本發(fā)明涉及功能材料的制備和應用，特別涉及一種負載乙酰膽堿酯酶的富勒烯/金屬有機框架及制備方法和應用。

背景技術(shù)：

1、生物體內(nèi)各種微妙的生化級聯(lián)過程通常局限于細胞內(nèi)，它們在空間限制和底物通道環(huán)境下進行級聯(lián)流動反應，協(xié)同作用完成復雜的生物過程。受到生命系統(tǒng)的啟發(fā)，科學家們將具有多種酶活性和酶級聯(lián)催化性能的納米酶作為級聯(lián)流動反應器，其特點是成本低和具有批量生產(chǎn)能力。其中金屬有機框架mof納米酶由有機配體和金屬離子節(jié)點連接而成，具有可定制的孔通道、高比表面積以及類似于細胞環(huán)境的剛性和柔韌性之間的平衡等優(yōu)點。同時，納米多孔mof內(nèi)部形成的中/宏孔洞可以在空間上形成一個受限的環(huán)境，模擬生物體內(nèi)的流動過程。然而由于缺乏類酶分子識別單元，納米酶固有的反應選擇性較差，限制了其廣泛應用。因此可以設想如果將定義明確且高效的天然酶整合到強大的納米酶結(jié)構(gòu)中，則連續(xù)流催化的概念將顯著提高到實際應用的水平。

2、傳統(tǒng)的天然酶固定化方法通常是基于共價結(jié)合，由于缺乏特異性的結(jié)合口袋和精細調(diào)節(jié)的催化微環(huán)境，導致酶分布不均勻或酶活性變性。幸運的是，可以通過空間效應、π?-π相互作用和強超分子范德華效應來錨定生物識別元件，從而在納米酶和天然酶之間建立結(jié)構(gòu)互補，并為天然酶有效載荷提供自適應環(huán)境。因此，基于天然酶和功能性納米酶整合的酶-納米酶內(nèi)源性系統(tǒng)不需要任何外部能量輸入來觸發(fā)催化反應，從而避免了外部觸發(fā)因素的影響和限制。具體來說，被測物質(zhì)在酶-納米酶級聯(lián)流動反應器中定向流動，在有限的空間內(nèi)進行級聯(lián)反應，避免了傳統(tǒng)封閉系統(tǒng)中分子的無序擴散，消除了開放體系的弊端。

3、有機磷農(nóng)藥ops是含磷元素的有機復合農(nóng)藥，主要用于防治植物病蟲害和雜草危害，保證作物產(chǎn)量，提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量。然而，一旦有機磷化合物通過食物鏈進入生物體，過量使用超過最大允許限量mpls，就會引起乙酰膽堿積累，嚴重時可導致肺水腫、呼吸麻痹和死亡。因此，建立一種靈敏的ops殘留分析方法是疾病預防、環(huán)境監(jiān)測和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迫切需要。利用乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用，在環(huán)境監(jiān)測、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和疾病預防中開發(fā)了各種比色法檢測ops，但它們?nèi)匀皇艿健版i-鍵”特異性識別機制的限制，只能用于檢測或識別單一目標物質(zhì)。值得注意的是，利用非特異性識別元素的比色傳感器陣列，通過數(shù)學分析克服了傳統(tǒng)“鎖-鍵”特異性識別機制的限制，這種方法可以將受體對每種分析物的不同反應轉(zhuǎn)化為具有明確邊界的不同區(qū)域模式，就像生物鼻子一樣，可以同時識別具有不同結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的ops。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決背景技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明以具有優(yōu)異的類氧化酶oxd和類過氧化物酶pod活性的富勒烯/金屬有機框架c60@pcn-222(fe)納米酶為支架，乙酰膽堿酯酶ache為生物識別元件，構(gòu)建高效的ache/c60@pcn-222(fe)酶-納米酶比色流動傳感器，利用ops對ache活性的抑制作用構(gòu)建比色陣列，利用三個通道的響應差異檢測并區(qū)分多種ops。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)。

3、c60@pcn-222(fe)的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

4、（1）將八水合氯化鋯zrocl2·8h2o、[5,10,15,20-四（4-羧基苯基）卟啉鐵fetcpp和苯甲酸分散于含n,n-二乙基甲酰胺def中，再加入含富勒烯c60的甲苯溶液攪拌0.5-1.5?h，然后將混合溶液添加到特氟龍內(nèi)襯高壓滅菌器中，在100-140?°c反應44-52?h；其中zrocl2·8h2o、fetcpp、苯甲酸和c60的質(zhì)量比為1：0.67：36：0.07，總質(zhì)量為1.41-4.23?g；def和甲苯的體積比為1：1，總體積為15-25?ml；

5、（2）反應完成后，將沉淀用乙醇和def各離心并洗滌三次，隨后在鹽酸和丙酮中依次浸泡20-30?h，以交換并除去作為揮發(fā)性溶劑的def，最后在60-80?°c真空干燥10-16?h，得到產(chǎn)物c60@pcn-222(fe)；其中鹽酸和丙酮的體積比為1：1，總體積為2-6?ml。

6、探究c60@pcn-222(fe)納米酶的類oxd和pod活性，其特征在于，包括以下步驟：

7、（1）探究c60@pcn-222(fe)的類oxd活性：將c60@pcn-222(fe)和3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺tmb加入到醋酸-醋酸鈉hac-naac緩沖液中，在20-30?°c下反應20-30?min，隨后通過紫外-可見光uv-vis分光光度計記錄反應體系在652?nm的吸光度；其中c60@pcn-222(fe)、tmb和hac-naac緩沖液的體積比為1：30：180，總體積為1.5-2.5?ml；c60@pcn-222(fe)的終濃度為0.1-0.3?mg·ml-1，tmb的終濃度為4-6?mm，hac-naac緩沖液的終濃度和ph分別為0.1-0.3?m和3-5；

8、（2）探究c60@pcn-222(fe)的類pod活性：將c60@pcn-222(fe)、tmb和過氧化氫h2o2加入到hac-naac緩沖液中，在20-30?°c下反應15-25?min，隨后通過uv-vis分光光度計記錄反應體系在652?nm的吸光度；其中c60@pcn-222(fe)、tmb、h2o2和hac-naac緩沖液的體積比為1：20：15：180，總體積為1.5-2.5?ml；c60@pcn-222(fe)的終濃度為0.1-0.3?mg·ml-1，tmb的終濃度為4-6?mm，h2o2的終濃度為7-13?mm，hac-naac緩沖液的終濃度和ph分別為0.1-0.3?m和3-5。

9、ache/c60@pcn-222(fe)酶-納米酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

10、將0.5-1.5?mg的c60@pcn-222(fe)在3-7?ml超純水中超聲20-40?min，得到均勻的c60@pcn-222(fe)懸浮液，然后在混懸液中加入0.5-1.5?mg的ache，攪拌20-40?min后在35-39?°c孵育8-12?h，得到ache/c60@pcn-222(fe)酶-納米酶，2-6?°c儲存?zhèn)溆谩?/p>

11、ache/c60@pcn-222(fe)酶-納米酶流動反應器檢測多種ops，其特征在于，包括以下步驟：

12、將ache/c60@pcn-222(fe)和不同濃度的ops（草甘膦/氧化樂果/對氧磷標準溶液）在離心管中充分混合，在30-40?℃反應20-40?min，然后加入tmb、atch、hac-naac緩沖液，在30-40?℃孵育20-30?min，隨后通過uv-vis分光光度計記錄反應體系在652?nm的吸光度；其中ache/c60@pcn-222(fe)、草甘膦/氧化樂果/對氧磷標準溶液、tmb、atch和hac-naac緩沖液的體積比為1：0.3：1：0.5：8，總體積為0.8-1.3?ml；ache/c60@pcn-222(fe)的終濃度為1.5-2.5?mg·ml-1，tmb的終濃度為3-7?mm，atch的終濃度為4-8?mm，hac-naac緩沖液的終濃度和ph分別為0.1-0.3?mm和3-5。

13、與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

14、（1）本發(fā)明提供的c60@pcn-222(fe)的制備方法簡單，且后處理相對容易，通過其獨特的納米結(jié)構(gòu)空腔和豐富的分子擴散路徑形成的空間限制環(huán)境，為特定納米尺度下的有效流動反應提供潛力；

15、（2）本發(fā)明基于c60@pcn-222(fe)的獨特的主客體相互作用優(yōu)化了類oxd和pod活性，提出了一種無需外部能量輸入的級聯(lián)催化策略；

16、（2）本發(fā)明中通過酶原位組裝策略成功地將ache固定在ache/c60@pcn-222(fe)中，在有限的域空間內(nèi)進行級聯(lián)反應，避免了傳統(tǒng)封閉系統(tǒng)中分子的無序擴散，消除了開放系統(tǒng)的弊端；

17、（4）與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明構(gòu)建的ache/c60@pcn-222(fe)酶-納米酶流動反應器不僅實現(xiàn)了草甘膦、氧化樂果和對氧磷的同時檢測，而且利用三種通道的響應差異，對這三種有機磷農(nóng)藥進行了有效的區(qū)分，其線性范圍寬，檢測限低，在穩(wěn)定性和重復性等方面都有明顯的提升。