本發(fā)明屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種將5-磷酸吡哆醛用于制備固定金屬親合材料的方法，及其在樣品前處理中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)磷酸化是一種可逆的轉(zhuǎn)錄后修飾，在各種生理功能中都有重要的作用。目前，質(zhì)譜技術(shù)由于其高靈敏度、高通量被廣泛用于磷酸化多肽的研究中。然而由于磷酸化蛋白在生物樣品里的含量低，并且磷酸化多肽在質(zhì)譜中的離子化效率比非磷酸化多肽要低，使得我們難以對(duì)其進(jìn)行直接分析。因此，在質(zhì)譜分析前對(duì)樣品中的磷酸化多肽進(jìn)行富集顯得十分重要。

固定金屬親合色譜(immobilizedmetalaffinitychromatography，imac)作為一種快速、簡(jiǎn)單易用和經(jīng)濟(jì)的純化技術(shù)，近年來(lái)被研究者廣泛應(yīng)用于磷酸化肽的富集。其基本原理是將金屬離子固定于一定的配體上，然后利用金屬離子與磷酸根基團(tuán)之間的配位作用來(lái)萃取磷酸化多肽。吸附到材料上的磷酸化多肽可以通過(guò)磷酸鹽或者堿性溶液解吸下來(lái)。其中，研究最多的配體為亞氨基二乙酸(ida)、次氮基三乙酸(nta)和磷酸根基團(tuán)等，且磷酸根基團(tuán)修飾的多孔硅膠比傳統(tǒng)的imac材料體現(xiàn)出更好的選擇性。因此，在接下來(lái)的幾年中，人們制備了一系列含磷酸根基團(tuán)的材料，并將其用于復(fù)雜生物樣品中磷酸化多肽的分離和富集，然而，在制備含磷酸根基團(tuán)的材料的過(guò)程中，經(jīng)常需要用到一些毒性較大的試劑，并且合成過(guò)程較為復(fù)雜。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明引入一種新的配體—5-磷酸吡哆醛(pyridoxal5′-phosphate,plp)，它是維生素b6在體內(nèi)的活性型代謝產(chǎn)物，且具有雙功能反應(yīng)基團(tuán)，分別是醛基和磷酸根。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案具體如下：

一種固定金屬親合材料的制備方法，包括以下步驟：

(1)將活化過(guò)的納米材料y分散在乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷進(jìn)行攪拌，得到氨基修飾的納米材料y，即y-nh2；所述的納米材料y為納米sio2、fe3o4@sio2納米微球或碳納米管；

(2)向步驟(1)得到的y-nh2中加入ph＝7.4的磷酸緩沖液，然后加入5-磷酸吡哆醛和nabh3cn，室溫反應(yīng)，y-nh2表面被磷酸根修飾，將所得固體產(chǎn)物清洗后室溫干燥，得到y(tǒng)-nh2-plp；

(3)向金屬鹽溶液中加入y-nh2-plp，室溫震蕩5-10h，所得固體產(chǎn)物依次用乙醇、水和丙酮清洗，60℃真空干燥，得到固定金屬親合材料，即y-nh2-plp-mⁿ⁺。

所述步驟(1)中，納米sio2或fe3o4@sio2納米微球的活化方式為：將納米sio2或fe3o4@sio2納米微球分散在鹽酸中室溫靜置0.5h以上；碳納米管的活化方式為：將碳納米管分散在濃硫酸、濃硝酸體積比為3:2的混合液中50℃攪拌20h以上。

所述步驟(1)中，納米sio2或fe3o4@sio2納米微球與3-氨丙基三乙氧基硅烷一起進(jìn)行攪拌的溫度為室溫；碳納米管與3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)一起進(jìn)行攪拌的溫度為70℃。

所述步驟(2)中，固體產(chǎn)物的洗滌方式為：依次用乙醇、二次水和丙酮清洗。

步驟(2)中，所述的金屬鹽為硫酸鈦、氯化鎵、氯化鐵中的一種。

一種固定金屬親合材料，由上述制備方法制備得到。

上述固定金屬親合材料在樣品前處理中的應(yīng)用。

本發(fā)明的原理如下：

本發(fā)明通過(guò)席夫堿反應(yīng)在氨基化納米材料(y)表面修飾磷酸根基團(tuán)，得到y(tǒng)-nh2-plp；繼而在磷酸根基團(tuán)上修飾金屬離子，得到y(tǒng)-nh2-plp-mⁿ⁺固定金屬親和色譜(immobilizedmetalaffinitychromatography，imac)吸附劑，該吸附劑的螯合劑為5-磷酸吡哆醛。

本發(fā)明通過(guò)改變納米材料y，分別選擇二氧化硅(sio2)，氧化碳納米管(ocnt)和包硅磁顆粒(fe3o4@sio2)制備了三種不同基地材料的y-nh2-plp(y＝sio2、ocnt或fe3o4@sio2)。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

(1)本發(fā)明的修飾方法簡(jiǎn)單、省時(shí)，且不會(huì)破壞基底材料的形貌特征，而且該修飾對(duì)基底材料進(jìn)行功能化，增加了基底材料的實(shí)用性。

(2)本發(fā)明制備的固定金屬親合材料y-nh2-plp-mⁿ⁺可作為imac吸附劑，利用金屬離子與磷酸根的親和作用，應(yīng)用于生物樣品中磷酸化肽的選擇性富集，成功地應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)多肽混合液、牛奶酶解液、人類血清樣品、鼠腦裂解液中磷酸化多肽的萃取等領(lǐng)域。

附圖說(shuō)明

圖1為y-nh2-plp-mⁿ⁺(以fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺為例)制備的流程圖。

圖2為β-酪蛋白和牛血清蛋白(bsa)酶解混合液(1:500)的質(zhì)譜圖；其中，圖2(a)表示直接分析；圖2(b)表示經(jīng)過(guò)fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺萃取后；圖2(c)表示經(jīng)過(guò)sio2-nh2-plp-ti⁴⁺萃取后；圖2(d)表示經(jīng)過(guò)cnt-nh2-plp-ti⁴⁺萃取后；磷酸化多肽用其m/z值標(biāo)記。

圖3為β-酪蛋白和牛血清蛋白(bsa)酶解混合液(1:500)的質(zhì)譜圖；其中，圖3(a)表示經(jīng)過(guò)fe3o4@sio2-nh2-plp-ga³⁺萃取后；圖3(b)表示經(jīng)過(guò)fe3o4@sio2-nh2-plp-fe³⁺萃取后；磷酸化多肽用其m/z值標(biāo)記。

圖4為β-酪蛋白和bsa酶解混合液(1:1000)的質(zhì)譜圖；其中，圖4(a)表示直接分析；圖4(b)表示經(jīng)過(guò)fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺萃取后；磷酸化多肽用其m/z值標(biāo)記。

圖5為血清和脫脂牛奶酶解液的質(zhì)譜圖；其中，圖5(a)表示直接分析的血清樣品；圖5(b)表示fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺萃取后的血清樣品；圖5(c)表示直接分析的脫脂牛奶酶解液樣品；圖5(d)表示fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺萃取后的脫脂牛奶酶解液樣品。

圖6為鼠腦裂解液中磷酸化多肽的情況分析圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但這些實(shí)施例僅限于說(shuō)明本發(fā)明，并不能限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

首先制備氨基修飾的納米材料，得到y(tǒng)-nh2；再將5-磷酸吡哆醛接到y(tǒng)-nh2上，得到表面修飾磷酸根的y-nh2-plp；最后在磷酸根上固載金屬離子，得到y(tǒng)-nh2-plp-mⁿ⁺。

1.氨基修飾的納米材料(y-nh2)的制備，根據(jù)納米材料不同，其制備方法如下：

①sio2-nh2的制備：將0.5g納米sio2分散在25ml1m的hcl水溶液中活化30min；經(jīng)水及乙醇清洗后，將其分散在50ml乙醇中；在上述懸浮液中加入2mlaptes，室溫下攪拌3h，得到氨基鍵合硅膠納米顆粒。

②fe3o4@sio2-nh2的制備：將2.0gfecl2·4h2o和5.4gfecl3·6h2o溶解在2mhcl水溶液中，通入氮?dú)獬ト芙庋?，然后加?0ml濃氨水(25wt％)，攪拌30min，得到fe3o4納米顆粒；將fe3o4納米顆粒經(jīng)反復(fù)磁分離及水洗后，分散于50ml水中待用。

取5mlfe3o4納米顆粒懸浮液，用乙醇清洗后，分散于40ml乙醇中，并超聲1h；之后加入1.5ml濃氨水，6ml水以及1.5mlteos，并在40℃下攪拌2h。最后所得的fe3o4@sio2納米顆粒經(jīng)去離子水及乙醇清洗后，置于60℃真空干燥箱中烘干待用。將0.5gfe3o4@sio2分散在25ml1m的hcl水溶液中活化30min；經(jīng)水及乙醇清洗后，將其分散在50ml乙醇中；在上述懸浮液中加入2mlaptes，并在室溫下攪拌3h，得到氨基鍵合硅膠納米顆粒。

③ocnt-nh2的制備：將碳納米管(cnt)分散于300ml濃硫酸、濃硝酸體積比為3:2的混合液中，在50℃攪拌20h，然后將所得溶液過(guò)濾，并用水和丙酮清洗，在100℃真空條件下干燥24h，將所得產(chǎn)物氧化碳納米管(ocnt)分散于50ml乙醇中，超聲30min。隨后加入2mlaptes于70℃攪拌4h，得到氨基鍵合的氧化碳納米管，即ocnt-nh2。

2.y-nh2-plp的制備：稱取0.4gy-nh2于50ml圓底燒瓶中，加入40ml0.1m的磷酸緩沖液(ph7.4)，再加入0.2gplp和0.2g氰基硼氫化鈉(nabh3cn)，25℃反應(yīng)5h。產(chǎn)物依次用乙醇、二次水和丙酮清洗，室溫干燥過(guò)夜，即得到y(tǒng)-nh2-plp。

3.y-nh2-plp-mⁿ⁺的制備：配制三份硫酸鈦水溶液(0.1m)20ml，分別加入0.2gy-nh2-plp；分別配制氯化鎵水溶液(0.1m)、氯化鐵水溶液(0.1m)各20ml，分別向這兩份溶液中加入0.2gfe3o4@sio2-nh2-plp，室溫震蕩5h，產(chǎn)物依次用乙醇、水和丙酮清洗，60℃真空干燥，得到固定金屬親合材料，即y-nh2-plp-mⁿ⁺。

實(shí)施例2

為了考察三種不同納米材料修飾鈦離子(y-nh2-plp-ti⁴⁺)對(duì)磷酸化肽的萃取效果，從而選出一種最優(yōu)的基底材料，我們比較了三種y-nh2-plp-ti⁴⁺(y＝sio2、ocnt或fe3o4@sio2)在β-酪蛋白和bsa酶解混合液中對(duì)磷酸化多肽的萃取效果：

將β-酪蛋白用100mmtris-hcl(ph＝8.5)緩沖液配制成濃度為1mg/ml的溶液；在上述溶液中按照酶與底物比為1:50(w/w)的比例加入胰蛋白酶，并在37℃反應(yīng)16h。酶解后的多肽產(chǎn)物經(jīng)真空離心濃縮儀抽干后存放在-20℃的冰箱中備用。

稱取1mgbsa溶于100μl含8m尿素及100mmtris-hcl的變性緩沖液(ph＝8.5)中，然后加入5μl100mm三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽溶液(三羧甲基磷酸，tcep)，并在室溫下反應(yīng)20min以還原蛋白質(zhì)中的二硫鍵，繼續(xù)加入5μl100mm碘乙酰胺(iaa)溶液，并在避光條件下，室溫下反應(yīng)30min使被還原的巰基烷基化。經(jīng)還原及烷基化的蛋白質(zhì)用300μl100mmtris-hcl(ph8.5)稀釋后，按照酶與底物比為1:50(w/w)的比例加入胰蛋白酶，并在37℃反應(yīng)16h。酶解后的多肽產(chǎn)物抽干后存放在-20℃的冰箱中備用。

為了比較基于三種不同基底材料y-nh2-plp-ti⁴⁺(y＝sio2、ocnt或fe3o4@sio2)對(duì)磷酸化肽段的富集能力，將磷酸化蛋白(β-酪蛋白)與非磷酸蛋白(bsa)酶解產(chǎn)物的混合物作為分析物(β-酪蛋白：bsa＝1:500)。

分別稱取10mgy-nh2-plp-ti⁴⁺分散于1ml水中，混合均勻后，取20μl分散液，用上樣液(5％tfa-50％acn(v/v))平衡，然后將其加入100μl含多肽混合物的上樣液中，渦旋3min，離心或磁分離，經(jīng)過(guò)上樣液清洗兩遍之后，材料上的分析物用100μl解吸液(0.4mnh3·h2o)解吸到離心管中。解吸液經(jīng)真空離心濃縮儀抽干后，加入1.2μl基質(zhì)溶液(20mg/ml2,5-dhb于50％acn，1％h3po4的水溶液中)溶解多肽，全部樣品點(diǎn)在maldi靶上用于maldi-tofms分析。

所有的質(zhì)譜分析都采用日本shimadzu公司的aximatof²型基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(maldi-tofms)。maldims分析時(shí)采用波長(zhǎng)為337nm的氮?dú)饧す馄鳎涿}沖寬度為3ns；采用20kv的加速電壓，在正離子反射模式下進(jìn)行檢測(cè)。每張譜圖是200次激光掃描的平均結(jié)果。

檢測(cè)結(jié)果如圖2所示：當(dāng)β-酪蛋白酶解物未經(jīng)富集直接經(jīng)maldims分析時(shí)，譜圖中存在大量非磷酸化多肽的峰，沒(méi)有磷酸化多肽的峰(圖2(a))。經(jīng)過(guò)三種y-nh2-plp-ti⁴⁺分別處理之后，解吸液中分別可檢測(cè)到6、4、2個(gè)磷酸化多肽的信號(hào)峰(圖2(b)，圖2(c)，圖2(d))，而絕大多數(shù)非磷酸化多肽的信號(hào)被有效地消除，表明這三種y-nh2-plp-ti⁴⁺對(duì)磷酸化多肽均表現(xiàn)出一定的選擇性。從質(zhì)譜圖中磷酸化多肽個(gè)數(shù)和雜峰情況來(lái)看，以fe3o4@sio2為基底的材料富集效果最好，所能檢測(cè)到的磷酸化多肽的信息如表1所示。推測(cè)的原因是，相比于磁納米顆粒，硅膠顆粒粒徑更大，分散性較差，吸附量較小，且分離需要離心，操作不方便；而碳納米管表面具有一定的疏水性，會(huì)增加對(duì)非磷酸化多肽的非特異性吸附。

實(shí)施例3

為了考察三種常用金屬離子(ti⁴⁺，ga³⁺，fe³⁺)對(duì)磷酸化肽的萃取效果，從而選出一種最優(yōu)的金屬離子以獲得最優(yōu)的材料，我們比較了fe3o4@sio2-nh2-plp-mⁿ⁺(m＝ti⁴⁺、ga³⁺或fe³⁺)在β-酪蛋白和bsa酶解混合液中對(duì)磷酸化多肽的萃取效果：

為了比較三種鍵合不同金屬離子的fe3o4@sio2-nh2-plp-mⁿ⁺(m＝ti⁴⁺、ga³⁺或fe³⁺)對(duì)磷酸化肽段的富集能力，將磷酸化蛋白(β-酪蛋白)與非磷酸蛋白(bsa)酶解產(chǎn)物的混合物作為分析物(β-酪蛋白：bsa＝1:500)。

分別稱取10mgfe3o4@sio2-nh2-plp-mⁿ⁺分散于1ml水中，混合均勻后，取20μl分散液，用上樣液(5％tfa-50％acn(v/v))平衡，然后將其加入100μl含多肽混合物的上樣液中，渦旋3min，離心或磁分離，經(jīng)過(guò)上樣液清洗兩遍之后，材料上的分析物用100μl解吸液(0.4mnh3·h2o)解吸到離心管中。解吸液經(jīng)真空離心濃縮儀抽干后，加入1.2μl基質(zhì)溶液(20mg/ml2,5-dhb于50％acn，1％h3po4的水溶液中)溶解多肽，全部樣品點(diǎn)在maldi靶上用于maldi-tofms分析。

檢測(cè)結(jié)果如圖3所示：fe3o4@sio2-nh2-plp-fe³⁺和fe3o4@sio2-nh2-plp-ga³⁺這兩種材料對(duì)磷酸化多肽也表現(xiàn)出一定的選擇性，尤其是多磷酸化多肽。從質(zhì)譜圖中磷酸化多肽個(gè)數(shù)和雜峰情況來(lái)看，fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺表現(xiàn)得最好(圖2(b))。推測(cè)原因是，fe³⁺和ga³⁺相比于ti⁴⁺與磷酸化多肽的相互作用力更弱，因此損失大量的單磷酸化多肽。

實(shí)施例4

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺對(duì)磷酸化多肽的萃取能力，我們將fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺應(yīng)用于更復(fù)雜的β-酪蛋白和bsa酶解混合液中磷酸化多肽的萃取，同時(shí)繼續(xù)提高磷酸化蛋白(β-酪蛋白)與非磷酸蛋白(bsa)酶解產(chǎn)物的混合物中bsa的比例。

稱取10mgfe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺分散于1ml水中，混合均勻后，取20μl分散液，用上樣液(5％tfa-50％acn(v/v))平衡，然后將其加入100μl含多肽混合物的上樣液中，渦旋3min，離心或磁分離，經(jīng)過(guò)上樣液清洗兩遍之后，材料上的分析物用100μl解吸液(0.4mnh3·h2o)解吸到離心管中。解吸液經(jīng)真空離心濃縮儀抽干后，加入1.2μl基質(zhì)溶液(20mg/ml2,5-dhb于50％acn，1％h3po4的水溶液中)溶解多肽，全部樣品點(diǎn)在maldi靶上用于maldi-tofms分析。

檢測(cè)結(jié)果如圖4所示：當(dāng)β-酪蛋白酶解物和bsa酶解物的比例為1:1000時(shí)，在未經(jīng)過(guò)前處理的譜圖中只能看到大量的非磷酸化肽信號(hào)(圖4(a))；經(jīng)過(guò)fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺處理之后，譜圖中可以看到6個(gè)磷酸化肽的峰，而且大量的非磷酸化肽信號(hào)被去除(圖4(b))，說(shuō)明fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺對(duì)磷酸化肽有極好的選擇性。

實(shí)施例5：fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺應(yīng)用于血清中內(nèi)源性磷酸化多肽的富集

正常人的血清樣品通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的臨床渠道從武漢大學(xué)校醫(yī)院獲得，采集到的血清保存在-20℃冰箱中。

稱取10mgfe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺分散于1ml水中。混合均勻后，取20μl，用上樣液(5％tfa-50％acn(v/v))平衡后，進(jìn)行萃取。萃取磷酸化多肽時(shí)，血清(2μl)需要用上樣液稀釋50倍再進(jìn)行萃取。上樣液和解吸液分別為100μl5％tfa-50％acn(v/v)和0.4m氨水水溶液。萃取完成之后，解吸液進(jìn)行冷凍旋干，1.2μl基質(zhì)溶液(20mg/ml2,5-dhbin50％(v/v)acn,1％(v/v)h3po4)溶解多肽，全部樣品點(diǎn)在maldi靶上用于maldi-tofms分析。

檢測(cè)結(jié)果如圖5所示：血清未經(jīng)過(guò)材料處理直接進(jìn)樣時(shí)，質(zhì)譜圖中只能非磷酸多肽的信號(hào)(圖5(a))；經(jīng)過(guò)材料處理之后，質(zhì)譜圖中清晰的呈現(xiàn)著4個(gè)磷酸化多肽，而且?guī)缀蹩床坏椒橇姿峄牡男盘?hào)(圖5(b)，附表2)，表明材料適用于高蛋白生物樣品的分析。

實(shí)施例6：fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺應(yīng)用于脫脂牛奶酶解物中磷酸化多肽的選擇性富集

脫脂牛奶購(gòu)買(mǎi)自武漢大學(xué)某超市。牛奶的酶解過(guò)程如下：取100μl低脂牛奶經(jīng)真空離心濃縮儀抽干后復(fù)溶于100μl含8m尿素及100mmtirs-hcl的變性緩沖液(ph8.5)中。上述溶液經(jīng)10mm二硫蘇糖醇(dtt)于37℃下反應(yīng)30min以還原蛋白質(zhì)中的二硫鍵，之后在20mm碘乙酰胺(iaa)中于避光條件下，室溫下反應(yīng)30min使被還原的巰基烷基化。經(jīng)還原及烷基化的蛋白質(zhì)用300μl100mmtris-hcl(ph8.5)稀釋后，按照酶與底物比為1:50(w/w)的比例加入胰蛋白酶，并在37℃反應(yīng)16h。所有的酶解物保存在-20℃冰箱中備用。酶解后的多肽樣品稀釋500倍后用于材料的選擇性評(píng)價(jià)。

稱取10mgfe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺分散于1ml水中，混合均勻后，取20μl分散液，用上樣液(5％tfa-50％acn(v/v))平衡后，進(jìn)行萃取。萃取磷酸化多肽時(shí)，牛奶酶解物用上樣液稀釋500倍再進(jìn)行萃取。上樣液和解吸液分別為100μl5％tfa-50％acn(v/v)和0.4m氨水水溶液。萃取完成之后，解吸液進(jìn)行冷凍旋干，1.2μl基質(zhì)溶液(其中，2,5-dhb濃度為20mg/ml，50％(v/v)acn，1％(v/v)h3po4)溶解多肽，全部樣品點(diǎn)在maldi靶上用于maldi-tofms分析。

檢測(cè)結(jié)果如圖5所示：牛奶酶解物未經(jīng)過(guò)材料處理直接進(jìn)樣時(shí)，質(zhì)譜圖中只能看到7個(gè)磷酸化多肽以及大量的非磷酸化肽(圖5(c))；經(jīng)過(guò)材料處理之后，質(zhì)譜圖中清晰的呈現(xiàn)著20個(gè)磷酸化多肽(圖5(d)，附表3)，表明材料可用于實(shí)際樣品分析。

實(shí)施例7：fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺應(yīng)用于鼠腦裂解液中磷酸化多肽的富集

斯普拉格(sd)雌性大鼠由湖北省疾控中心提供，年齡3～4個(gè)月，體重250～300g。鼠腦被取下后，清洗干凈，切碎。取0.5g鼠腦組織，用勻漿管研碎，加入1mlripa裂解液(含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑)。在冰浴中裂解30分鐘后，于4℃下12000rpm離心30min，收集上清液。利用bca方法對(duì)上述上清液中的蛋白進(jìn)行定量。往上述上清液中加入3體積的丙酮/乙醇/乙酸混合液(50/50/0.1,v/v/v)進(jìn)行蛋白沉淀。之后4℃下4000rpm離心30min；去除上清液后，得到蛋白質(zhì)，在空氣中晾干。蛋白質(zhì)用含8m尿素和0.2mtris、4mmcacl2的溶液復(fù)溶后同上述步驟進(jìn)行酶解。酶解后的多肽產(chǎn)物經(jīng)c18柱脫鹽并抽干后存放在-20℃的冰箱中備用。

稱取10mgfe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺分散于1ml水中，混合均勻后，取20μl分散液，用上樣液(5％tfa-50％acn(v/v))平衡后，進(jìn)行萃取。萃取鼠腦裂解液樣品時(shí)，鼠腦蛋白的用量為0.5mg。上樣液和解吸液分別為100μl5％tfa-50％acn(v/v)和0.4m氨水水溶液。解吸液經(jīng)真空離心濃縮儀抽干后，用c18柱spe脫鹽，然后用反相液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(lc-esi-ms/ms)分析。

經(jīng)富集后的細(xì)胞裂解物酶解產(chǎn)物采用nanorplc-esi-ms/ms(tripletof5600+，absciex)進(jìn)行質(zhì)譜分析。多肽首先被結(jié)合到captrap柱(5μm,5×0.3mm,agilenttechnologies)上，然后被洗脫到反相c18分析柱(75μm×150mm,3μmparticlesize,poresize,eksigent)上。液相色譜的流動(dòng)相分別為溶液a(3％dmso,97％h2o,0.1％甲酸)和溶液b(3％dmso,97％acn,0.1％甲酸)，其梯度設(shè)置如表3-1所示，流速為300nl/min。一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍從400到1800amu，250ms累積時(shí)間。每個(gè)完整的一級(jí)質(zhì)譜掃描包括40次二級(jí)質(zhì)譜分析，掃描范圍從350到1500amu，離子的帶電量為+2到+5價(jià)。二級(jí)質(zhì)譜分析閥值設(shè)為120，18秒內(nèi)排除相同質(zhì)荷比離子。

檢測(cè)結(jié)果如圖6所示：該方法在0.5mg鼠腦裂解液中共檢測(cè)到3014個(gè)磷酸化多肽，其中單磷酸化多肽有2848個(gè)，多磷酸化多肽有166個(gè)，對(duì)磷酸化多肽的特異性為88.1％(圖6)。結(jié)果表明該材料在復(fù)雜生物樣品的分析中表現(xiàn)良好，有望用于磷酸化蛋白組的全分析。

表1β-酪蛋白酶解液中鑒定到的磷酸化多肽的詳情

“_”表示磷酸化位點(diǎn)

表2人類血清中鑒定到的磷酸化多肽的詳情

“_”表示磷酸化位點(diǎn)。

表3脫脂牛奶酶解液中鑒定到的磷酸化多肽的詳情

“_”表示磷酸化位點(diǎn)。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。