進(jìn)一步清除殘余的細(xì)胞培養(yǎng)污染物，其中該操作在使得mAb蛋白將不與珠粒樹脂 的陽離子表面結(jié)合，而是代之以自由通過層析柱的PH和傳導(dǎo)率的溶液條件下進(jìn)行。另一 方面，帶有純負(fù)電荷的蛋白質(zhì)和核酸將有效地與陰離子交換樹脂結(jié)合并由此被從產(chǎn)物中清 除。
[0011] 根據(jù)某些實施方案，在此公開的介質(zhì)具有高床滲透性（例如500-900 mDarcy)，相 對于基于珠粒的層析介質(zhì)的低材料成本，20-60 mg/mL IgG動態(tài)結(jié)合，高分離效率（例如 HETP <0.1 cm)，50-160 mg/g IgG靜態(tài)結(jié)合容量，和快速的吸附物至配體結(jié)合位置的對流 支配的輸送。
[0012] 根據(jù)某些實施方案，使用獨特的高表面積，當(dāng)配置為長度在2-6 _之間的隨機(jī)取 向的短切纖維的填充床時，擠出的纖維（例如熱塑性纖維）允許高流動滲透性（液體）和 均勻流動分布。提供使這種纖維表面官能化的化學(xué)處理方法，以使生物分子和生物分離能 夠基于吸附性相互作用?；瘜W(xué)處理方法可以基于離子、親合性、疏水性等相互作用或相互作 用組合來賦予這種纖維各種表面化學(xué)官能團(tuán)（functionalities)。纖維制造和簡單的表面 化學(xué)處理法的組合經(jīng)濟(jì)性產(chǎn)生用于生物制藥和疫苗制造中的純化操作的經(jīng)濟(jì)的和容易擴(kuò) 展的技術(shù)。
[0013] 根據(jù)某些實施方案，提供吸附分離材料，以允許快速的處理速率，因為溶質(zhì)往返于 纖維表面的質(zhì)量輸送基本上由通過介質(zhì)的流體對流來控制，這與基于珠粒的介質(zhì)相反，其 中擴(kuò)散輸送要求更長的接觸時間和因此更慢的處理速率。提供了捕獲或清除大生物物質(zhì)， 例如病毒的能力，由于珠?？紫兜目臻g限制，所述大生物物質(zhì)不能使用常規(guī)的基于珠粒的 介質(zhì)來有效分離。
[0014] 附圖簡沐 圖Ia為根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的纖維的示意性視圖； 圖Ib為根據(jù)某些實施方案的可以使用的隆脊?fàn)罾w維的示意性視圖； 圖Ic為根據(jù)某些實施方案的具有連接側(cè)基的圖Ib纖維的示意性視圖； 圖Id為根據(jù)某些實施方案的可以使用的隆脊?fàn)罾w維的SEM圖像； 圖Ie為根據(jù)某些實施方案的纖維的官能化的示意性視圖； 圖If為根據(jù)某些實施方案的纖維的官能化的另一個示意性視圖； 圖2為根據(jù)某些實施方案的SP-官能化介質(zhì)的IgG穿透曲線和洗脫峰； 圖3為根據(jù)某些實施方案的改變速率下的SP-官能化介質(zhì)的IgG穿透曲線的圖示； 圖4為根據(jù)某些實施方案的改變線速率下的IgG動態(tài)結(jié)合容量的圖示； 圖5為根據(jù)某些實施方案的mAb激發(fā)測試的層析譜； 圖6為根據(jù)某些實施方案的官能化介質(zhì)