專利名稱：一種玉米sod的分子修飾劑及修飾方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種酶的分子修飾方法。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(SOD)能夠清除人體內(nèi)超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞膜、DNA等結(jié)構(gòu)，因而超氧化物歧化酶的研究受到廣泛的重視。上世紀(jì)50年代初，美國等國家的皮膚學(xué)科不斷發(fā)展，SOD化妝品就是在這一基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。目前由于其較好抗輻射作用，在國際上非常流行。SOD化妝品的防曬作用是Cu.Zn-SOD對波長258-268nm的紫外線有一定的吸收作用。Mn-SOD和Fe-SOD對波長為280nm的紫外線有較強的吸收作用，從而阻止了紫外線對人的損傷。在國外，SOD作為藥用酶已經(jīng)用于腦外傷的III期治療，而國內(nèi)藥用SOD處于待批生產(chǎn)階段。目前SOD的生產(chǎn)原料主要是動物血液和植物。由于血液制品易于帶入污染源，在一定程度上限制了其使用，植物材料克服了上述缺陷而受到人們的青睞。玉米中SOD的含量十分豐富，而且以玉米為原料生產(chǎn)SOD可以成倍提高農(nóng)產(chǎn)品的附加值。
玉米SOD在應(yīng)用時其穩(wěn)定性、半衰期常常成為限制其應(yīng)用的障礙。近年來研究發(fā)現(xiàn)，由于SOD分子表面外形的不規(guī)則、各原子間極性和電荷的不同、各氨基酸殘基間相互作用等結(jié)果，使酶分子結(jié)構(gòu)的局部形成一種微環(huán)境，為其發(fā)揮作用提供了合適的條件。酶經(jīng)過化學(xué)修飾后，除了能減少由于內(nèi)部平衡里被破壞而引起的酶分子伸展打開外，還由于大分子修飾劑本身就是多聚電荷體，所以有可能在酶分子表面形成一層“緩沖外殼”，在一定程度下抵御外界環(huán)境的電荷、極性變化，維持酶活性部位為環(huán)境的相對穩(wěn)定，是酶能在更廣泛的條件下發(fā)揮作用。
酶的分子修飾劑由大分子與小分子兩種，但修飾結(jié)果有所不同。小分子修飾劑在降低抗原性和保持修飾酶活力方面遠(yuǎn)不如大分子修飾劑，其原因可能是抗原決定簇有關(guān)的氨基雖然被修飾，但由于修飾劑分子小，遮蓋作用差，抗原決定簇未被有效的破壞酶的大分子修飾通常采用的可溶性大分子有聚乙二醇(PEG)，聚丙烯酸、聚氨基酸、環(huán)湖精、葡聚糖、羧甲基纖維素、肝素等。其中相對分子量在500-20000μ范圍內(nèi)的PEG類修飾劑應(yīng)用最廣，它是既能溶于水，又可以溶于絕大多數(shù)有機溶劑的兩親分子，它一般沒有免疫源性和毒性，其生物相容性已通過美國FDA認(rèn)證。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種玉米SOD的分子修飾方法，采用既具有水溶性又具脂溶性的來兩親性高分子材料聚乙二醇(PEG)為主要修飾劑，以氰脲酰氯為活化劑，修飾玉米SOD，具有制備工藝簡單，同時提高穩(wěn)定性，體內(nèi)半衰期延長，免疫源性和毒性降低或消除，提高膜的滲透性，改善在體內(nèi)的生物分布與代謝行為，增加在有機溶劑中的溶解度和耐有機溶劑變性的能力。
本發(fā)明提供的玉米SOD的分子修飾劑，其特征是修飾劑制備成分的重量比例如下
聚乙二醇 8無水硫酸鈉1氰脲酰氯 1.1無水苯6.6本發(fā)明提供的玉米SOD的分子修飾(酶的制備)方法，其特征是1.修飾劑活化將重量份數(shù)比例為8∶1∶1.1的聚乙二醇、無水硫酸鈉及氰脲酰氯的混合物加入到重量份數(shù)比例為6.6的無水苯中，常溫下攪拌12小時，過濾，用乙醚沉淀出產(chǎn)物，上述混合液與乙醚的重量比例為1∶6.6，再將沉淀產(chǎn)物用苯溶解沉淀，兩者比例1∶1，至紫外檢測無氰脲酰氯吸收，真空干燥，得白色固態(tài)粉末，即活化聚乙二醇。
2.將重量比例為1∶5的SOD凍干粉和活化后聚乙二醇溶解于pH9.2、0.1摩爾濃度、重量比例為1的四硼酸鈉溶液中反應(yīng)1小時，產(chǎn)物用pH7.3、0.01摩爾濃度的磷酸緩沖液透析濃縮，立即上預(yù)先平衡好的葡聚糖(SephadexG-100)層析柱洗脫分離，靈敏度0.5，流速0.5毫升/分鐘，收集第一峰，冷凍干燥得白色固態(tài)粉末狀的修飾酶PEG-SOD。
本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點1PEG-SOD溫度穩(wěn)定性在高溫條件下，PEG-SOD的相對酶活力始終高于天然SOD，尤其是在較長時間的情況下，PEG-SOD的相對酶活力顯著高于天然SOD。這是由于PEG共價結(jié)合于SOD分子表面后有效的保護(hù)了SOD的次級鍵。
2.在測試的酸性范圍內(nèi)，隨著時間的延長，PEG-SOD與天然SOD的相對酶活力逐漸降低，在pH＜6的條件下，PEG-SOD的相對酶活力顯著高于天然SOD.這是由于天然SOD在較低的pH下構(gòu)象變化，引起起催化作用的Cu離子脫離，從而造成酶活力顯著下降。而PEG-SOD能夠穩(wěn)定其構(gòu)象，增強SOD穩(wěn)定性。
3.PEG-SOD堿性條件下穩(wěn)定性在堿性條件下，隨著pH的上升，PEG-SOD與天然SOD的相對酶活力均有所降低。PEG-SOD的相對酶活力始終高于天然SOD.在pH為13時，120分鐘后天然SOD酶活力保存43.9％，PEG-SOD保存63.5％。表明PEG-SOD堿性條件下的穩(wěn)定性增強。
4.玉米SOD經(jīng)過PEG修飾后，有效的增強胰蛋白酶酶切耐受性。這是因為PEG結(jié)合并覆蓋于SOD分子表面，阻止了胰蛋白酶靠近并保護(hù)了胰蛋白酶酶切位點。
具體實施例方式
1、修飾劑制備成分的重量比例如下聚乙二醇8無水硫酸鈉 1氰脲酰氯1.1無水苯 6.62、玉米SOD的分子修飾(酶的制備)方法A、修飾劑的活化將24g聚乙二醇-6000(分子量為60000)，無水硫酸鈉3.0g和氰脲酰氯3.3g混合加入到無水苯20g中，常溫下攪拌12小時，過濾。用332g乙醚沉淀出產(chǎn)物，再用50.3g苯溶解沉淀。如此沉淀、溶解反復(fù)多次，直至紫外檢測無氰脲酰氯吸收。真空干燥，得白色固態(tài)粉末，即活化聚乙二醇-6000，置于冰箱中密封保存。
B、活化聚乙二醇-6000修飾SOD將玉米SOD凍干粉30mg和150mg活化后的聚乙二醇-6000溶解于pH9.2、0.1摩爾濃度的四硼酸鈉溶液中反應(yīng)1小時，產(chǎn)物用pH7.3、0.01摩爾濃度的磷酸緩沖液透析濃縮，立即上預(yù)先平衡好的葡聚糖(SephadexG-100)層析柱洗脫分離，靈敏度0.5，流速0.5毫升/分鐘，收集第一峰，冷凍干燥得白色固態(tài)粉末狀的修飾酶PEG-SOD。
C、修飾率的測定取1毫升含0.2mg聚乙二醇-SOD的溶液，加入1毫升、pH8.5的4％的碳酸氫鈉溶液，1毫升、10％十二烷基磺酸鈉溶液，20分鐘后加入1毫升、0.1％TNBT(氯化硝基四氮銼藍(lán))溶液，40℃保溫2小時，用0.5毫升、1摩爾濃度的鹽酸終止反應(yīng)。325nm下讀出吸收值。同樣濃度的PEG-SOD溶液在反應(yīng)前后光吸收值之比即為修飾率。
權(quán)利要求
1.一種玉米SOD的分子修飾劑，其特征是修飾劑制備成分的重量比例如下聚乙二醇 8無水硫酸鈉 1氰脲酰氯 1.1無水苯 6.6。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子修飾劑，其特征是聚乙二醇的分子量為6000。
3.一種采用如權(quán)利要求1所述的分子修飾劑修飾玉米SOD的方法，其特征是A.修飾劑活化將重量份數(shù)比例為8∶1∶1.1的聚乙二醇、無水硫酸鈉及氰脲酰氯的混合物加入到重量份數(shù)比例為6.6的無水苯中，常溫下攪拌12小時，過濾，用乙醚沉淀出產(chǎn)物，上述混合液與乙醚的重量比例為1∶6.6，再將沉淀產(chǎn)物用苯溶解沉淀，兩者比例1∶1，至紫外檢測無氰脲酰氯吸收，真空干燥，得白色固態(tài)粉末，即活化聚乙二醇；B.將重量比例為1∶5的SOD凍干粉和活化后聚乙二醇溶解于pH9.2、0.1摩爾濃度、重量比例為1的四硼酸鈉溶液中反應(yīng)1小時，產(chǎn)物用pH7.3、0.01摩爾濃度的磷酸緩沖液透析濃縮，立即上預(yù)先平衡好的葡聚糖層析柱洗脫分離，靈敏度0.5，流速0.5毫升/分鐘，收集第一峰，冷凍干燥得白色固態(tài)粉末狀的修飾酶PEG-SOD。
全文摘要
一種玉米SOD的分子修飾方法，其特征是修飾劑成分及重量比例是聚乙二醇8、無水硫酸鈉1、氰脲酰氯1、無水苯6.6，在特定工藝條件下，采用既具有水溶性又具脂溶性的來兩親性高分子材料聚乙二醇(PEG)為主要修飾劑，以氰脲酰氯為活化劑，修飾玉米SOD，具有制備工藝簡單，同時提高穩(wěn)定性，體內(nèi)半衰期延長，免疫源性和毒性降低或消除，提高膜的滲透性，改善在體內(nèi)的生物分布與代謝行為，增加在有機溶劑中的溶解度和耐有機溶劑變性的能力，使玉米SOD可廣泛應(yīng)用于食品，輕工及醫(yī)藥行業(yè)。
文檔編號C12N9/96GK1793346SQ20051004786
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月29日
發(fā)明者樊金娟, 陳紅漫, 闞國仕, 阮燕曄, 崔振海 申請人:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)