用于執(zhí)行熱熔分析和擴增的裝置、系統(tǒng)和方法
【專利說明】用于執(zhí)行熱熔分析和擴增的裝置、系統(tǒng)和方法
【背景技術】
[0001] 1.摶術領域
[0002] 本發(fā)明涉及用于在多個反應容器的每一個中執(zhí)行多重熱熔分析程序的系統(tǒng)和方 法。
[0003] 2.背景摶術
[0004] 本文描述或涉及的任何參考文獻均不認為是相對受權利要求書保護的本發(fā)明的 現(xiàn)有技術。
[0005] 診斷分析廣泛用于臨床診斷和健康科學研究，以檢測生物體或生物樣品中的生物 抗原、細胞或遺傳異常、疾病狀態(tài)以及疾病相關病原體或基因突變的存在或對它們的量進 行定量。在診斷分析允許定量時，專業(yè)人員能夠更好地計算感染或疾病的程度，并確定疾病 隨時間推移的狀態(tài)。診斷分析在很多情況下集中于檢測所關注的化學物質、蛋白質或多糖 抗原、核酸、生物聚合物、細胞或組織。可以采用多種分析檢測這些診斷指標。
[0006] 具體地講，基于核酸的分析通常包括用于對樣品中一個或多個靶標核酸序列進 行檢測或量化的多個步驟。靶標核酸序列通常對細胞、組織、生物體或病毒的可識別群組 具有特異性，其中所述群組由至少一個核酸共有序列限定，該序列為群組成員所共有，并且 針對待分析樣品中的該群組具有特異性。多種基于核酸的檢測方法在Kohne的美國專利 No. 4, 851，330和Hogan的美國專利No. 5, 541，308進行了充分描述，這些專利中每一個的公 開內容據(jù)此以引用方式并入。
[0007] 例如，部分通過使樣品暴露于探針來執(zhí)行基于核酸的分析，該探針被配置以在特 定雜交條件下對屬于所關注的蛋白質、細胞、組織、生物體或病毒的核酸序列表現(xiàn)出特異 性。通常對樣品進行一定程度的處理，從而以使其適于雜交的方式提取核酸。
[0008] 在將靶標核酸暴露于探針之前或之后，可通過靶標捕獲方法，使用鍵合到諸如磁 珠的基底上的"捕獲探針"直接地或間接地固定靶標核酸。靶標捕獲探針通常為能夠與包 含靶標序列的核酸序列雜交的較短核酸序列（即寡核苷酸）。當磁珠包括捕獲探針時，使用 靠近反應器皿的磁體將磁珠吸引到并保持在器皿的側面。一旦靶標核酸因此固定，可通過 例如從反應器皿抽吸流體并任選地執(zhí)行一個或多個洗滌步驟，使雜交核酸與樣品中存在的 非雜交核酸分離。
[0009] 在大多數(shù)情況下，希望使用本領域所熟知的若干核酸擴增程序中的任一 種擴增靶標序列。核酸擴增的方法在文獻中進行了詳盡描述。PCR擴增例如在 Mullis 等人的美國專利 No. 4, 683, 195、4, 683, 202 和 4, 800, 159 以及 Methods in Enzymology, 155:335_35〇(1987)(《酶學方法》，第 I55 卷，第 335_35〇 頁，1987 年）中 有所描述，這些文獻中每一個的公開內容據(jù)此以引用方式并入。SDA的例子可見于 Walker, PCR Methods and Applications, 3:25-30(1993) (Walker，《PCR 方法和應用》，第 3 卷，第 25-30 頁，1993 年）、Walker et al. in Nucleic Acids Res. ,20:1691-1996(1992) (Walker等人，《核酸研究》，第20卷，第1691-1996頁，1992年）以及Proc. Natl. Acad. Sci. ,89:392-396(1991)(《美國科學院院報》，第 89 卷，第 392-396 頁，1991 年）。LCR 在美國專利No. 5, 427, 930和5, 686, 272中有所描述，這些專利中每一個的公開內容據(jù) 此以引用方式并入。轉錄相關擴增（"TAA"）形式的例子在例如Burg等人的美國專利 No. 5, 437, 990、Kacian 等人的美國專利 No. 5, 399, 491 和 5, 554, 516、以及 Gingeras 等人 的國際申請此.？(：17^587/01966(出版為國際公布此.10 88/01302)和國際申請此.？(：1'/ US88/02108(出版為國際公布No. WO 88/10315)中有所提供，這些專利中每一個的公開內 容據(jù)此以引用方式并入。
[0010] 靶標核酸序列的檢測通常需要使用具有與靶標序列或其擴增子的至少一部分基 本上互補的核苷酸堿基序列的核酸分子。在選擇性分析條件下，探針將以允許專業(yè)人員檢 測樣品中靶標序列的存在的方式雜交到靶標序列或其擴增子。有效探針制備的技術在本領 域中是已知的。然而，一般來講，有效探針被設計用于防止與自身或任何將會妨礙檢測靶標 序列存在的核酸分子的非特異性雜交。探針可包括例如能夠檢測的標記，其中標記為例如 放射標記物、熒光團或熒光染料、生物素、酶、化學發(fā)光化合物或本領域已知的其他類型的 可檢測信號。
[0011] 由于探針以允許檢測指示樣品中靶標序列存在的信號的方式雜交到靶標序列或 其擴增子，因此信號的強度與存在的靶標序列或其擴增子的量成比例。因此，通過在擴 增過程中定期測量表征擴增子存在的信號，可檢測擴增子隨時間推移的增長。根據(jù)在擴 增過程的"實時"監(jiān)測期間收集的數(shù)據(jù)，可確定樣品中初始存在的靶標核酸的量。用于實 時檢測和用于處理實時數(shù)據(jù)以確定核酸水平的系統(tǒng)和方法在例如Lair等人的美國專利 No.7,932,081, "Signal Measuring System for Conducting Real-Time Amplification Assays"（用于進行實時擴增分析的信號測量系統(tǒng)）中有所描述，該專利的公開內容據(jù)此以 引用方式并入。
[0012] 為了在單次分析中檢測不同的所關注核酸，可使用被配置以雜交到不同核酸的不 同探針，這些探針中的每一個可以提供可檢測到的不同信號。例如，被配置以雜交到不同靶 標的不同探針可帶有熒光團，當暴露于規(guī)定激發(fā)波長的激發(fā)光時，該熒光團在預定波長下 發(fā)熒光。通過使樣品材料交替地暴露于不同激發(fā)波長并且在實時監(jiān)測過程中檢測所關注波 長下對應于每個靶標核酸的探針的熒光水平，可并行執(zhí)行用于檢測不同靶標核酸的分析。 可使用不同的信號檢測設備執(zhí)行并行處理，所述信號檢測設備被構造并布置用于在擴增過 程中定期測量信號發(fā)射，并且不同的信號檢測設備被配置以生成不同波長的激發(fā)信號以及 測量不同波長的發(fā)射信號。合適的信號檢測設備包括熒光計，諸如下文所述的熒光計。
[0013] 熱熔分析或熔解曲線分析包括評估雙鏈DNA在加熱過程中的離解特性，以識別靶 標核酸中的特異性基因型?？墒褂檬占男畔⑼茢鄦魏塑账岫鄳B(tài)性的存在和種類。更具體 地講，破壞兩條DNA鏈之間的堿基-堿基氫鍵所需的能量取決于它們的長度、GC含量（或鳥 嘌呤-胞嘧啶含量）以及它們的互補性。通過加熱包含雙鏈DNA序列的反應混合物并測量 不同溫度下的離解，可推斷多種屬性。最初使用紫外吸光度測量觀察鏈離解，但基于熒光測 量的技術是目前最常用的方法?？墒褂肈NA插入熒光團（諸如SYBR綠、EvaGreen或熒光 團標記的DNA探針）測量兩條DNA鏈之間的隨溫度變化的離解。就SYBR綠而言，DNA在加 熱過程中的離解可通過其導致的熒光大幅減少來測量。作為另外一種選擇，可使用一個具 有熒光團而另一個具有合適的淬滅劑的并置探針來確定探針與靶標序列的互補性。例如， 雖然多種其他方法是本領域已知的，熔解曲線的一階負導數(shù)圖可使得通過由此定義的峰值 確定離解溫度（定義為50 %離解）更為容易。
[0014] 熔解曲線分析描述了用于測量兩條核酸鏈的溫度依賴性離解的方法。為執(zhí)行熔解 曲線分析，升高樣品和/或包含在其中的擴增子的溫度，同時監(jiān)測由樣品發(fā)出的信號，諸如 熒光團標記探針的熒光。隨著溫度上升，可根據(jù)可檢測到的信號變化（諸如通過熒光的減 少）測量探針和擴增子的離解。熔解工位包括一個或多個包含樣品材料（例如擴增子）的 容器，并且使容器的內容物經(jīng)受熱能，以沿著受控溫度曲線升高擴增子的溫度，同時監(jiān)測信 號，例如由內容物發(fā)出的熒光。在檢測到的信號為熒光的情況下，可以在一個或多個波長下 監(jiān)測熒光。該程序得到熒光相對時間的熔解曲線。熔解溫度的差值可用于區(qū)別擴增子序列 的變型。例如，突變型鏈和野生型鏈可以具有顯著不同的熔解溫度。
[0015] 通常，在成批處理樣品的分子診斷器械上執(zhí)行熱熔分析。將一組樣品（即"一批"） 置于器械（通常為熱塊）中，并運行器械以對所有樣品基本上同時執(zhí)行熱熔或熱熔分析。 器械繼續(xù)運行，直至對置于器械中的所有樣品完成分析。完成分析后，停止或暫定器械的運 行，取出此批樣品，待器械或熱塊的溫度緩降到特定的起始溫度，然后可將后續(xù)批次的樣品 置于器械中并重復該過程。
[0016] 通常，通過將接納反應液體的容器置于器械中來執(zhí)行熔解分析，該器械通過升高 器械的組件（通常稱為熱塊）的溫度來升高反應液體的溫度。根據(jù)預定義的溫度曲線，足 夠緩慢地升高熱塊的溫度，使得反應液體的溫度準確地跟隨塊的溫度。可緩慢并線性地改 變塊的溫度，或者以階梯式的方式改變，同時將每個梯度的溫度保持足夠長的時間，以便反 應液體在每個溫度梯度中達到穩(wěn)態(tài)。塊的溫度必須起始于或低于最低分析溫度，并且結束 于或高于最高分析溫度，以確保反應液體的溫度在整個熔解過程中是已知的。要為下一個 容器（即批次）做準備，塊的溫度必須緩降到起始溫度。器械的總通量受到反應液體溫度 從起始溫度變?yōu)榻Y束溫度的速度以及塊的溫度返回到起始溫度以便為下一個批次做好準 備的速度所限制。分析時間也受到容器內反應液體的溫度可跟隨塊溫度的速度的限制。
[0017] 與成批方式不同，其他診斷器械以連續(xù)（也稱為線性或管線）方式處理樣品。通 過器械依次并連續(xù)地處理樣品，以并行方式對不同樣品執(zhí)行不同處理步驟。一個樣品完成 分析過程，而另一個樣品立即開始該過程。因此，對所有樣品的處理并非同時開始或完成， 并且可以在器械運行過程中定期完成分析，例如，每五分鐘一次。
[0018] 就以連續(xù)方式處理樣品的自動化器械而言，為了保持每五分鐘或其他所需的間隔 完成一次樣品分析的示例性順序，熔解工位必須能夠一次處理一個反應容器并且優(yōu)選地在 一個五分鐘間隔內完成熱熔周期。如果熱熔工位不能通過在指定時間間隔內完成熱熔周期 來保持所需的頻率，則必須采用兩個或更多個并行運行的熱熔工位。如上所述，對使溫度從 起始溫度緩慢升高到結束溫度然后回到起始溫度的需求，以及容器的內容物達到與熱塊的 熱平衡可能需要的時間延遲產(chǎn)生了挑戰(zhàn)：需要設計一種可在保持連續(xù)處理分子的診斷器械 的期望通量所需的時間間隔內完成熱熔程序的熱熔工位。

【發(fā)明內容】

[0019] 本公開的多個方面體現(xiàn)在被配置以對容器的內容物施加熱能的裝置，以增加容器 的內容物的溫度并檢測容器的內容物隨著內容物的溫度上升而發(fā)出的光學信號。該裝置包 括：容器固定器，該容器固定器被配置以接納并以可脫開的方式保持容器；器皿接納熱組 件，其一部分被保持在相對于環(huán)境溫度的恒定高溫下并且被配置以接納容器的至少一部分 并對容器的內容物施加熱能；容器移動機構，該容器移動機構被配置以在容器固定器與器 皿接納熱組件之間進行相對移動，以將由容器固定器保持的容器的至少一部分置于器皿接 納熱組件內并將容器的該部分從器皿接納熱組件中移出；以及光學信號檢測設備，該光學 信號檢測設備被構造和布置用于在通過器皿接納熱組件對內容物施加熱能時，檢測保持在 器皿接納熱組件中的容器的內容物發(fā)出的光學信號。
[0020] 根據(jù)本公開的裝置的其他方面，穩(wěn)態(tài)溫度為至少約90°C。根據(jù)其他方面，穩(wěn)態(tài)溫度 介于約70°C和約120°C之間。根據(jù)其他方面，穩(wěn)態(tài)溫度介于約70°C和約90°C之間。在常見 實施例中，容器的內容物發(fā)出的光學信號包括化學發(fā)光和/或熒光信號。在常見實施例中， 此類光學信號由兩條核酸鏈（諸如雙鏈DNA)之間的氫鍵斷裂產(chǎn)生。在偶見實施例中，穩(wěn)態(tài) 溫度包括可發(fā)生等溫核酸擴增反應（例如，TMA、3SR、NASBA、SMART、SDA、RCA、LAMP、MDA、 HAD、SPIA 或 cHDA)的溫度。
[0021] 根據(jù)其他方面，容器固定器包括蓋和托架，該蓋定位在容器固定器中裝載的容器 上方，并且該托架包括沿著該托架的相對側的側壁和沿著側壁的底部邊緣延伸的側向支承 法蘭。
[0022] 根據(jù)其他方面，該裝置還包括被配置以檢測容器固定器中容器的存在的容器存在 檢測器。
[0023] 根據(jù)其他方面，容器移動機構由系統(tǒng)控制器控制，該系統(tǒng)控制器被配置以在容器 存在檢測器檢測到容器固定器中存在容器時引發(fā)容器固定器與器皿接納熱組件之間的相 對移動。
[0024] 根據(jù)其他方面，器皿接納熱組件包括器皿對齊塊和熱塊。器皿對齊塊被構造和布 置用于在容器移動機構在容器固定器與器皿接納熱組件之間進行相對移動時，將容器固定 器裝載的容器的一部分定位在熱塊中。
[0025] 根據(jù)其他方面，熱塊被配置以保持在恒定高溫下。
[0026] 根據(jù)其他方面，裝置還包括與熱塊熱接觸的熱元件。
[0027] 根據(jù)其他方面，熱元件包括覆蓋熱塊的至少一部分的電阻性箔。
[0028] 根據(jù)其他方面，器皿對齊塊包括對齊開口，該對齊開口形成于其中并被配置以保 持在固定方向通過該開口插入的容器。另外，形成的熱塊由導熱材料形成并且包括形成于 其中的容器開口。熱塊相對于器皿對齊塊定位，使得形成于熱塊中的容器開口與穿過器皿 對齊塊形成的對齊開口對齊，以使得通過穿過器皿對齊塊形成的對齊開口插入的容器定位 在形成于熱塊中的容器開口內。
[0029] 根據(jù)其他方面，該裝置包括至少一個形成于熱塊中的信號孔，并且其延伸到形成 于容器中的容器開口。該信號孔被配置以允許光學信號檢測設備檢測位于容器開口內的容 器的內容物發(fā)出的光學信號。
[0030] 根據(jù)其他方面，該裝置包括設置在器皿對齊塊與熱塊之間的結合塊并且具有與器 皿對齊塊的對齊開口和熱塊的容器開口對齊的開口。
[0031] 根據(jù)其他方面，穿過器皿對齊塊形成的對齊開口的橫截面為圓形并且形成于熱塊 中的容器開口的橫截面為圓形。
[0032] 根據(jù)其他方面，器皿對齊塊包括凸起的中心部分，該中心部分在器皿對齊塊的頂 部表面上沿著器皿對齊塊的縱向延伸，并且在凸起的中心部分的相對側限定凹陷的肩部。
[0033] 根據(jù)其他方面，熱塊包括從熱塊的頂部表面形成于其中的一個或多個容器孔以及 從塊的下表面延伸并且圍繞一個或多個容器孔而不延伸到容器孔中的任一個的中空部分。 [0034] 根據(jù)其他方面，該裝置包括固定到熱塊的底部表面的底蓋，以基本上包封中空部 分。
[0035] 根據(jù)其他方面，該裝置包括形成于熱塊和底蓋中并且延伸至在熱塊中形成的容器 孔的信號孔。該信號孔被配置以允許光學信號檢測設備檢測位于容器孔內的容器的內容物 發(fā)出的光學信號。
[0036] 根據(jù)其他方面，器皿對齊塊包括一個或多個從其表面凸起的安裝塊，器皿對齊塊 在該安裝塊處附接到熱塊。
[0037] 根據(jù)其他方面，容器固定器被配置以接納并以可脫開的方式保持多個容器。器皿 接納熱組件被配置以接納多個容器的一部分并且對容器的內容物施加熱能。該裝置還包括 檢測器平移機構，該檢測器平移機構被構造和布置用于相對于器皿接納組件移動光學信號 檢測設備，以選擇性地將信號檢測設備的信號檢測通道定位成與保持在器皿接納熱組件內 的兩個或更多個不同容器檢測對齊。
[0038] 根據(jù)其他方面，容器移動機構包括電機、聯(lián)接到電機的輸出軸的螺紋傳動螺桿；以 及聯(lián)接到容器固定器的螺桿從動件。傳動螺桿與螺桿從動件接合，使得由電機驅動的傳動 螺桿的旋轉引起容器