專利名稱：一種金屬螯合親和介質(zhì)及其層析純化玉米sod的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶的分離純化方法，特別是一種金屬螯合親和層析純化玉米SOD方法。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)清除超氧陰離子自由基的唯一的酶，是一種很有前途的藥用酶。玉米中SOD的含量十分豐富，是世界三大作物之一，以玉米為生產(chǎn)原料，運(yùn)用生物工程技術(shù)制備SOD制劑，可使這一農(nóng)作物的附加值提高20倍以上，經(jīng)濟(jì)與社會效益十分可觀。目前，玉米SOD復(fù)合酶的規(guī)?；a(chǎn)工藝已較為成熟，但其純化問題尚未解決，成為限制其作為藥用酶的障礙。藥用蛋白質(zhì)的分離純化一般采用層析方法進(jìn)行。凝膠過濾是基于分子量大小的分離純化方法，該法具有設(shè)備簡單、操作方便、重復(fù)性好和樣品回收率高等特點(diǎn)。缺點(diǎn)是分辨率低、分離效果較差。在SOD分離純化方面，凝膠過濾主要作為初步分離方法而與其它色譜方法同時應(yīng)用。離子交換層析一般用于分離各種可解離的物質(zhì)。離子交換層析被廣泛的用于SOD的分離與純化。但利用該法純化SOD的純化倍數(shù)通常為50左右，回收率較低。
金屬螯合親和層析是最近二十幾年發(fā)展起來的一種新的分離技術(shù)，它利金屬離子與某些含有巰基或咪唑基的氨基酸配位的特性選擇性地分離對金屬離子有親和作用的蛋白質(zhì)。這種層析方法具有一定的專一性。該法具有設(shè)備簡單、吸附量大、分離條件溫和、通用性強(qiáng)和具有相對專一性等特點(diǎn)。一般而言，其專一性高于離子交換層析。金屬螯和親和層析用于SOD的分離與純化方面已有報(bào)道，其中納米爾等的的研究表明，利用金屬螯合親和層析與凝膠過濾和離子交換結(jié)合的方法，能夠?qū)⒆喜葜械腟OD純化300倍。國內(nèi)外尚未有利用金屬螯合親和層析純化玉米SOD的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效快速的玉米SOD的純化方法，利用金屬離子與某些含有巰基或咪唑基的氨基酸配位的特性選擇性地分離對金屬離子有親和作用的超氧化物歧化酶，專一性強(qiáng)，純化工藝簡單，非常適合制備藥用玉米SOD。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的1、本發(fā)明提供的一種金屬螯合親和介質(zhì)，其特征是親和介質(zhì)組分及重量比例如下金屬螯合親和層析介質(zhì)(MCAC)5、硫酸銅0.2、磷酸鈉2、氯化鈉5.5、水85。
2、本發(fā)明提供的利用上述親和介質(zhì)層析純化玉米SOD的方法，其特征是A.取玉米籽粒用自來水洗凈后于28℃-30℃溫度培養(yǎng)箱中浸泡24小時、發(fā)芽24小時，用蒸餾水清洗干凈，加入0.05mol/L磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀提取緩沖液，用膠體磨充分研磨，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心得SOD粗酶液；SOD粗酶液用硫酸銨鹽析后再透析，將透析液8000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，留取上清液，即為酶的濃縮液；B.將金屬螯合親和層析介質(zhì)(Chealating Sepharose Fast Flow，MCAC)采用自然沉降法裝柱，再用0.1摩爾濃度的硫酸銅溶液進(jìn)行螯合。金屬離子與金屬螯合親和層析介質(zhì)充分結(jié)合后用蒸餾水洗去未結(jié)合的金屬離子，然后用pH6.8的磷酸鈉(內(nèi)含0.5mol/氯化鈉)緩沖液洗脫至平衡；C、玉米SOD粗酶液上樣、洗脫，收集活性組分即為純化的玉米SOD。
本發(fā)明工藝過程如下玉米籽?！?、發(fā)芽→勻漿→離心→鹽析→透析→親和層析→洗脫→收集酶液本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)1.設(shè)備簡單、吸附量大、分離條件溫和，可在常溫下進(jìn)行。
2.通用性強(qiáng)，可用于其它來源SOD的分離純化。
3.本發(fā)明提供的層析方法具有一定的專一性?？珊喕傅鞍准兓に?，使藥用SOD成本降低30％，使玉米這一農(nóng)副產(chǎn)品附加值可提高20倍。
4.本發(fā)明所采用工藝制備玉米SOD，活性強(qiáng)、回收率及純化倍數(shù)均較高，分別為29.4％和307倍。
5.高效、快速，適合于大規(guī)模、工業(yè)化生產(chǎn)。
6.制備得到的玉米SOD純度好、耐熱性強(qiáng)、pH適應(yīng)范圍較廣，適合醫(yī)藥工業(yè)應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
取玉米籽粒500公斤，用自來水洗凈后于28℃-30℃恒溫培養(yǎng)箱中浸泡24小時、發(fā)芽24小時，用蒸餾水清洗干凈，加入1000升、0.05摩爾濃度的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀提取緩沖液，用膠體磨充分研磨，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心，上清液即為酶的粗提液。將SOD粗酶液先用40％的硫酸銨飽和0.5小時，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心后，用90％的硫酸銨飽和2小時，8000轉(zhuǎn)/分鐘再離心20分鐘，將沉淀重溶，以蒸餾水透析12小時。將透析液8000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，留取上清液，即為SOD濃縮液。
將金屬螯合親和層析介質(zhì)(Chealating Sepharose Fast Flow，MCAC)20克溶漲，采用自然沉降法裝柱，再用245毫升、0.1摩爾濃度的硫酸銅溶液進(jìn)行螯合。金屬離子與金屬螯合親和層析介質(zhì)充分結(jié)合后用340毫升水洗去未結(jié)合的金屬離子，然后用500毫升、0.1摩爾濃度pH6.8的磷酸鈉(內(nèi)含0.5摩爾濃度氯化鈉)緩沖液洗脫至平衡。
將玉米SOD粗酶液上樣、洗脫，收集活性組分即為純化的玉米SOD。
工藝實(shí)施結(jié)果本發(fā)明純化玉米SOD，純化倍數(shù)307倍，回收率為29.4％，可達(dá)到電泳純。玉米SOD在pH7-9、80℃以下范圍內(nèi)穩(wěn)定，最適溫度為40℃、最適pH為8，適合醫(yī)藥工業(yè)應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種金屬螯合親和介質(zhì)，其特征是親和介質(zhì)組分及重量比例如下金屬螯合親和層析介質(zhì)5、硫酸銅0.2、磷酸鈉2、氯化鈉5.5、水85。
2.一種采用如權(quán)利要求1所述的金屬螯合親和介質(zhì)層析純化玉米SOD的方法，其特征在于A.取玉米籽粒用自來水洗凈后于28℃-30℃溫度培養(yǎng)箱中浸泡24小時、發(fā)芽24小時，用蒸餾水清洗干凈，加入0.05mol/L磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀提取緩沖液，用膠體磨充分研磨，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心得SOD粗酶液；SOD粗酶液用硫酸銨鹽析后再透析，將透析液8000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，留取上清液，即為酶的濃縮液；B.將金屬螯合親和層析介質(zhì)采用自然沉降法裝柱，再用0.1摩爾濃度的硫酸銅溶液進(jìn)行螯合。金屬離子與金屬螯合親和層析介質(zhì)充分結(jié)合后用蒸餾水洗去未結(jié)合的金屬離子，然后用pH6.8的磷酸鈉(內(nèi)含0.5mol/氯化鈉)緩沖液洗脫至平衡；C、玉米SOD粗酶液上樣、洗脫，收集活性組分即為純化的玉米SOD。
全文摘要
一種金屬螯合親和介質(zhì)及其層析純化玉米SOD的方法，其特征是親和介質(zhì)組分及重量比例如下金屬螯合親和層析介質(zhì)(MCAC)5、硫酸銅0.2、磷酸鈉2、氯化鈉5.5、水85，在一定條件下，經(jīng)離心、鹽析、透析、層析、洗脫等工藝步驟，使玉米SOD經(jīng)初分離后經(jīng)一步純化即可達(dá)到電泳純。本發(fā)明具有吸附量大、分離條件溫和、通用性強(qiáng)，且具專一性?？珊喕傅鞍准兓に?，使藥用酶成本降低可達(dá)30％。采用本發(fā)明工藝制備的玉米SOD組分單一、回收率及純化倍數(shù)均較高，分別為29.4％和307倍。是一種高效、快速的純化方法，適合于大規(guī)模、工業(yè)化生產(chǎn)。得到的玉米SOD耐熱性強(qiáng)、pH適應(yīng)范圍較廣，適合醫(yī)藥工業(yè)應(yīng)用。
文檔編號C12N9/08GK1793345SQ20051004786
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月29日
發(fā)明者陳紅漫, 樊金娟, 馬鏑, 陶思源, 陳鵬 申請人:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)