本申請(qǐng)要求在韓國(guó)專利局于2015年5月13日提交的韓國(guó)專利申請(qǐng)No.10-2015-006694、2015年10月23日提交的韓國(guó)專利申請(qǐng)No.10-2015-0148032、2015年12月7日提交的韓國(guó)專利申請(qǐng)10-2015-0173293、2015年12月23日提交的韓國(guó)專利申請(qǐng)No.10-2015-0185093、和2016年4月21日提交的韓國(guó)專利申請(qǐng)No.10-2016-0048960的權(quán)益，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)提述完整并入本文。

發(fā)明背景

1.領(lǐng)域

本公開(kāi)涉及包含編碼具有羥化酶活性的蛋白質(zhì)的基因的微生物，用于降低樣品中氟化甲烷濃度的組合物，包含編碼具有羥化酶活性的蛋白質(zhì)的基因的微生物的組合物，以及降低樣品中氟化甲烷濃度的方法。

2.相關(guān)技術(shù)描述

加速全球變暖的溫室氣體的排放是一個(gè)嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題，而且已經(jīng)加緊了降低和防止溫室氣體排放的調(diào)控。在溫室氣體中，氟化氣體(F氣體)如碳氟化合物(PFC)、氫氟烴(HFC)或SF₆顯示低絕對(duì)排放，但具有較長(zhǎng)的半衰期和非常高的全球暖化潛力，從而產(chǎn)生顯著的不良環(huán)境影響。從半導(dǎo)體和電子工業(yè)排放(其為F氣體排放的主要原因)的F氣體的量已超過(guò)了溫室氣體排放的指定量且持續(xù)增加。因此，溫室氣體降解需要的成本和溫室氣體排放補(bǔ)助逐年增加。

熱解或催化性熱氧化工藝已普遍地用于F氣體的分解。然而，該工藝的缺點(diǎn)在于分解率有限，次級(jí)污染物的排放，高成本等。為了解決此問(wèn)題，采用了利用微生物生物催化劑對(duì)F氣體的生物分解。因此，預(yù)期克服化學(xué)分解工藝的限制和以更經(jīng)濟(jì)和環(huán)境友好的方式來(lái)處理F氣體。

羥化酶是催化羥基基團(tuán)(-OH)引入到含碳化合物(RH)的碳，從而將含碳化合物中的CH基團(tuán)轉(zhuǎn)化成COH基團(tuán)的酶。羥化酶包括單加氧酶和脫鹵素酶。 單加氧酶催化一個(gè)氧原子納入到含碳化合物的碳位置并將另一個(gè)氧原子還原成水。單加氧酶包括細(xì)胞色素P450和甲烷單加氧酶(MMO)。細(xì)胞色素P450屬于含有血紅素輔因子的蛋白質(zhì)超家族，且因此細(xì)胞色素P450是血紅素蛋白。脫鹵素酶是催化鹵素原子從底物移除的一類酶。

盡管現(xiàn)有技術(shù)中進(jìn)行了多種努力，但尚未有關(guān)于包含作用于氟化甲烷的羥化酶的微生物、使用所述微生物用于降低樣品中氟化甲烷濃度的組合物和方法的報(bào)道。

發(fā)明概述

一個(gè)方面提供了重組微生物，其包含一種或多種編碼具有羥化酶活性的蛋白質(zhì)的外來(lái)基因，其中所述微生物相比于該重組微生物的親本菌株具有增加的羥化酶活性。

另一個(gè)方面提供了用于降低樣品中CH_nF_4-n(其中n是0至3的整數(shù))濃度的組合物，所述組合物包含重組微生物、其裂解物、或裂解物的水性級(jí)分，其中所述重組微生物包含一種或多種編碼具有羥化酶活性的蛋白質(zhì)的外來(lái)基因，且所述重組微生物相比于該重組微生物的親本菌株具有增加的羥化酶活性。

再一個(gè)方面提供降低樣品中CH_nF_4-n濃度的方法，所述方法包括使重組微生物、其裂解物、或裂解物的水性級(jí)分與含有CH_nF_4-n(其中n是0至3的整數(shù))的樣品接觸以降低樣品中CH_nF_4-n(其中n是0至3的整數(shù))的濃度，其中所述重組微生物包含一種或多種編碼具有羥化酶活性的蛋白質(zhì)的外來(lái)基因，且所述重組微生物相比于該重組微生物的親本菌株具有增加的羥化酶活性。

附圖簡(jiǎn)述

這些和/或其他方面從以下實(shí)施方案的描述，連同所附附圖將變得明顯和更容易領(lǐng)會(huì)的。

圖1A顯示通過(guò)重組大腸桿菌分解三氟甲(fluoroform)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

圖1B顯示通過(guò)引入鹵代烷脫鹵素酶的大腸桿菌分解三氟甲的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

圖2A顯示通過(guò)引入鹵代烷脫鹵素酶的大腸桿菌分解全氟甲烷的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

圖2B顯示通過(guò)大腸桿菌BL21star/pMALc2-CfrA樣品中CF₄濃度的變化，其使用陰性對(duì)照值標(biāo)準(zhǔn)化，其中△峰面積代表CfrA面積-陰性對(duì)照面積，且分解 率(％)代表(△峰面積/陰性對(duì)照面積)X100；

圖3顯示pETDuet-camC-camAB載體的載體圖譜；

圖4顯示當(dāng)在與含CHF₃的氣體接觸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌BL21/pETDuet-camC-camAB時(shí)CHF₃頂空(headspace)濃度隨時(shí)間的變化；

圖5A顯示當(dāng)在含CHCl₃的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌BL21/pETDuet-camC-camAB時(shí)CHCl₃頂空濃度隨時(shí)間的變化；

圖5B顯示當(dāng)在與含CF₄的氣體接觸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌BL21/pETDuet-camC-camAB時(shí)CF₄頂空濃度隨時(shí)間的變化；

圖6顯示pET28a-P450_BM3載體的載體圖譜；

圖7顯示pACYCDuet-zwf載體的載體圖譜；

圖8顯示當(dāng)在與含CHF₃的氣體接觸的溶液中培養(yǎng)大腸桿菌BL21/pET28a-P450_BM3或BL21/pET28a-P450_BM3+pACYCDuet-zwf菌株時(shí)CHF₃頂空濃度隨時(shí)間的變化；

圖9A顯示當(dāng)在含CHCl₃的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌BL21/pET28a-P450_BM3時(shí)CHCl₃頂空濃度隨時(shí)間的變化；

圖9B顯示當(dāng)在與含CF₄的氣體接觸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌BL21/pET28a-P450_BM37天時(shí)CF₄頂空濃度隨時(shí)間的變化；

圖10A顯示pET28a-mmoXYBZDC載體的載體圖譜；

圖10B顯示pETDuet-mmoXY-ZD載體的載體圖譜；

圖10C顯示pACYCDuet-mmoBC載體的載體圖譜；

圖10D顯示pACYCDuet-mmoG-BC載體的載體圖譜；

圖11顯示當(dāng)在與含CHF₃的氣體接觸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組大腸桿菌時(shí)CHF₃頂空濃度的變化；

圖12A顯示當(dāng)在含CHCl₃的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組大腸桿菌時(shí)CHCl₃頂空濃度的變化；

圖12B顯示當(dāng)在與含CF₄的氣體接觸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組大腸桿菌BL21/pET28a-mmoXYBZDC達(dá)7天時(shí)CF₄頂空濃度的變化；

圖13A顯示通過(guò)自養(yǎng)黃色桿菌(X.autotrophicus)GJ10的四氟甲烷分解；和

圖13B顯示通過(guò)自養(yǎng)黃色桿菌GJ10Xantho_dhlA的四氟甲烷分解。

發(fā)明詳述

一個(gè)方面提供了重組微生物，其包含一種或多種編碼具有羥化酶活性的蛋白質(zhì)的外來(lái)基因，其中所述微生物相比于該重組微生物的親本菌株具有增加的羥化酶活性。微生物的親本菌株是沒(méi)有給定的遺傳修飾(例如引入外來(lái)基因)的同一類型的微生物，其產(chǎn)生所述重組微生物。

就微生物而言，具有羥化酶活性的蛋白質(zhì)可以是催化羥基基團(tuán)(-OH)引入到含碳化合物(RH)的碳的酶。羥化酶可以催化含碳化合物中的CH基團(tuán)轉(zhuǎn)化成COH基團(tuán)。具有羥化酶活性的蛋白質(zhì)可以作用于氟代烷化合物的碳-氟或碳-氫鍵。

具有羥化酶活性的蛋白質(zhì)可以選自下組：脫鹵素酶和單加氧酶。

脫鹵素酶是催化鹵素原子從底物移除的一類酶。脫鹵素酶可屬于EC3.8.1.-。脫鹵素酶可以是氯仿還原性脫鹵素酶CfrA、四氯乙烯還原性脫鹵素酶、二氯甲烷脫鹵素酶、鹵代烷脫鹵素酶、烷基鹵化酶、(S)-2-鹵酸脫鹵素酶、(R)-2-鹵酸脫鹵素酶、2-鹵酸脫鹵素酶(構(gòu)象反轉(zhuǎn))、鹵代乙酸脫鹵素酶、或其組合。

具有羥化酶活性的蛋白質(zhì)可以具有與SEQ ID NO:1或2為95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高的序列同一性。具有羥化酶活性的蛋白質(zhì)可以具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列。具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白質(zhì)可歸類為鹵代烷脫鹵素酶。具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白質(zhì)可以是催化從作為底物的1-鹵代烷和水產(chǎn)生伯醇和鹵化物的酶。具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)可以歸類為(S)-2-鹵酸脫鹵素酶。進(jìn)一步地，具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)可以是催化從作為底物的(S)-2-鹵酸和水產(chǎn)生(R)-羥基酸和鹵化物的酶。編碼具有羥化酶活性的蛋白質(zhì)的一種或多種外來(lái)基因可以具有SEQ ID NO:3和4的核苷酸序列。此外，所述基因可以相對(duì)于作為宿主細(xì)胞的重組微生物密碼子優(yōu)化。密碼子優(yōu)化指產(chǎn)生以下基因，其中一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源密碼子被用于同一氨基酸但在相應(yīng)宿主中具有偏好性的密碼子替換。SEQ ID NO:3和4的核苷酸序列是分別編碼源自自養(yǎng)黃色桿菌的鹵代烷脫鹵素酶(dhlA)和(S)-2-鹵酸脫鹵素酶(dhlB)的基因。SEQ ID NO:61的核苷酸序列是針對(duì)大腸桿菌密碼子優(yōu)化的編碼鹵代烷脫鹵素酶(dhlA)的基因。氯仿還原性脫鹵素酶CfrA可以具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列，且可以由SEQ ID NO:56的核苷酸序列編碼。已知CfrA使氯仿(CF)和1,1,1-三氯乙烷(1,1,1-TCA)，而不是1,1-二氯乙烷脫氯。

對(duì)于重組微生物，單加氧酶催化將一個(gè)氧原子納入到含碳化合物的碳位置并將另一個(gè)氧原子還原成水的單加氧酶反應(yīng)。單加氧酶可以屬于EC1.14.13.-。單加氧酶包括甲烷單加氧酶(MMO)和細(xì)胞色素P450。甲烷單加氧酶是能氧化甲烷中的C-H鍵的酶。細(xì)胞色素P450(CYP)屬于含有血紅素輔因子的蛋白質(zhì)超家族，且因此細(xì)胞色素P450是血紅素蛋白。

甲烷單加氧酶可以是可溶性甲烷單加氧酶(sMMO)、特別甲烷單加氧酶、氨單加氧酶、樟腦5-單加氧酶、或其組合。sMMO蛋白可以屬于EC 1.14.13.25。sMMO蛋白可以源自莢膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)(Bath)。sMMO蛋白可包含MmoX、MmoY、和MmoZ、MmoB、MmoC、和MmoD的復(fù)合物。MmoX、MmoY、MmoZ、MmoB、MmoC、和MmoD可分別具有SEQ ID NO:5、7、9、11、13、和15的氨基酸序列。編碼MmoX、MmoY、MmoZ、MmoB、MmoC、和MmoD的多核苷酸可分別具有SEQ ID NO:6,8,10,12,14和16的核苷酸序列。對(duì)于重組微生物，基因可以包含具有SEQ ID NO:6的核苷酸序列的多核苷酸、具有SEQ ID NO:8的核苷酸序列的多核苷酸、具有SEQ ID NO:10的核苷酸序列的多核苷酸、具有SEQ ID NO:12的核苷酸序列的多核苷酸、具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列的多核苷酸、和具有SEQ ID NO:16的核苷酸序列的多核苷酸。對(duì)于重組微生物，基因可包括具有SEQ ID NO:35的核苷酸序列的多核苷酸。換言之，所述重組微生物可以包括具有SEQ ID NO:35的核苷酸序列的多核苷酸。

所述重組微生物可以進(jìn)一步包含編碼MmoG的外來(lái)基因。MmoG可具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列。編碼MmoG的多核苷酸可具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列。

所述重組微生物可以屬于埃希氏菌屬(Escherichia)或黃色桿菌屬(xanthobacter)。埃希氏菌屬可包括大腸桿菌(Escherichia coli)。黃色桿菌屬可包括自養(yǎng)黃色桿菌。

對(duì)于重組微生物，細(xì)胞色素P450可以是任意細(xì)胞色素P450，只要其從微生物中的基因表達(dá)為具有單加氧酶活性。細(xì)胞色素P450可以是細(xì)菌P450。細(xì)胞色素P450蛋白可以屬于EC 1.14.15.1或EC 1.14.14.1。細(xì)胞色素P450蛋白可以是P450_Cam或P450_BM3。P450_Cam可源自惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)PpG786。P450_BM3可源自巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)(ATCC14581)。細(xì)胞色素P450蛋白可以是CamA,CamB和CamC的復(fù)合物。CamA, CamB和CamC可分別具有SEQ ID NO:37,39和41的氨基酸序列。編碼CamA,CamB和CamC的基因可分別具有SEQ ID NO:36,38和40的核苷酸序列。

P450_BM3可以是具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。編碼P450_BM3的基因可具有SEQ ID NO:42的核苷酸序列。

所述基因可包含SEQ ID NO:36,38,40和42的核苷酸序列的一種或多種。

重組微生物可具有增加以下酶水平的遺傳修飾，所述酶催化NADPH生產(chǎn)反應(yīng)以通過(guò)該反應(yīng)增加胞內(nèi)NADPH水平。所述遺傳修飾包括內(nèi)源基因的擴(kuò)增和外來(lái)基因的引入。所述酶可以是屬于EC 1.1.1.49的蛋白質(zhì)。該酶可以是葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD或G6PDH)。重組微生物可進(jìn)一步包含編碼G6PDH的外來(lái)基因。

對(duì)于重組微生物，所述微生物可包含一種或更多種，例如2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、10種以上、或50種以上的編碼具有羥化酶活性的蛋白質(zhì)的外來(lái)基因。當(dāng)所述微生物中包括多種基因時(shí)，基因可以彼此不同或它們可包含相同基因的多個(gè)拷貝。基因可以整合到微生物的基因組中，或者獨(dú)立于基因組。

重組微生物可以降低樣品中CH_nF_4-n(其中n是0至3的整數(shù))(下文稱為“氟化甲烷”)的濃度。該降低可以通過(guò)將羥基基團(tuán)引入氟化甲烷的碳(通過(guò)蛋白質(zhì)作用于其C-F或C-H鍵)或通過(guò)積累微生物細(xì)胞內(nèi)部的氟化甲烷來(lái)實(shí)施。進(jìn)一步地，降低可包括切割CH_nF_4-n的C-F鍵，將CH_nF_4-n轉(zhuǎn)化成其他材料，或CH_nF_4-n的胞內(nèi)積累。樣品可以是液態(tài)或氣態(tài)。樣品可以是工業(yè)廢水或廢氣。樣品可以是包含氟化甲烷的任何樣品。氟化甲烷可包含CF₄、CHF₃、CH₂F₂、CH₃F、或其混合物。

所述重組微生物可包含編碼選自下組的具有羥化酶活性的一種或多種蛋白質(zhì)的外來(lái)基因：源自自養(yǎng)黃色桿菌的鹵代烷脫鹵素酶(dhlA)、源自自養(yǎng)黃色桿菌的(S)-2-鹵酸脫鹵素酶(dhlB)、源自惡臭假單胞菌的P450_CAM、源自巨大芽孢桿菌的P450_BM3、和源自莢膜甲基球菌的可溶甲烷單加氧酶(sMMO)。

對(duì)于重組微生物，可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的一般方法將基因引入微生物，例如轉(zhuǎn)化、電穿孔等。

另一個(gè)方面提供了用于降低樣品中CH_nF_4-n(其中n是0至3的整數(shù))濃度的 組合物，所述組合物包含重組微生物、其裂解物、或裂解物的水性級(jí)分，其中所述重組微生物包含一種或多種編碼具有羥化酶活性的蛋白質(zhì)的外來(lái)基因，且所述重組微生物相比于該重組微生物的親本菌株具有增加的羥化酶活性。

對(duì)于組合物，重組微生物、樣品和氟化甲烷與上文所描述的相同。

裂解物指暴露于細(xì)胞外部的微生物內(nèi)容物，其通過(guò)破壞微生物獲得。裂解物可通過(guò)使用酶如蛋白酶和脂肪酶、熱、壓力等破壞微生物來(lái)獲得?！八约?jí)分”可從溶解于水性溶劑的材料獲得。水性溶劑可以是水。在一些實(shí)施方案中，“水性級(jí)分”是全部水性級(jí)分，即用水性溶劑萃取且沒(méi)有從水性級(jí)分進(jìn)一步純化或分離組分的級(jí)分。

對(duì)于組合物，術(shù)語(yǔ)“降低”包括降低樣品中氟化甲烷的濃度或從樣品完全除去氟化甲烷。樣品可以是氣體或液體。樣品可以沒(méi)有微生物。組合物還可包含增加氟化甲烷在培養(yǎng)基或培養(yǎng)物中溶解度的材料。

所述組合物可通過(guò)與樣品接觸來(lái)降低樣品中氟化甲烷的濃度。接觸可在液相或固相進(jìn)行。接觸可以例如通過(guò)使微生物的培養(yǎng)物與樣品在培養(yǎng)期間接觸來(lái)進(jìn)行。培養(yǎng)可以在微生物可增殖的條件下進(jìn)行。

仍在另一個(gè)方面，提供了降低樣品中CH_nF_4-n濃度的方法，所述方法包括使重組微生物、其裂解物、或裂解物的水性級(jí)分與含有CH_nF_4-n(其中n是0至3的整數(shù))的樣品接觸以降低樣品中CH_nF_4-n(其中n是0至3的整數(shù))的濃度，其中所述重組微生物包含一種或多種編碼具有羥化酶活性的蛋白質(zhì)的外來(lái)基因，且所述重組微生物相比于該重組微生物的親本菌株具有增加的羥化酶活性。

對(duì)于所述方法，由于重組微生物包含編碼具有羥化酶活性的蛋白質(zhì)的一種或多種外來(lái)基因，所述微生物相比于該重組微生物的親本菌株具有增加的羥化酶活性，其裂解物、或裂解物的水性級(jí)分、和含CH_nF_4-n(其中n是0至3的整數(shù))的樣品與上文描述的相同。

對(duì)于所述方法，接觸可在液相或固相進(jìn)行。接觸可以例如通過(guò)培養(yǎng)的微生物的培養(yǎng)物與樣品在培養(yǎng)期間接觸來(lái)進(jìn)行。培養(yǎng)可以在其中微生物可增殖的條件下進(jìn)行。接觸可以在密封的容器中實(shí)施。接觸可以在微生物的生長(zhǎng)階段在指數(shù)期或穩(wěn)定期時(shí)實(shí)施。培養(yǎng)可以在需氧或厭氧條件下實(shí)施。接觸可以在其中重組微生物可存活的條件下在密封的容器中實(shí)施。重組微生物可存活的條件可以是重組微生物可增殖的條件或重組微生物可允許處于靜息態(tài) (resting state)的條件。

對(duì)于所述方法，樣品可以是液態(tài)或氣態(tài)。樣品可以是工業(yè)廢水或廢氣。樣品可以包含使樣品與微生物的培養(yǎng)物被動(dòng)接觸，和使樣品與微生物的培養(yǎng)物主動(dòng)接觸。樣品可以例如噴射到微生物的培養(yǎng)物中。亦即，樣品可以噴射到培養(yǎng)基或培養(yǎng)物中。噴射可以是樣品從培養(yǎng)基或培養(yǎng)物的底部噴射到頂部。噴射可以是注入樣品的液滴。

對(duì)于所述方法，接觸可以以分批或連續(xù)方式實(shí)施。接觸可包括例如使新鮮重組微生物、其裂解物或裂解物的水性級(jí)分與降低中獲得的樣品接觸，其中所述重組微生物包含一種或多種編碼具有羥化酶活性的蛋白質(zhì)的外來(lái)基因，且所述重組微生物相比于該重組微生物的親本菌株具有增加的羥化酶活性。與新鮮微生物、其裂解物或裂解物的水性級(jí)分的接觸可以實(shí)施兩次或更多次，例如兩次、三次、五次或十次或更多?？梢猿掷m(xù)或重復(fù)接觸直至樣品中氟化甲烷的濃度達(dá)到期望的降低的濃度。

根據(jù)一個(gè)方面的重組微生物可用于除去樣品中的CH_nF_4-n。

根據(jù)另一個(gè)方面的組合物可用于除去樣品中的CH_nF_4-n。

根據(jù)又一個(gè)方面的降低樣品中CH_nF_4-n濃度的方法可用于有效降低樣品中CH_nF_4-n的濃度。

現(xiàn)將對(duì)實(shí)施方案進(jìn)行具體提述，其例子在所附附圖中示例，其中類似的參照編號(hào)貫穿全文指代類似的要素。在此方面，當(dāng)前實(shí)施方案可以具有不同的形式且不應(yīng)理解為局限于本文中列出的描述。因此，僅在下文通過(guò)參照附圖描述實(shí)施方案來(lái)解釋各方面。

下文中，本發(fā)明將參照實(shí)施例更詳細(xì)地描述。然而，這些實(shí)施例僅用于例示性目的，且本發(fā)明的范圍不意圖受這些實(shí)施例限制。

實(shí)施例

實(shí)施例1：通過(guò)引入脫鹵素酶的大腸桿菌分解三氟甲

(1)將脫鹵素酶基因引入大腸桿菌

(1.1)dhlA和dhlB基因的引入

選擇自養(yǎng)黃色桿菌GJ10的鹵代烷脫鹵素酶(dhlA)和(S)-2-鹵酸脫鹵素酶(dhlB)作為具有分解含氟烴的活性的酶。自養(yǎng)黃色桿菌GJ10購(gòu)自德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(DSMZ)。

將編碼鹵代烷脫鹵素酶(dhlA)的基因(SEQ ID NO:3)和編碼(S)-2-鹵酸脫鹵素酶(dhlB)的基因(SEQ ID NO:4)分別插入pET28a載體(Novagen)的NdeI和HindIII位點(diǎn)，從而獲得表達(dá)dhlA的載體pET28a_dhlA，和表達(dá)dhlB的載體pET28a_dhlB。將這些載體分別引入大腸桿菌中，然后通過(guò)測(cè)序確認(rèn)其引入。引入鹵代烷脫鹵素酶的大腸桿菌和引入(S)-2-鹵酸脫鹵素酶的大腸桿菌分別稱為大腸桿菌_dhlA和大腸桿菌_dhlB。

(1.2)CfrA基因的引入

將編碼脫鹵桿菌菌種(Dehalobacter sp.)CF的氯仿還原性脫鹵素酶(CfrA)的基因(SEQ ID NO:56)插入pMALc2載體(New England Biolabs Inc.)的EcoRI位點(diǎn)以獲得表達(dá)CrfA的載體pMALc2-CfrA。將該載體引入大腸桿菌BL21Star中，且其引入通過(guò)測(cè)序確認(rèn)。引入CfrA基因的大腸桿菌稱為大腸桿菌BL21star/pMALc2-CfrA。

(2)通過(guò)引入鹵代烷脫鹵素酶的大腸桿菌分解三氟甲

將在第(1)部分中獲得的大腸桿菌_dhlA和大腸桿菌_dhlB分別以2x10⁹個(gè)細(xì)胞/ml的密度置于含M9培養(yǎng)基的搖動(dòng)反應(yīng)器(Daihan Labtech)中，并在30℃在230rpm的搖動(dòng)下與初始濃度為頂空體積中200ppm(見(jiàn)圖1A)或600ppm(僅對(duì)大腸桿菌_dhlA實(shí)施：見(jiàn)圖1B)的CHF₃一起在搖動(dòng)培養(yǎng)箱(Daihan Labtech)中溫育48小時(shí)。然后，分析頂空中CHF₃的量。為了分析，使用注射器從頂空收集0.5ml并注射到GC(Agilent 7890,Palo Alto,CA,USA)。注射的CHF₃經(jīng)由CP-PoraBOND Q柱(25m長(zhǎng)度，0.32mm i.d.，5um膜厚度，Agilent)分離，并通過(guò)MSD(Agilent 5973,Palo Alto,CA,USA)分析CHF₃濃度的變化。作為載體氣體使用氦氣，并以1.5ml/min的流速應(yīng)用于柱。GC條件如下：入口溫度為250℃，初始溫度維持在40℃達(dá)2分鐘，且溫度以20℃/min的速率升至290℃。MS條件如下：電離能量為70eV，界面溫度為280℃，離子源溫度為230℃，和四極(quadrupole)溫度為150℃。除非另外提述，對(duì)氣體如CHF₃,CHCl₃和CF₄的分析通過(guò)使用上述方法進(jìn)行。作為對(duì)照組，將200ppm的CHF₃在相同條件下在沒(méi)有細(xì)胞時(shí)溫育，然后測(cè)量。M9培養(yǎng)基包含0.015g/l的CaCl₂，6g/l的Na₂HPO₄，3g/l的KH₂PO₄，0.5g/l的NaCl，1g/l的NH₄Cl，0.5g/l的MgSO₄，和2.0g/l葡萄糖。

圖1A顯示通過(guò)重組大腸桿菌分解三氟甲的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如圖1A中顯示的， 大腸桿菌_dhlA和大腸桿菌_dhlB分別顯示三氟甲量中6％和7％降低。圖1A的這一結(jié)果表明鹵代烷脫鹵素酶和(S)-2-鹵酸脫鹵素酶具有三氟甲分解能力。

圖1B顯示通過(guò)引入鹵代烷脫鹵素酶的大腸桿菌分解三氟甲的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如圖1B中顯示的，與對(duì)照組相比，大腸桿菌_dhlA顯示三氟甲量中12.4％的降低。圖1B的這一結(jié)果表明當(dāng)三氟甲烷的初始濃度更高時(shí)，引入鹵代烷脫鹵素酶的大腸桿菌每小時(shí)能分解更大量的三氟甲烷。

(3)通過(guò)引入鹵代烷脫鹵素酶的大腸桿菌分解全氟甲烷

檢查引入自養(yǎng)黃色桿菌GJ10來(lái)源的鹵代烷脫鹵素酶的大腸桿菌是否具有分解全氟甲烷(CF₄)的能力。

以與第(2)部分中相同的方式來(lái)分析CF₄濃度的降低，只是使用大腸桿菌_dhlA且以頂空濃度600ppm來(lái)添加CF₄。

圖2A顯示通過(guò)引入鹵代烷脫鹵素酶的大腸桿菌分解全氟甲烷的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如圖2A中顯示的，與對(duì)照組相比，大腸桿菌_dhlA顯示全氟甲烷量中的7.6％降低。圖2A的這一結(jié)果表明引入鹵代烷脫鹵素酶的大腸桿菌具有全氟甲烷分解能力。

另外，將第(1)部分中制備的大腸桿菌BL21star/pMALc2-CfrA接種到搖動(dòng)培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)基中，并在存在0.2mM IPTG和1μM鈷胺素輔因子的情況下在20℃溫育20小時(shí)以誘導(dǎo)CfrA基因的表達(dá)。從培養(yǎng)物獲得細(xì)胞團(tuán)粒，并裂解于作為裂解溶液的PBS緩沖液(Sigma-Aldrich Inc.)中以獲得裂解物。從裂解物獲得粗提取物。接著，將2mM Ti(III)-NTA，2mM甲基紫精(methylviologen)和5ml粗提取物添加到血清瓶，并以1,000ppm的頂空濃度添加CF₄。將該瓶密封并在30℃溫育預(yù)定的時(shí)間。以相同的方式準(zhǔn)備陰性對(duì)照(NC)，只是使用大腸桿菌BL21star。結(jié)果，最終分解了12％CF₄。細(xì)胞的比活性為0.0044單位/g細(xì)胞。對(duì)CF4的分析與上文所述相同。

圖2B顯示通過(guò)大腸桿菌BL21star/pMALc2-CfrA樣品中CF4濃度的變化，其使用陰性對(duì)照值標(biāo)準(zhǔn)化。在圖2B中，△峰面積代表CfrA面積-陰性對(duì)照面積，且分解率代表△峰面積/陰性對(duì)照值。

實(shí)施例2：表達(dá)P450_CAM基因的重組大腸桿菌和通過(guò)使用其從樣品中除去鹵代甲烷

在本實(shí)施例中，制備表達(dá)P450_CAM基因的重組大腸桿菌，并檢查通過(guò)使用其除去樣品中鹵代甲烷即CHF₃,CF₄或CHCl₃的效果。

(1)制備表達(dá)P450_CAM基因的重組大腸桿菌

作為P450_CAM基因，從惡臭假單胞菌PpG786菌株的CAM質(zhì)粒分別擴(kuò)增camC、camA和camB基因。camC、camA和camB基因具有SEQ ID NO:40,36和38的核苷酸序列，且編碼SEQ ID NO:41,37和39的氨基酸序列。具體而言，在LB培養(yǎng)基中在30℃以230rpm過(guò)夜培養(yǎng)惡臭假單胞菌PpG786菌株DSM7162，然后使用總DNA提取試劑盒(Invitrogen Biotechnology)分離CAM質(zhì)粒。使用CAM質(zhì)粒作為模板和具有SEQ ID NO:46和47的核苷酸序列的一組引物；具有SEQ ID NO:48和49的核苷酸序列的一組引物；和具有SEQ ID NO:50和51的核苷酸序列的一組引物具有SEQ ID NO:46和47的核苷酸序列的一組引物來(lái)實(shí)施PCR以分別擴(kuò)增和獲得camA、camB和camC基因。

使用InFusion克隆試劑盒(Clontech Laboratories,Inc.)，將通過(guò)使用具有SEQ ID NO:46和47的核苷酸序列的一組引物的PCR擴(kuò)增的camC基因與用限制酶NcoI和HindII消化的pETDuet(Novagen，貨號(hào)71146-3)連接來(lái)制備pETDuet-camC載體。進(jìn)一步地，將制備的pETDuet-camC載體用限制酶NdeI和XhoI消化，并使用InFusion克隆試劑盒(Clontech Laboratories,Inc.)與擴(kuò)增的camA和camB基因片段連接來(lái)制備pETDuet-camC-camAB載體。

圖3顯示pETDuet-camC-camAB載體的載體圖譜。

接著，通過(guò)熱休克方法(Sambrook,J&Russell,D.W.,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)使大腸桿菌BL21菌株引入制備的pETDuet-camC-camAB載體，然后在含有氨芐青霉素(100μg/mL)的LB板上培養(yǎng)。選擇顯示氨芐青霉素抗性的菌株。最后，將如此選出的菌株命名為重組大腸桿菌BL21/pETDuet-camC-camAB。

(2)通過(guò)表達(dá)P450_CAM基因的重組大腸桿菌從樣品除去CHF₃或CHCl₃的效果

在此部分中，檢查在第(1)部分中制備的引入P450_CAM基因的大腸桿菌BL21/pETDuet-camC-camAB菌株是否影響從樣品除去CHF₃或CHCl₃。具體而言，在30℃在以230rpm攪拌下在Terrific Broth(TB)培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌BL21/pETDuet-camC-camAB。在OD₆₀₀約0.5時(shí)，向其添加0.5mM的IPTG，接著在25℃在以230rpm攪拌下過(guò)夜培養(yǎng)。收獲細(xì)胞并懸浮于M9培養(yǎng)基中至細(xì)胞密度為OD₆₀₀為2.5。將10ml的該細(xì)胞懸液添加至60ml血清瓶，然后將該瓶密封。TB培養(yǎng)基包含12g的胰化蛋白胨、24g的酵母提取物、5g的甘油和 89mM磷酸鹽緩沖劑每1L蒸餾水。

接著，使用注射器經(jīng)由血清瓶蓋的橡膠塞注射氣相CHF₃至其頂空濃度為200ppm。進(jìn)一步地，使用注射器經(jīng)由血清瓶蓋的橡膠塞注射液相CHCl₃至其在培養(yǎng)基中濃度為0.02mM。之后，將血清瓶在30℃和200rpm溫育18小時(shí)至152小時(shí)，同時(shí)攪拌。每種實(shí)驗(yàn)一式三份實(shí)施。在預(yù)定的時(shí)間分析頂空氣體。

圖4顯示當(dāng)在與含CHF₃的氣體接觸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌BL21/pETDuet-camC-camAB時(shí)CHF₃頂空濃度隨時(shí)間的變化。

圖5A顯示當(dāng)在含CHCl₃的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌BL21/pETDuet-camC-camAB時(shí)CHCl₃頂空濃度隨時(shí)間的變化。在圖4、5A和5B中，NC表示陰性對(duì)照組，而‘CAM’表示通過(guò)使用大腸桿菌BL21/pETDuet-camC-camAB實(shí)施的實(shí)驗(yàn)。如圖4中顯示的，當(dāng)培養(yǎng)大腸桿菌BL21/pETDuet-camC-camAB達(dá)62小時(shí)和152小時(shí)時(shí)，與對(duì)照組相比，CHF₃的頂空濃度降低了約5.62％和約17.3％。進(jìn)一步地，如圖5A中顯示的，當(dāng)培養(yǎng)大腸桿菌BL21/pETDuet-camC-camAB達(dá)18小時(shí)時(shí)，與對(duì)照組相比，CHCl₃的頂空濃度降低了約14.8％。

(3)通過(guò)表達(dá)P450_CAM基因的重組大腸桿菌除去樣品中CF₄的效果

在此部分中，檢查在第(1)部分中制備的引入P450_CAM基因的大腸桿菌BL21/pETDuet-camC-camAB菌株是否影響樣品中CF₄的除去。

以與第(2)部分中針對(duì)CHF₃實(shí)施的方法相同的方式實(shí)施實(shí)驗(yàn)，只是使用CF₄而不是CHF₃，并使用注射器經(jīng)由血清瓶蓋的橡膠塞注射氣相CF₄至其頂空濃度為1000ppm。之后，以相同方式實(shí)施實(shí)驗(yàn)，只是將血清瓶在30℃和200rpm溫育7天，同時(shí)攪拌。結(jié)果與圖5B中相同。

圖5B顯示當(dāng)在與含CF₄的氣體接觸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌BL21/pETDuet-camC-camAB時(shí)CF₄頂空濃度隨時(shí)間的變化。如圖5B中顯示的，當(dāng)培養(yǎng)大腸桿菌BL21/pETDuet-camC-camAB達(dá)7天時(shí)，與對(duì)照組相比，CF₄的頂空濃度降低了約3.57％。

實(shí)施例3：表達(dá)P450_BM3基因的重組大腸桿菌和通過(guò)使用其除去樣品中的鹵代甲烷

在本實(shí)施例中，制備表達(dá)P450_BM3基因的重組大腸桿菌，并檢查通過(guò)使用其除去樣品中鹵代甲烷即CHF₃、CF₄或CHCl₃的效果。

(1)制備表達(dá)P450_BM3基因的重組大腸桿菌

擴(kuò)增巨大芽孢桿菌(ATCC 14581)菌株的P450_BM3基因。P450_BM3基因具有SEQ ID NO:42的核苷酸序列，且編碼SEQ ID NO:43的氨基酸序列。具體而言，在LB培養(yǎng)基中在30℃在230rpm攪拌下過(guò)夜培養(yǎng)巨大芽孢桿菌(ATCC14581)，然后使用總DNA提取試劑盒(Invitrogen Biotechnology)分離基因組DNA。使用該基因組DNA作為模板和具有SEQ ID NO:52和53的核苷酸序列的一組引物實(shí)施PCR以擴(kuò)增和獲得P450_BM3基因。使用InFusion克隆試劑盒(Clontech Laboratories,Inc.)，將如此擴(kuò)增的P450_BM3基因與用限制酶NcoI和XhoI消化的pET28a(Novagen，貨號(hào)69864-3)連接來(lái)制備pET28a-P450_BM3載體。圖6顯示pET28a-P450_BM3載體的載體圖譜。

進(jìn)一步地，為了增加胞內(nèi)NADPH水平，擴(kuò)增編碼大腸桿菌K12(MG1655)的葡萄糖6-磷酸脫氫酶的zwf基因。Zwf基因具有SEQ ID NO:44的核苷酸序列，且編碼SEQ ID NO:45的氨基酸序列。詳細(xì)而言，在LB培養(yǎng)基中在30℃在230rpm攪拌下過(guò)夜培養(yǎng)大腸桿菌，然后使用總DNA提取試劑盒(Invitrogen Biotechnology)分離基因組DNA。使用該基因組DNA作為模板和具有SEQ ID NO:54和55的核苷酸序列的一組引物實(shí)施PCR以擴(kuò)增和獲得zwf基因。使用InFusion克隆試劑盒(Clontech Laboratories,Inc.)，將如此擴(kuò)增的zwf基因與用限制酶NcoI和SacI消化的pACYCDuet(Novagen，貨號(hào)71147-3)連接來(lái)制備pACYCDuet-zwf載體。圖7顯示pACYCDuet-zwf載體的載體圖譜。

然后，通過(guò)熱休克方法使大腸桿菌BL21菌株引入制備的pET28a-P450_BM3載體，然后在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB板上培養(yǎng)。選擇顯示卡那霉素抗性的菌株。最后，將如此選出的菌株命名為重組大腸桿菌BL21/pET28a-P450_BM3。

進(jìn)一步地，通過(guò)熱休克方法使大腸桿菌BL21菌株引入制備的pET28a-P450_BM3載體和pACYCDuet-zwf載體，然后在含有卡那霉素(50μg/mL)和氯霉素(35μg/mL)的LB板上培養(yǎng)。選擇顯示卡那霉素抗性和氯霉素抗性的菌株。最后，將如此選出的菌株命名為重組大腸桿菌BL21/pET28a-P450_BM3+pACYCDuet-zwf。

(2)通過(guò)表達(dá)P450_BM3基因的重組大腸桿菌除去樣品中CHF₃或CHCl₃的效果

在此部分中，檢查在第(1)部分中制備的引入P450_BM3基因的重組大腸桿菌BL21/pET28a-P450_BM3菌株或BL21/pET28a-P450_BM3+pACYCDuet-zwf菌株 是否影響樣品中CHF₃或CHCl₃的除去。

具體而言，在30℃在以230rpm攪拌下在TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌BL21/pET28a-P450_BM3或BL21/pET28a-P450_BM3+pACYCDuet-zwf菌株。在OD₆₀₀約0.5時(shí)，向其添加0.2mM的IPTG，接著在25℃和230rpm過(guò)夜培養(yǎng)。收獲細(xì)胞并懸浮于M9培養(yǎng)基中至細(xì)胞密度為OD₆₀₀為2.5。將10ml的該細(xì)胞懸液添加至60ml血清瓶，然后將該瓶密封。TB培養(yǎng)基和M9培養(yǎng)基與實(shí)施例2中描述的那些相同。

接著，使用注射器經(jīng)由血清瓶蓋的橡膠塞注射氣相CHF₃至其頂空濃度為200ppm。進(jìn)一步地，使用注射器經(jīng)由血清瓶蓋的橡膠塞注射液相CHCl₃至其在培養(yǎng)基中濃度為0.02mM。之后，將血清瓶在30℃和230rpm溫育15小時(shí)至142小時(shí)，同時(shí)攪拌。每種實(shí)驗(yàn)一式三份實(shí)施。

在與實(shí)施例2的(2)相同的條件下，在培養(yǎng)期間以預(yù)定的時(shí)間間隔分析血清瓶中CHF₃或CHCl₃的頂空濃度。

圖8顯示當(dāng)在與含CHF₃的氣體接觸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌BL21/pET28a-P450_BM3或BL21/pET28a-P450_BM3+pACYCDuet-zwf菌株達(dá)142小時(shí)時(shí)CHF₃頂空濃度隨時(shí)間的變化。

圖9A顯示當(dāng)在含CHCl₃的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌BL21/pET28a-P450_BM3達(dá)15小時(shí)時(shí)CHCl₃頂空濃度的變化。在圖8、9A和9B中，NC表示陰性對(duì)照組，‘BM3’表示通過(guò)使用大腸桿菌BL21/pET28a-P450_BM3實(shí)施的實(shí)驗(yàn)，而‘BM3+Zwf’表示通過(guò)使用大腸桿菌BL21/pET28a-P450_BM3+pACYCDuet-zwf實(shí)施的實(shí)驗(yàn)。如圖8中顯示的，當(dāng)培養(yǎng)大腸桿菌BL21/pET28a-P450_BM3和大腸桿菌BL21/pET28a-P450_BM3+pACYCDuet-zwf達(dá)70小時(shí)和142小時(shí)時(shí)，與對(duì)照組相比，CHF₃的頂空濃度對(duì)于70小時(shí)分別降低了約3.93％和4.57％，對(duì)于142小時(shí)分別降低了約4.15％和11.03％。進(jìn)一步地，如圖9A中顯示的，當(dāng)其培養(yǎng)15小時(shí)時(shí)，與對(duì)照組相比，CHCl₃的頂空濃度降低了約4.1％。

(3)通過(guò)表達(dá)P450_BM3基因的重組大腸桿菌除去樣品中CF₄的效果

在此部分中，檢查在第(1)部分中制備的引入P450_BM3基因的重組大腸桿菌BL21/pET28a-P450_BM3菌株是否影響樣品中CF₄的除去。

以與第(2)部分中針對(duì)CHF₃實(shí)施的方法相同的方式實(shí)施實(shí)驗(yàn)，只是使用CF₄而不是CHF₃，并使用注射器經(jīng)由血清瓶蓋的橡膠塞注射氣相CF₄至其頂空濃度為1000ppm。之后，以相同方式實(shí)施實(shí)驗(yàn)，只是將血清瓶在30℃和200 rpm溫育7天，同時(shí)攪拌。結(jié)果與圖9B中相同。

圖9B顯示當(dāng)在與含CF₄的氣體接觸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌BL21/pET28a-P450_BM3達(dá)7天時(shí)CF₄頂空濃度隨時(shí)間的變化。如圖9B中顯示的，當(dāng)培養(yǎng)大腸桿菌BL21/pET28a-P450_BM達(dá)7天時(shí)，與對(duì)照組相比，CF₄的頂空濃度降低了約3.03％。

實(shí)施例4：表達(dá)sMMO基因的重組大腸桿菌和通過(guò)使用其除去樣品中的鹵代甲烷

在本實(shí)施例中，制備表達(dá)sMMO基因的重組大腸桿菌，并檢查通過(guò)使用其除去樣品中鹵代甲烷即CHF₃,CF₄或CHCl₃的效果。

(1)制備表達(dá)sMMO基因的重組大腸桿菌

從莢膜甲基球菌(Bath)菌株分別擴(kuò)增sMMO基因，即mmoX,mmoY,mmoZ,mmoB,mmoC,mmoD和mmoG基因。mmoX,mmoY,mmoZ,mmoB,mmoC,mmoD和mmoG基因分別具有SEQ ID NO:6,8,10,12,14,16和18的核苷酸序列，且分別編碼SEQ ID NO:5,7,9,11,13,15和17的氨基酸序列。

具體而言，使用莢膜甲基球菌(Bath)菌株(ATCC 33009D-5)的染色體DNA作為模板和具有SEQ ID NO:19和20的核苷酸序列的一組引物實(shí)施PCR以擴(kuò)增SEQ ID NO:35的區(qū)域，其包含所有mmoX,mmoY,mmoZ,mmoB,mmoC和mmoD基因。使用InFusion克隆試劑盒(Clontech Laboratories,Inc.)，將擴(kuò)增的基因片段與用限制酶NcoI和XhoI消化的pET28a(Novagen，貨號(hào)69864-3)連接來(lái)制備pET28a-mmoXYBZDC載體。圖10A顯示pET28a-mmoXYBZDC載體的載體圖譜。

進(jìn)一步地，為了使用大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)表達(dá)sMMO基因，分別擴(kuò)增mmoX,mmoY,mmoZ,mmoB,mmoC和mmoD，然后插入表達(dá)載體中。使用mmoX基因片段和mmoY基因片段作為模板和具有SEQ ID NO:21和24的核苷酸序列的一組引物擴(kuò)增包含mmoX和mmoY基因的區(qū)域，所述mmoX基因片段通過(guò)使用具有SEQ ID NO:21和22的核苷酸序列的一組引物的PCR擴(kuò)增，所述mmoY基因片段通過(guò)使用具有SEQ ID NO:23和24的核苷酸序列的一組引物的PCR擴(kuò)增。使用InFusion克隆試劑盒(Clontech Laboratories,Inc.)，將如此擴(kuò)增的基因片段與用限制酶NcoI和HindIII消化的pETDuet(Novagen，貨號(hào)71146-3)連接來(lái)制備pETDuet-mmoXY載體。進(jìn)一步地，使用mmoZ基因片段和mmoD基因片段作為模板和具有SEQ ID NO:25和28的核 苷酸序列的一組引物擴(kuò)增包含mmoZ和mmoD基因的區(qū)域，所述mmoZ基因片段通過(guò)使用具有SEQ ID NO:25和26的核苷酸序列的一組引物的PCR擴(kuò)增，所述mmoD基因片段通過(guò)使用具有SEQ ID NO:27和28的核苷酸序列的一組引物的PCR擴(kuò)增。使用InFusion克隆試劑盒(Clontech Laboratories,Inc.)，將如此擴(kuò)增的基因片段與用限制酶NdeI和XhoI消化的pETDuet-mmoXY連接來(lái)制備pETDuet-mmoXY-ZD載體。圖10B顯示pETDuet-mmoXY-ZD載體的載體圖譜。

使用mmoB基因片段和mmoC基因片段作為模板和具有SEQ ID NO:29和32的核苷酸序列的一組引物擴(kuò)增包含mmoB和mmoC基因的區(qū)域，所述mmoB基因片段通過(guò)使用具有SEQ ID NO:29和30核苷酸序列的一組引物的PCR擴(kuò)增，所述mmoC基因片段通過(guò)使用具有SEQ ID NO:31和32的核苷酸序列的一組引物的PCR擴(kuò)增。使用InFusion克隆試劑盒(Clontech Laboratories,Inc.)，將如此擴(kuò)增的基因片段與用限制酶NdeI和EcoRV消化的pACYCDuet(Novagen，貨號(hào)71147-3)連接來(lái)制備pACYCDuet-mmoBC載體。圖10C顯示pACYCDuet-mmoBC載體的載體圖譜。

使用InFusion克隆試劑盒(Clontech Laboratories,Inc.)，將通過(guò)使用具有SEQ ID NO:33和34的核苷酸序列的一組引物的PCR擴(kuò)增的mmoG基因片段與用限制酶NcoI和HindIII消化的pACYCDuet(Novagen，貨號(hào)71147-3)連接來(lái)制備pACYCDuet-mmoG載體。進(jìn)一步地，使用mmoB基因片段和mmoC基因片段作為模板和具有SEQ ID NO:29和32的核苷酸序列的一組引物擴(kuò)增包含mmoB和mmoC基因的區(qū)域，所述mmoB基因片段通過(guò)使用具有SEQ ID NO:29和30核苷酸序列的一組引物的PCR擴(kuò)增，所述mmoC基因片段通過(guò)使用具有SEQ ID NO:31和32的核苷酸序列的一組引物的PCR擴(kuò)增。使用InFusion克隆試劑盒(Clontech Laboratories,Inc.)，將如此擴(kuò)增的基因片段與用限制酶NdeI和EcoRV消化的pACYCDuet-mmoG連接來(lái)制備pACYCDuet-mmoG-BC載體。圖10D顯示pACYCDuet-mmoG-BC載體的載體圖譜。

接著，通過(guò)熱休克方法使大腸桿菌BL21菌株分別引入制備的pETDuet-mmoXY-ZD載體和pACYCDuet-mmoBC載體，pETDuet-mmoXY-ZD和pACYCDuet-mmoG-BC載體，和pET28a-mmoXYBZDC載體中的每種，然后在含有100μg/mL氨芐青霉素和35μg/mL氯霉素或50μg/mL卡那霉素的LB板上培養(yǎng)。選擇顯示氨芐青霉素抗性和氯霉素或卡那霉素抗性的菌株。最后， 將如此選出的3種菌株命名為重組大腸桿菌BL21/pETDuet-mmoXY-ZD+pACYCDuet-mmoBC,BL21/pETDuet-mmoXY-ZD+pACYCDuet-mmoG-BC和BL21/pET28a-mmoXYBZDC。

(2)通過(guò)表達(dá)sMMO基因的重組大腸桿菌除去樣品中CHF₃或CHC_l3的效果

在此部分中，檢查在第(1)部分中制備的引入sMMO基因的重組大腸桿菌BL21/pETDuet-mmoXY-ZD+pACYCDuet-mmoBC,BL21/pETDuet-mmoXY-ZD+pACYCDuet-mmoG-BC和BL21/pET28a-mmoXYBZDC是否影響除去樣品中的CHF₃或CHCl₃。作為對(duì)照組，使用引入空載體(不含sMMO基因)的大腸桿菌BL21/pETDuet+pACYCDuet或BL21/pET28a。

具體而言，在30℃和230rpm在攪拌下在Terrific Broth(TB)培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組大腸桿菌BL21/pETDuet-mmoXY-ZD+pACYCDuet-mmoBC、BL21/pETDuet-mmoXY-ZD+pACYCDuet-mmoG-BC和BL21/pET28a-mmoXYBZDC的每種。在OD₆₀₀約0.5時(shí)，向其添加0.1mM的IPTG和0.1mg/ml的檸檬酸鐵、0.1mg/ml的硫酸亞鐵、0.1mg/ml的檸檬酸鐵銨和1mM半胱氨酸，接著在25℃和230rpm過(guò)夜培養(yǎng)。對(duì)于每種重組大腸桿菌，收獲細(xì)胞并懸浮于含有4g/L葡萄糖的M9培養(yǎng)基中至細(xì)胞密度為OD₆₀₀為2.5。將10ml的每種細(xì)胞懸液添加至60ml血清瓶，然后將該瓶密封。

接著，在CHF₃反應(yīng)的情況中，使用注射器經(jīng)由血清瓶蓋的橡膠塞注射氣相CHF₃至其頂空濃度為1000ppm。另外，在CHCl₃反應(yīng)的情況中，使用注射器經(jīng)由血清瓶蓋的橡膠塞注射液相CHCl₃至其在培養(yǎng)基中濃度為0.02mM。之后，在30℃和200rpm，將CHF₃反應(yīng)的血清瓶溫育94小時(shí)，將CHCl₃反應(yīng)的血清瓶溫育25小時(shí)，同時(shí)攪拌。每種實(shí)驗(yàn)一式三份實(shí)施。

在與實(shí)施例2的(2)相同的條件下，在溫育期間在預(yù)定的時(shí)間后，分析血清瓶中CHF₃或CHCl₃的頂空濃度。

圖11顯示當(dāng)在與含CHF₃的氣體接觸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組大腸桿菌時(shí)CHF₃頂空濃度的變化。在圖11中，1表示對(duì)照組，而2至4表示分別使用重組大腸桿菌BL21/pETDuet-mmoXY-ZD+pACYCDuet-mmoBC,BL21/pETDuet-mmoXY-ZD+pACYCDuet-mmoG-BC和 BL21/pET28a-mmoXYBZDC實(shí)施的實(shí)驗(yàn)。如圖11中顯示的，當(dāng)重組大腸桿菌BL21/pETDuet-mmoXY-ZD+pACYCDuet-mmoBC培養(yǎng)達(dá)94小時(shí)時(shí)，與對(duì)照組相比，CHF₃的頂空濃度降低了約10％。另外，當(dāng)重組大腸桿菌BL21/pETDuet-mmoXY-ZD+pACYCDuet-mmoG-BC和BL21/pET28a-mmoXYBZDC的每種培養(yǎng)達(dá)94小時(shí)時(shí)，與對(duì)照組相比，CHF₃的頂空濃度降低了約15％。

圖12A顯示當(dāng)在含CHCl₃的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組大腸桿菌時(shí)CHCl₃頂空濃度的變化。在圖12A中，1至4與圖11中描述的相同。如圖12A顯示的，當(dāng)重組大腸桿菌BL21/pETDuet-mmoXY-ZD+pACYCDuet-mmoBC和BL21/pETDuet-mmoXY-ZD+pACYCDuet-mmoG-BC的每種培養(yǎng)達(dá)25小時(shí)時(shí)，與對(duì)照組相比，CHCl₃的頂空濃度降低了約20％。此外，當(dāng)BL21/pET28a-mmoXYBZDC培養(yǎng)達(dá)25小時(shí)時(shí)，與對(duì)照組相比，CHCl₃的頂空濃度也降低了與其類似的水平。

(3)通過(guò)表達(dá)sMMO基因的重組大腸桿菌除去樣品中CF₄的效果

在此實(shí)施例中，檢查在第(1)部分中制備的引入sMMO基因的重組大腸桿菌BL21/pET28a-mmoXYBZDC是否影響樣品中CF₄的除去。作為對(duì)照組，使用引入空載體(不含sMMO基因)的大腸桿菌BL21/pET28a。

以與第(2)部分中針對(duì)CHF₃實(shí)施的方法相同的方式實(shí)施實(shí)驗(yàn)，只是使用CF₄而不是CHF₃，并使用注射器經(jīng)由血清瓶蓋的橡膠塞注射氣相CF₄至其頂空濃度為1000ppm，之后，將血清瓶在30℃和200rpm溫育7天，同時(shí)攪拌。結(jié)果與圖12B中相同。

圖12B顯示當(dāng)在與含CF₄的氣體接觸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組大腸桿菌BL21/pET28a-mmoXYBZDC達(dá)7天時(shí)CF₄頂空濃度的變化。在圖12B中，NC表示陰性對(duì)照組，而‘MMO’表示通過(guò)使用大腸桿菌BL21/pET28a-mmoXYBZDC實(shí)施的實(shí)驗(yàn)。如圖12B中顯示的，當(dāng)重組大腸桿菌BL21/pET28a-mmoXYBZDC培養(yǎng)達(dá)7天時(shí)，與對(duì)照組相比，CF₄的頂空濃度降低了約3.42％。

實(shí)施例5：通過(guò)引入脫鹵素酶的自養(yǎng)黃色桿菌分解四氟甲烷

實(shí)施PCR，其使用購(gòu)自德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)的自養(yǎng)黃色桿菌GJ10的基因組序列作為模板和具有SEQ ID NO:58和59的核苷酸序列的一組引物，并使用In-Fusion HD克隆試劑盒(Clontech)，將如此擴(kuò)增的 dhlA基因(SEQ ID NO:3)引入pTSa載體以制備pTSa_DhlA載體(SEQ ID NO:60)(ORF:2982-3914)。

將如此制備的載體通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化到自養(yǎng)黃色桿菌GJ10菌株中，并將確認(rèn)具有dhlA基因的菌株稱為Xantho_dhlA。在30℃在以230rpm攪拌下在含有50mL M9培養(yǎng)基的250mL塑料燒瓶中過(guò)夜培養(yǎng)該菌株。

將含有10ml M9培養(yǎng)基中2x10⁹個(gè)細(xì)胞/ml的Xantho_dhlA和頂空中600ppm或1000ppm的CF₄的血清瓶在30℃在以230rpm攪拌下在搖動(dòng)培養(yǎng)箱(Daihan Labtech)中溫育48小時(shí)。之后，分析CF₄的頂空濃度。以相同方式準(zhǔn)備陰性對(duì)照，只是在無(wú)細(xì)胞情況下使用頂空濃度為600ppm或1000ppm的CF₄和在相同條件下使用自養(yǎng)黃色桿菌GJ10。結(jié)果在圖13A和13B中給出。在圖13A和13B中，Xantho表示自養(yǎng)黃色桿菌GJ10，Xantho_dhlA表示自養(yǎng)黃色桿菌GJ10Xantho_dhlA，而垂直軸表示峰面積，即△峰面積。

圖13A顯示通過(guò)自養(yǎng)黃色桿菌GJ10對(duì)四氟甲烷的分解。如圖13A顯示的，當(dāng)CF₄的頂空濃度為600ppm時(shí)，與對(duì)照組相比，自養(yǎng)黃色桿菌GJ10將四氟甲烷的量降低了約12.94％。

圖13B顯示通過(guò)自養(yǎng)黃色桿菌GJ10Xantho_dhlA對(duì)四氟甲烷的分解。如圖13B顯示的，當(dāng)CF₄的頂空濃度為1000ppm時(shí)，與對(duì)照組相比，黃色自養(yǎng)桿菌GJ10Xantho_dhlA和黃色自養(yǎng)桿菌GJ10將四氟甲烷的量分別降低了約16.29％和12.04％。因此，與黃色自養(yǎng)桿菌GJ10相比，黃色自養(yǎng)桿菌GJ10Xantho_dhlA顯示顯著有效的CF₄分解。

應(yīng)當(dāng)理解，應(yīng)當(dāng)僅以描述性意義而非為了限制目的考慮本文中描述的例示性實(shí)施方案。每個(gè)實(shí)施方案內(nèi)的特征或方面的描述應(yīng)當(dāng)通常認(rèn)為可用于其它實(shí)施方案中的其它類似的特征或方面。

盡管已參照附圖描述了一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解可對(duì)其中進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)的多種變化而不背離如由權(quán)利要求所限定的精神和范圍。

本文中引用的所有參考文獻(xiàn)，包括出版物，專利申請(qǐng)，和專利在此通過(guò)提及并入，其程度就像每篇參考文獻(xiàn)單獨(dú)且明確指示為通過(guò)提及并入并且在本文中完整列出一樣。

除非本文中另外指示或與上下文清楚地沖突，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)/一種”和“該”及“至少一個(gè)/一種”及類似指代物在描述本發(fā)明的背景中(尤其在所附權(quán)利 要求的背景中)的使用應(yīng)理解為涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)。術(shù)語(yǔ)“至少一個(gè)/種”及伴隨的一批一個(gè)或多個(gè)項(xiàng)(例如，“A和B中的至少一種”)的使用應(yīng)當(dāng)解釋為意指選自列出項(xiàng)的一項(xiàng)(A或B)或兩種或更多種列出項(xiàng)的任何組合(A和B)，除非本文中另有指示或上下文明顯矛盾。術(shù)語(yǔ)“包含”、“具有”、“包括”和“含有”應(yīng)當(dāng)解釋為開(kāi)放式術(shù)語(yǔ)(即意味著“包括但不限于”)，除非另有記錄。本文中數(shù)值范圍的敘述僅意圖充當(dāng)單獨(dú)提及落入范圍內(nèi)的每個(gè)分開(kāi)數(shù)值的簡(jiǎn)寫方法，除非本文中另有指示，并且每個(gè)分開(kāi)數(shù)值就像其單獨(dú)在本文中敘述一樣并入說(shuō)明書?？梢砸匀魏魏线m的次序?qū)嵤┍疚闹忻枋龅乃蟹椒?，除非本文中另有指示或上下文另外明顯矛盾。本文中提供的任何和所有例子，或例示性語(yǔ)言(例如“如”)的使用僅意圖更好闡明本發(fā)明，并且不對(duì)本發(fā)明的范圍造成限制，除非另有要求。說(shuō)明書中的語(yǔ)言不應(yīng)解釋為指示任何不要求保護(hù)的要素為本發(fā)明的實(shí)踐必需的。

本文中描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，包括用于實(shí)施本發(fā)明的發(fā)明人已知的最佳模式。那些優(yōu)選的實(shí)施方案的變型在閱讀前述描述后對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)變得顯而易見(jiàn)。發(fā)明人預(yù)期熟練技術(shù)人員在適當(dāng)時(shí)采用此類變型，并且發(fā)明人意圖本發(fā)明以與本文中的明確描述不同的方式實(shí)施。因而，本發(fā)明包括可適用法律容許的所附權(quán)利要求書中敘述的主題的所有修改和等同方案。此外，本發(fā)明涵蓋其所有可能變型中的上文描述的要素的任何組合，除非本文中另有指示或上下文另外明顯矛盾。