技術(shù)領(lǐng)域：本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用微流芯片方式測(cè)定糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的標(biāo)志分子的含量的方法描述以及相應(yīng)的裝置的制備工藝等。

背景技術(shù)：
：機(jī)體老化過程在生物學(xué)認(rèn)為是屬于正常的生物學(xué)程序設(shè)定的進(jìn)程，但是自從開創(chuàng)了自由基的研究領(lǐng)域之后，逐步認(rèn)識(shí)到在所謂的“老化”進(jìn)程與許多的“疾病”之間存在在于各個(gè)層面的化學(xué)的共通的聯(lián)系。這些方面的進(jìn)展與積累的知識(shí)，提高了對(duì)人類衰老流程的理解。在理解本發(fā)明的工作之前有必要說明的是，利用遺傳學(xué)，生物學(xué)方法進(jìn)行個(gè)體的“老化”的判定與本發(fā)明所涉及的“老化相關(guān)的疾病”(age-associateddiseases)不在同一個(gè)范疇。需要指出的是，我們所關(guān)注的老化以及老化性性疾病，舉例如，老年心血管病，中風(fēng)，癌癥，器官功能衰退，骨關(guān)節(jié)、肌肉勞損，糖尿病并發(fā)癥等，估計(jì)這個(gè)名單還會(huì)繼續(xù)擴(kuò)大，這一類別的“老化”是我們關(guān)注的范疇。具體的是，我們?cè)谶@個(gè)申請(qǐng)例子中只集中在糖尿病有關(guān)的老化的應(yīng)用與說明，而更具體的在于，在本工作與知識(shí)產(chǎn)權(quán)有關(guān)的說明中，本申請(qǐng)披露與糖尿病性質(zhì)的老化進(jìn)程相關(guān)的老化的指標(biāo)的微流控芯片檢測(cè)的技術(shù)細(xì)節(jié)。

近年的一種理論認(rèn)為，慢性病相關(guān)的老化是由許許多多的意外的，隨機(jī)的，無(wú)可避免的“錯(cuò)誤”所產(chǎn)生，這方面的數(shù)學(xué)模型都試圖定量地說明老化的這個(gè)原理，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)工作的貢獻(xiàn)在于對(duì)于這個(gè)產(chǎn)生“錯(cuò)誤”的原因和發(fā)生源提供了生物醫(yī)學(xué)方面的知識(shí)積累，幫助人們理解如何設(shè)計(jì)出來(lái)控制、干預(yù)老化的進(jìn)程。

1956年至今，哈曼(harman，1956，2006)的研究發(fā)現(xiàn)，“老化”其實(shí)是一種自由基介導(dǎo)的慢性損害，可以列入疾病的范疇，這種疾病有多個(gè)病因包括由活性氧(ros)以及一系列ros參與的的繼發(fā)的損害所造成。例如，其中之一，線粒體dna(mtdna的)是一個(gè)多拷貝染色體外遺傳組件，暴露于高穩(wěn)態(tài)水平ros和由呼吸鏈產(chǎn)生的線粒體自由基，它很容易被氧化損傷并造成基因的突變，超過20％報(bào)道的在人類線粒體dna上的突變已經(jīng)確認(rèn)是老年性損傷相關(guān)聯(lián)的。

在上述的過程發(fā)生之中，需要密切關(guān)注的應(yīng)該是不飽和脂肪酸的作用。不飽和脂肪酸是細(xì)胞、組織等生物單位膜的基本組分，含量在不同的組織里面都具有比較大的差異，它與ros和由呼吸鏈中產(chǎn)生的自由基接觸后隨即會(huì)產(chǎn)生鏈的斷裂，氧化，釋放丙二醛(malonicdialdehydealchol，mda)，作為一種活性的中間物，該醛是一種劇毒分子，mda通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)的功能蛋白質(zhì)，酶，因子，dna等進(jìn)行修飾，形成加合物。這類物質(zhì)可以在各種體液里面出現(xiàn)，例如，當(dāng)組織出現(xiàn)微小的病變后，組織的mda的水平增加，隨即在尿液中mda也會(huì)出現(xiàn)增加，同時(shí)增加的還有幾個(gè)mda的衍生物從尿液排泄，表現(xiàn)為尿中的該類物質(zhì)水平增加。有mda的主要尿代謝物已被確定為n-ε-(2-丙烯醛)賴氨酸，以及其n-α乙酰酯。

rio(2005)的研究工作說明，上述的氧化應(yīng)激是多種慢性疾病和衰老過程中一個(gè)極其重要的底層的過程。脂類尤其是多不飽和脂肪酸，是這類氧化應(yīng)激的主要的攻擊靶標(biāo)，并產(chǎn)生復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)以及脂質(zhì)氧化引起的一些次級(jí)產(chǎn)品。這些產(chǎn)品主要是醛，與加劇氧化損傷的能力，它們存在于整個(gè)機(jī)體組織，與生物大分子如核酸、蛋白質(zhì)等相互作用，不可逆的損壞細(xì)胞以及細(xì)胞器的生理功能。

值得注意的是，多不飽和脂肪酸作為氧化應(yīng)激的攻擊靶標(biāo)，具有重大的意義，因?yàn)槎嗖伙柡椭舅岽嬖谟跈C(jī)體組織，細(xì)胞，細(xì)胞器，單位膜上面，分布非常廣泛，含量與分布的范圍很大；尤其是在檢測(cè)方面的意義在于，不同的組織，細(xì)胞種類，不同的部位，其多不飽和脂肪酸的含量，分布都具有各自的特點(diǎn)，在受到氧化損壞釋放的時(shí)候，會(huì)出現(xiàn)與組織、細(xì)胞種類、器官部位關(guān)聯(lián)的特殊的釋放的時(shí)間、量的模式，可以解釋為，這種時(shí)候檢測(cè)到的信號(hào)是具有時(shí)間與空間編碼意義的特異信號(hào)。

自20世紀(jì)60年代以來(lái)，在量化評(píng)估氧化應(yīng)激的水平的體內(nèi)和體外研究方面，丙二醛(mda)是主要的和研究最多的的多不飽和脂肪酸過氧化產(chǎn)物分子。因?yàn)檎J(rèn)識(shí)mda的意義不僅僅在于它是一個(gè)表征氧化應(yīng)激程度的公認(rèn)的分子標(biāo)記物，它與dna和蛋白質(zhì)的相互作用造成的致突變、損傷在多種慢性病損研究的毒理作用方面也是具有重要的意義。

pufa脂質(zhì)氧化的體內(nèi)過程簡(jiǎn)單描述是這樣的：多不飽和脂肪酸遇到自由基之后，主要通過多級(jí)自由基反應(yīng)先期形成前列腺素樣或者甲基亞油酸的前體物質(zhì)，這些前體物質(zhì)進(jìn)一步通過β剪切過程作為前一級(jí)物質(zhì)繼而轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘苑肿觤da。

生物樣品中的丙二醛的主要來(lái)源是多不飽和脂肪酸參與的過氧化過程，參與的結(jié)構(gòu)有兩個(gè)或更多的亞甲基間隔的雙鍵。mda前體屬于一類非揮發(fā)性的性質(zhì)，前體的結(jié)構(gòu)類似于一類二環(huán)內(nèi)過氧化物，類似前列腺素樣的物質(zhì)，以及亞油酸甲酯樣的結(jié)構(gòu)等，接著轉(zhuǎn)化為mda，體內(nèi)外的過程是類似的.。丙二醛也可在體內(nèi)通過酶促生成。各種前列腺素合成過程的知識(shí)表明，血栓素a2(txa2)的合成導(dǎo)致丙二醛和12(s)-羥基8，10(e，e)-heptadecadienoic酸(hht)以高收率產(chǎn)生所述的中間體分子以及mda。

生理狀態(tài)的中性ph下，mda是一種烯醇陰離子，具有相對(duì)低的化學(xué)反應(yīng)性能，然而，這種分子能夠與核酸堿基相互作用，以形成幾種不同結(jié)構(gòu)的加合物，已知的嘧啶，嘌呤，2-脫氧核糖等，其中比較重要的有m1g，在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞里發(fā)現(xiàn)了m1g能夠誘導(dǎo)序列依賴性移碼突變和堿基對(duì)取代。另一方面，丙二醛可以造成nda鏈間交聯(lián)并產(chǎn)生突變，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，dna和組蛋白之間存在mda引發(fā)的交聯(lián)，這些都是造成腫瘤發(fā)生的原因。

丙二醛與伯胺反應(yīng)形成nε-(2-丙烯醛)賴氨酸以及賴氨酸-賴氨酸交聯(lián)體。這些反應(yīng)產(chǎn)物被檢測(cè)在氧化的脂蛋白(ldl)和載脂蛋白b被認(rèn)為是參與受損相互作用的變性脂蛋白，這種化學(xué)反應(yīng)是器官血管內(nèi)壁或者組織微循環(huán)損壞的基礎(chǔ)，在糖尿病很早期的發(fā)展過程中就會(huì)出現(xiàn)。

對(duì)于膠原蛋白的情形比較特殊，膠原蛋白作為血管內(nèi)壁以及細(xì)胞間組織的基本結(jié)構(gòu)性物質(zhì)，生理功能的維持要借助正確的結(jié)構(gòu)。即使在沒有發(fā)生nε-(2-丙烯醛)賴氨酸以及賴氨酸-賴氨酸交聯(lián)體的時(shí)候，一樣會(huì)發(fā)生mda介導(dǎo)的肽鏈之間的交聯(lián)，造成分子活性的失能。所以用mda的產(chǎn)物交聯(lián)賴氨酸作為標(biāo)志物來(lái)檢測(cè)，監(jiān)控毒性發(fā)展的時(shí)相，相對(duì)于監(jiān)控mda的水平變化量或者累計(jì)量還要晚一些。

mda能夠誘導(dǎo)蛋白質(zhì)交聯(lián)，mda的水平升高與阿爾茨海默氏(ad)的關(guān)聯(lián)關(guān)系已經(jīng)逐漸被確認(rèn)。按照目前的理解，雖然ad有著復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)和遺傳危險(xiǎn)因素和傾向，早期營(yíng)養(yǎng)干預(yù)現(xiàn)在證明具有非常確定的重要性，通過在膳食補(bǔ)充劑補(bǔ)充含有硫辛酸的混合物，乙?；?l-肉堿，磷脂酰甘油，十二碳六烯酸，和磷脂酰絲氨酸等自由基消除劑，可以明顯地延緩ad的進(jìn)展與認(rèn)知能力的下降，但是對(duì)于是否目前的自由基清除藥物的使用是否正確也出現(xiàn)了一些爭(zhēng)議，許多研究者建議通過嚴(yán)密的監(jiān)控mda的水平，來(lái)指導(dǎo)合理使用自由基清除劑、抗氧化劑是比較完善的方式。

發(fā)生在核糖體上的蛋白質(zhì)合成普遍受所有與老化相關(guān)的生物學(xué)過程的影響。有一個(gè)關(guān)于該機(jī)制沒有明確的，但是已經(jīng)取得共識(shí)的發(fā)現(xiàn)，即隨著老化的發(fā)展，機(jī)體組織細(xì)胞的蛋白質(zhì)翻譯機(jī)能出現(xiàn)了相應(yīng)的下降。延伸步驟是特別是受影響的老化的改變的結(jié)果延伸因子-2(eef-2)中，單體蛋白的那在催化沿著mrna的核糖體的移動(dòng)蛋白質(zhì)的合成。eef-2似乎是特別受脂質(zhì)過氧化物的化合物，其伴隨產(chǎn)生毒性醛，如mda。這可以通過產(chǎn)生破壞蛋白質(zhì)價(jià)加合物的累積參與組織老化過程中損壞。

現(xiàn)在已經(jīng)知道，體內(nèi)胰島素的分泌是受到線粒體的呼吸鏈上的呼吸作用控制的。一般情況下，激活β細(xì)胞釋放胰島素的過程和胰高血糖素的合成與釋放降低是相對(duì)進(jìn)行的，腎上腺素則可以通過刺激α細(xì)胞胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ca++釋放激活胰高血糖素的分泌。正是這種由α細(xì)胞，β細(xì)胞協(xié)調(diào)控制的過程保證了糖代謝的穩(wěn)定。如果發(fā)展到糖尿病階段，經(jīng)常出現(xiàn)的高血糖癥通過線粒體上的電子傳遞鏈，產(chǎn)生持續(xù)的氧化應(yīng)激，產(chǎn)生并造成單位膜的脂質(zhì)損壞，進(jìn)一步相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子零件和dna分子零件被氧化性中間物mda損壞，一般而言，就會(huì)導(dǎo)致β細(xì)胞功能的逐步喪失，并加劇糖尿病的病理發(fā)展進(jìn)程，接著就出現(xiàn)大量的變性損壞的內(nèi)皮細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和其他細(xì)胞等，體現(xiàn)為糖尿病的一系列的并發(fā)癥狀。

dandona報(bào)道(1996)的12例胰島素依賴型糖尿病(iddm)和15例非胰島素依賴型糖尿病(niddm)的 測(cè)試結(jié)果，發(fā)現(xiàn)和對(duì)照相比，這些病人的單核細(xì)胞都具有顯著地高水平的氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)一步測(cè)定發(fā)現(xiàn)他們的由于氧化應(yīng)激造成的dna損傷的標(biāo)志物8-ohdg也相應(yīng)的處于很高的水平，這也正是氧化應(yīng)激如何通過一種類似于上述描述的“老化”的方式，逐步造成了糖尿病人并發(fā)癥狀逐步嚴(yán)重的原因。所以如何控制這種不適當(dāng)?shù)难趸瘧?yīng)激過程顯然對(duì)于防治糖尿病的并發(fā)癥是一種明智的策略。

在這些生物學(xué)標(biāo)志的出現(xiàn)的時(shí)相上，高血糖癥一旦出現(xiàn)，隨即發(fā)生的就是mda的水平的升高，接著就是mda等氧化應(yīng)激產(chǎn)物參與的微小血管的損傷，這時(shí)候有可能可以檢測(cè)到糖化血紅蛋白的水平的增高，再接著就是尿中可以檢測(cè)到微球蛋白，表現(xiàn)為器官損傷。其中，mda的水平(2-12umol/l)的增高與糖化血紅蛋白的水平的增高在很寬泛的一個(gè)范圍(4％-14％)內(nèi)都具有一定的關(guān)聯(lián)關(guān)系；同時(shí)mda水平的增高也與之后出現(xiàn)的尿中的微球蛋白的水平的增高具有一定的線性關(guān)聯(lián)，但是許多臨床數(shù)據(jù)表明糖化血紅蛋白的水平的增高與尿微球蛋白的水平的增高沒有發(fā)現(xiàn)有確定的線性關(guān)系。由于mda水平的增高可以出現(xiàn)在糖尿病發(fā)生發(fā)展比較早的時(shí)期，甚至出現(xiàn)在并未確診的早期，之后，mda的水平也隨著病程一直在持續(xù)地升高，每一次升高都提示著病情出現(xiàn)了新的發(fā)展與程度的加重，具體的內(nèi)涵已經(jīng)有大量的研究報(bào)道。

例如罹患糖尿病后，隨著病損的發(fā)展，血管內(nèi)壁以及外周神經(jīng)末梢等受到影響，這個(gè)時(shí)候，病人會(huì)出現(xiàn)糖尿病的并發(fā)癥之一勃起功能障礙。latif(2006)比較了幾個(gè)指標(biāo)：no、糖化血紅蛋白(hbalc)、血清脂蛋白含量(lp)、mda等在病情進(jìn)展中的關(guān)聯(lián)性，雖然這時(shí)期的病人都表現(xiàn)為no水平低下、糖化血紅蛋白(hbalc)、血清脂蛋白含量以及脂蛋白含量都偏高，但是如果采用實(shí)際功能的異常指標(biāo)來(lái)分析，把海綿體動(dòng)脈收縮期峰值＜25厘米/秒(psv)定義為并發(fā)癥陽(yáng)性，就發(fā)現(xiàn)，在糖尿病勃起功能障礙的病人里面，脂蛋白指標(biāo)具有91％的靈敏度和78％的特異性，mda有91％的靈敏度和89％特異性，糖化血紅蛋白有91％的靈敏度，44％的特異性，幾乎沒有線性關(guān)系。說明采用mda的指標(biāo)來(lái)推測(cè)糖尿病的并發(fā)癥之一勃起功能障礙的進(jìn)展程度，相對(duì)于使用糖化血紅蛋白的指標(biāo)，明顯具有更好的臨床價(jià)值。

鑒于mda的出現(xiàn)是在氧化應(yīng)激一旦產(chǎn)生就會(huì)出現(xiàn)，所以是一個(gè)非常早期，敏感的指標(biāo)，它的含量的升高，從代謝與功能的角度可以理解為，代表了損傷性的代謝過程與細(xì)胞、組織的損傷的出現(xiàn)，相比于糖化血紅蛋白的含量的指標(biāo)，mda的水平，以及mda水平的變化，如果作為2類糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的老化與損傷的生物醫(yī)學(xué)標(biāo)志與臨床診斷的判據(jù)，具有更加靈敏、定量、早期預(yù)警的價(jià)值。

就mda在臨床醫(yī)學(xué)方面已經(jīng)申請(qǐng)的專利、文獻(xiàn)的情況大致是：在draper，h.h(1993，freeradic.biol.med，1993，15，353)發(fā)表了mda的tba檢測(cè)方法之后，已經(jīng)有大量的有關(guān)mda的檢測(cè)分析，應(yīng)用等文獻(xiàn)發(fā)表，同時(shí)也公開了多個(gè)相關(guān)的專利保護(hù)。伊萬(wàn)·佩特亞耶夫(2006，cn101147064a)提及雖然tba的方法原理簡(jiǎn)單實(shí)用，但是需要花費(fèi)病患者2-3毫升的血清來(lái)測(cè)量，還要花費(fèi)8-12個(gè)小時(shí)完成分析工作，所以公開了一種抗體酶的分析原理來(lái)替代mda的測(cè)試分析，用于評(píng)價(jià)氧化損傷對(duì)血管內(nèi)壁動(dòng)脈粥樣硬化狀的損傷的情況。伊萬(wàn)·佩特亞耶夫(ivanpetyaev)在其它二個(gè)專利的申請(qǐng)(2002，us7148028b2和2008，us7419657b2)中提交了對(duì)使用mda水平的測(cè)定用于對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化損傷評(píng)估的權(quán)利要求。關(guān)聯(lián)于類似伊萬(wàn)·佩特亞耶夫(ivanpetyaev)所申報(bào)專利涉及到的情形，還例如，即采用測(cè)定mda的水平的方式來(lái)評(píng)價(jià)糖尿病、慢性腎病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病或者相關(guān)的并發(fā)癥，心腦血管保健品、藥物的保健、治療效果的評(píng)估等狀況已經(jīng)有大量的公開信息(技術(shù)文獻(xiàn)，專利，會(huì)議摘要)表述過，以及相關(guān)的用于可充分體現(xiàn)出這種實(shí)踐方式所具有的優(yōu)越性，即采用測(cè)定mda的水平的方式評(píng)價(jià)上述病理、生理情形發(fā)展的狀況中的有效性與臨床意義方面，也有許多類似的文獻(xiàn)發(fā)表公開提及到這一點(diǎn)。但是上述的表述中幾乎都無(wú)一例外地指向的mda的分析測(cè)試方法的實(shí)現(xiàn)是通過以下手段，包括：氣相色譜，質(zhì)譜，分光光度計(jì)，高效液相色譜，目測(cè)比色法等方法，沒有任何涉及到本專利提出的微流芯片方式或者如何實(shí)施這種方式的細(xì)節(jié)，即采用生物芯片或chiponlab技術(shù)實(shí)現(xiàn)的例子與應(yīng)用的權(quán)利要求。

關(guān)于對(duì)mda的測(cè)試的方法硫代巴比妥酸(tba)反應(yīng)，該方法最廣泛地用于研究脂質(zhì)過氧化在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物和人類與疾病。然而就其特異性方面常有技術(shù)層面的問題，因?yàn)閠ba反應(yīng)與多種化學(xué)物種產(chǎn)生粉紅色的顏色。tba與蔗糖，果糖和葡萄糖，嘧啶，2-脫氧核糖，和n-乙酰神經(jīng)酸。膽紅素，膽綠素，黃疸血清等干擾物質(zhì)，都會(huì)增大mda測(cè)定時(shí)的532nm的光吸收，但是對(duì)于尿樣，唾液等限定的體液尤其是糖尿病人的尿樣等限定的體液，主要的干擾物質(zhì)是這些樣本中的不確定的，而且含量比較大的葡萄糖的干擾，其它可能的干擾物質(zhì)含量相對(duì)很低，而且通過簡(jiǎn)單地酸性的沉淀可以大大地去除這些干擾。對(duì)于早期糖尿病人尿糖 陰性的大多數(shù)情況下，測(cè)試結(jié)果比較理想。

所引用的專利與文獻(xiàn)：

slatterda，boltonch，baileyaj.theimportanceoflipidderivedmalondialdehydeindiabetesmellitus.diabetologia2000；43：550e7.

delriod，stewartaj，pellegrinin：areviewofrecentstudiesonmalondialdehydeastoxicandbiologicalmarkerofoxidativestress.nutrmetabcardiovascdis15：316-328，2005

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biomarkersinpatientswithtype2diabetes

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：本申請(qǐng)包括了如下的工作：分別使用了熱壓封接的方法制備了pmma三明治結(jié)構(gòu)芯片，以及如何將pmma-pdms，pdms-玻璃芯片相互粘結(jié)制備微流芯片結(jié)構(gòu)；也制備了可與之配套的反應(yīng)載片、反應(yīng)載體微珠，將部分反應(yīng)底物固定到檢測(cè)區(qū)的固相表面；接著用這樣制作的微流芯片測(cè)定了pbs溶液里面的mda的含量，正常人尿樣的mda含量，以及患有2型糖尿病病人的尿樣的mda的含量。

附圖說明：

圖1.丁字形狀圖案微流芯片。主干道是a到c的流道，寬度是450微米，從b到e到d的流道所采用用作模具的金屬絲的直徑是300微米。a孔的直徑為8毫米。

圖2.三明治結(jié)構(gòu)微流芯片上蓋板。大小為35毫米x25x1.5毫米。

圖3.上吸式流道模具側(cè)面圖。

圖4.上吸式流道模具俯視圖。

圖5.上吸式流道模具截面圖。

圖6.自吸式檢測(cè)卡。

圖7.自吸式檢測(cè)卡上半部分，下半部分的結(jié)構(gòu)圖示。

圖8.自吸式檢測(cè)卡內(nèi)部檢測(cè)紙板。

圖9.微流芯片組裝的結(jié)構(gòu)。在b的位置為離斷的結(jié)構(gòu)防止側(cè)漏，a1，a2處用于搭接玻璃纖維素片形成檢測(cè)區(qū)，c搭接上樣孔處的樣品墊，d為2個(gè)單獨(dú)供電的加熱電極。

圖10.檢測(cè)區(qū)涂層表面形貌。

圖11.氧化鋁溶膠凝膠涂層厚度與底物活性關(guān)系圖示。

圖12.pdms微珠結(jié)構(gòu)

圖13.連接了熒光基團(tuán)的微珠固定在凝膠表面。

圖14.mda含量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖15.隨即抽樣志愿者尿樣mda含量分布。

圖16.2型糖尿病人并發(fā)癥陽(yáng)性和陰性病人尿樣mda含量分布。

圖17.2型糖尿病人與隨即抽樣志愿者尿樣mda含量比較。

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例1：制備pmma三明治結(jié)構(gòu)/雙層結(jié)構(gòu)芯片

用直徑300微米和450微米的鎳絲，也可以選擇類似尺度的不銹鋼絲，切為長(zhǎng)度15毫米的段，固定在一個(gè)表面平整的不銹鋼基座上，制成熱壓的模具。如圖1所示的，形成一個(gè)丁字形狀的圖案，其中主干道是a到c的流道，寬度是450微米，從b到e到d的流道所采用用作模具的金屬絲的直徑是300微米。將模具固定到壓力升降臺(tái)的端部，控制恒溫加熱臺(tái)的溫度在106度，上下精確在0.5度的變動(dòng)中，調(diào)節(jié)壓力升降臺(tái)的手柄，使模具水平面的方式與聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)料片相接，固定壓力在0.6mpa，維持壓力10分鐘，關(guān)閉恒溫加熱平臺(tái)自然降溫到室溫，脫出模具。轉(zhuǎn)移熱壓成型的料片到打孔鉆臺(tái)，流道面為正面向上放置，分別在b，c，d，e位置鉆出直徑5毫米的穿透孔，a孔的直徑為8毫米。在每一個(gè)孔內(nèi)放置預(yù)處理好的玻纖測(cè)試紙片，用厚度1.5毫米的pmma高透亮料片與熱壓成型的料片正面相接，反面與另外預(yù)先開孔的上蓋板相接，形成三明治的結(jié)構(gòu)?？刂坪銣丶訜崾业臏囟仍?6度，上下精確在0.5度的變動(dòng)中，調(diào)節(jié)內(nèi)置的壓力升降臺(tái)的手柄，維持壓力在0.075mpa大小的壓力15分鐘完成熱壓封接。將制成的三明治結(jié)構(gòu)切割成35毫米x25毫米大小的結(jié)構(gòu)；在較為復(fù)雜的雙檢測(cè)孔裝置里面，在與對(duì)照的檢測(cè)孔不同的檢測(cè)孔的下方區(qū)域預(yù)留供安裝加熱電極，可以通過與這個(gè)裝置配套使用的閱讀器的一個(gè)gpio引入3-6伏特0.1-1安培的電流供局部加熱到30-80攝氏度的熱區(qū)(圖2)。

實(shí)施例2：制備含有液體上吸式流道的裝置

用3d打印機(jī)制備如圖3所示的結(jié)構(gòu)，所用的材料是聚酰胺樹脂材料(從formlabs公司購(gòu)買)，abs材料也可以使用，但是相對(duì)粗糙一些，不銹鋼的材料也是一個(gè)選擇。固定在一個(gè)表面平整的塑料皿里面，制成澆注pdms的模具。在后面的步驟里面，準(zhǔn)確量取27gdowconingsylgard184硅膠，稱量2.7gdowconingsylgardcuringagent混合，脫氣，覆蓋模具，讓最頂面的深度大于1mm，70℃交聯(lián)3小時(shí)，從模具里面移出整個(gè)結(jié)構(gòu)，用去離子水清洗膠塊，在合適的pet容器內(nèi)加入上蓋處理液，超聲處理60分鐘，用經(jīng)過0.01uml濾膜過濾的壓縮空氣吹干上蓋板，等離子發(fā)生器用空氣等離子處理90秒，用0.25mp的壓力封接底板與上蓋板制成微流道結(jié)構(gòu)(圖4，圖5)。最后一個(gè)步驟包括以下的處理方式：以無(wú)水乙醇為溶劑、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)為修飾試劑、醋酸為催化劑，采用浸泡法，對(duì)芯片流道內(nèi)表面進(jìn)行氨基硅烷化修飾。制備過程中浸泡時(shí)間、aptes的濃度比較合適的范圍是0.1-5％(v/v)、ph值控制在4.8-5.6之間，處理的時(shí)間依據(jù)反應(yīng)的溫度控制在30分鐘到5個(gè)小時(shí)，最后需要將處理后的裝置在110度-120度的熱板上聚合20-30分鐘。這樣處理后的裝置可以在依靠裝置上部的彈性氣囊形成的負(fù)壓條件下，將外面的液體上吸到流道中進(jìn)行反應(yīng)，氣囊的體積優(yōu)化后的大小在100-900微升之間。

實(shí)施例3：制備含有液體自吸式流道的裝置

用注塑的工藝或者直接用3d打印的方式制備如圖6所示的結(jié)構(gòu)，所用的材料可以是各種適合注塑成型的材料，具體使用的是市售的聚乳酸粉末材料。注塑制備出上下兩個(gè)零件(圖7)，將圖8的纖維素紙板(厚度為0.5毫米)安裝在圖7右側(cè)圖的下面底板的紙板槽中。其中圖8的紙板在對(duì)應(yīng)圖7上下蓋板的檢測(cè)孔的位置有一個(gè)直徑在3-6毫米的開孔，在這個(gè)位置用于安裝玻璃纖維檢測(cè)紙片，末端有一個(gè)預(yù)先沿著折疊線折疊的回折，在使用之前需要打開圖7左側(cè)零件末端的蓋片，使這個(gè)紙片的回折暴露彈出來(lái)，用這個(gè)結(jié)構(gòu)將測(cè)試樣品的液體通過毛細(xì)作用牽引到測(cè)試裝置中，在圖8的3-6毫米的開孔的一邊，還有一個(gè)1.5毫米開孔，用于和圖7的結(jié)構(gòu)匹配將檢測(cè)紙板卡在裝置中，不要發(fā)生隨意的移動(dòng)，這樣的紙板在具體安裝時(shí)下面承托一個(gè)pvc硬紙片，并在相應(yīng)開孔的位置開孔。從這個(gè)位置到3-6毫米的開孔之間的紙板的區(qū)域預(yù)先經(jīng)過如下的處理：首先配制40％dmso溶液(v/v)，含有5％三氯乙酸(w/v)10毫升，在上述區(qū)域滴加10微升dmso溶液，干燥，再次滴加10微升dmso溶液，反復(fù)3次，不能將溶液吸收的外沿超過或者接觸到圖8中3-6毫米的開孔邊緣的2毫米范圍內(nèi)。

實(shí)施例4：制備含加樣孔以及相應(yīng)流道的裝置

制備圖9所示的裝置，其中流道的制備可以依據(jù)性價(jià)比選擇紙流道或者pdms流道。制作紙流道的步驟如下：使用纖維素紙板(厚度為0.5毫米)用切紙機(jī)制成圖9流道的圖案，其中在b的位置需要制成離斷的結(jié)構(gòu)，防止側(cè)漏；a1，a2處用于搭接玻璃纖維素紙片形成檢測(cè)區(qū)，c搭接上樣孔處的樣品墊，d為2個(gè)單獨(dú)供電的加熱電極。具體制備pdms流道的步驟是；準(zhǔn)確量取27gdowconingsylgard184硅膠，準(zhǔn)確稱量2.7gdowconingsylgardcuringagent混合，脫氣，覆蓋金屬流道模具，保持膠層深度在2.5-3.5mm，70℃交聯(lián)3小時(shí)，切出芯片結(jié)構(gòu)，用直徑8mm的開孔器在相應(yīng)位置開孔，制成樣品孔和反應(yīng)區(qū)孔；用直徑4mm的開孔器在相應(yīng)位置開孔，制成2個(gè)檢測(cè)孔。用去離子水清洗膠塊，超聲處理60分鐘，用經(jīng)過0.01uml濾膜過濾的壓縮空氣吹干上蓋板，連同處理好的pmma底板一起放入等離子發(fā)生器用空氣等離子處理90秒，用0.25mp的壓力封接玻璃底板制成微流芯片。其中玻璃底板表面需要羥基化處理；具體為1、把玻璃切成35x25mm形狀，放入盛有去離子水的燒杯中，切完后用封口膜封口；2、把步驟1中的燒杯超聲處理10min；3、把步驟2中燒杯內(nèi)的水倒掉，并再用去離子水沖洗2-3遍，洗完后把去離子水倒掉；4、向步驟3處理后的燒杯中加入適量乙醇(沒過里面的玻璃片即可)，搖一下倒掉，然后再加入適量乙醇，超聲處理10min；5、同步驟4，把乙醇換成丙酮；6、用n2將步驟5處理過的燒杯中的丙酮吹干；7、向經(jīng)步驟6處理過的燒杯內(nèi)加入h2so4∶h2o2＝7∶3，先加h2so4再加h2o2，加h2o2時(shí)要遍用玻璃棒攪拌遍加h2o2，這一步整個(gè)過程要帶黃色橡膠手套；8、把加入硫酸和雙氧水的燒杯放入到90-100℃的水浴或油浴中，加熱1-2小時(shí)；9、待步驟8中浴液冷卻致室溫后，取出燒杯，將里面的酸液倒入指定的廢液瓶中，不能倒在盛有有機(jī)溶液的廢液瓶中，然后用去離子水沖洗燒杯內(nèi)的玻璃片，同樣沖后的酸液也倒在指定的廢液瓶，直到燒杯內(nèi)的去離子水成中性(用ph試紙測(cè)試)；10、用n2吹干經(jīng)步驟9處理過的玻璃片，吹干后的玻璃片即可使用。

實(shí)施例5：制備反應(yīng)載片

首先按照常規(guī)方法配制al(i-pro3)母液200毫升，分裝后低溫保存。具體為首先取2g(9.8mmol)的al(i-pro3)加入44.0ml(2.4mol)去離子水，室溫下持續(xù)攪拌45-60min完全溶解，接著加入1.2ml(1.2mmol)的1mhcl后加熱到90℃，反應(yīng)10個(gè)小時(shí)，將反應(yīng)完畢的混合物溶膠分裝后低溫保存。接下來(lái)再配制12ml氧化鋁溶膠凝膠涂層液，具體成分為：50mmtris-hcl(ph7.0)，20mmcacl2，120微升納米金粒子(5-10nm，od530＝1.0-3.0)以及2mlal(i-pro3)母液，取14厘米見方的ap40玻璃纖維紙一張，購(gòu)自millipore公司，所使用的玻纖紙的厚度為475um，重量105克/m2。均勻滴加所配制的12毫升凝膠液到紙片表面，待溶液完全吸附后，低溫自然晾干，然后再在熱板上120攝氏度處理20分鐘。，在顯微鏡下看到的結(jié)構(gòu)如圖10。用打孔器制成直徑5毫米的圓形片。

為了確定合適的涂層參數(shù)，又制備了的不同的系列玻纖載體紙片，具體的方法是：首先按照常規(guī)方法配制al(i-pro3)母液200毫升，分裝保存。具體為首先取9.8mmol的al(i-pro3)加入2.4mol去離子水，室溫下持續(xù)攪拌45-60min完全溶解，接著加入1.2mmol的1mhcl后加熱到90℃，反應(yīng)12個(gè)小時(shí)，將反應(yīng)完畢的混合物溶膠分裝后低溫保存。

接下來(lái)再配制12ml氧化鋁溶膠凝膠涂層液，具體成分為：50mmtris-hcl(ph7.0)，20mmcacl2，120微升納米金粒子(5-10nm，od530＝1.0-3.0)以及具體到折合每一片玻纖紙片上的加載量為0.01，0.008，0.004，0.003，0.002，0.001微升的al(i-pro3)母液，分別取直徑6毫米的玻纖紙片，所使用的玻纖紙的厚度為475um，重量105克/m2，均勻滴加所配制的凝膠液到紙片表面，待溶液完全吸附后，低溫自然晾干，然后再在熱板上120攝氏度處理20分鐘。接下來(lái)，將前一個(gè)步驟制備好的載體片移入1毫升的離心管，對(duì)于每一個(gè)直徑6毫米的圓形的處理好的載體片反復(fù)上樣多輪20微升的pbs溶液，其中含有1毫克每毫升半胱氨酸，每一輪都在37度反應(yīng)10分鐘，然后加入10微升3mmdtdp室溫反應(yīng)30分鐘加入100微升去離子水洗脫離心，讀取在324nm的光吸收值。比較后確定在本實(shí)施例所披露的工藝條件下，選擇涂層為80nm厚度比較穩(wěn)定(圖11)。

接下來(lái)的步驟包括了一些發(fā)生在載片上的巰基的還原，可以采取分步反應(yīng)，也可以采取一步反應(yīng)的策略。具體的操作步驟是在前面制備好的載體片取10片，移入到一個(gè)1毫升的離心管中，將離心管放置在一個(gè) 250毫升的密閉的干燥器中，并放置4-5袋除氧型干燥劑，在離心管中加入200微升2％tba，含有3微升的巰基乙醇，在干燥器中反應(yīng)4-5小時(shí)，取出500rpm離心除去液體，干燥器中干燥后作為反應(yīng)區(qū)的載片使用。

與前一個(gè)步驟類似的一個(gè)處理方法的調(diào)整為，取在前面制備好的載體片10片，移入到一個(gè)1毫升的離心管中，將離心管放置在一個(gè)250毫升的密閉的干燥器中，并放置4-5袋除氧型干燥劑，在離心管中加入200微升三氯乙酸(5％(w/v))/dmso(40％(v/v))/去離子水(60％(v/v))，含有0.05μmmncl2，在干燥器中干燥過夜后作為緩沖區(qū)的載片使用。

實(shí)施例6：制備反應(yīng)載體微珠

首先第一個(gè)步驟是配制1％pva分散液100毫升(ph10.5，含0.1％sds)；然后第二個(gè)步驟是配制pdms膠液2毫升，具體為稱量1.6毫升sylgard184gel以及0.4毫升的curingagent，混合充分后脫氣30分鐘，接下來(lái)的第三個(gè)步驟用30g的不銹鋼注射器針頭分散到首先配制好的pva分散液中，控制包括分散液在內(nèi)的整個(gè)系統(tǒng)的溫度低于40度，攪拌速度為600轉(zhuǎn)每分鐘，膠液注入速度為20微升每分鐘。最后待全部膠液分散到分散液后升高分散液的溫度不低于80℃，500rpm持續(xù)攪拌聚合3個(gè)小時(shí)后3000轉(zhuǎn)離心收集pdms微珠(圖12)，用步驟一制備的分散液淘洗3次保存。取出所制備的微珠一部分用95％的乙醇洗滌2次，然后移入500微升的甲醇(ph11.0)溶液，含有3％h2o2，以及0.1umol/l的mts，37度反應(yīng)30分鐘；4000rpm離心棄去上清液，步驟一制備的分散液淘洗3次保存；接下來(lái)加入10微升3mmdtdp室溫反應(yīng)30分鐘加入100微升去離子水洗脫離心收集上清液，讀取在324nm的光吸收值。用以下公式計(jì)算固定到微珠表面的化合物所擁有的巰基的摩爾吸光系數(shù)。

cysteine：δε4-thoil-pyridone324＝(a324，30ulcys-a324，0ulcys)/(3.0×10^-5m×1cm)

mts：δε4-thoil-pyridone324＝(a324，30ulcys-a324，0ulcys)/(3.0×10^-5m×1cm)

mtsbeeds：δε4-thoil-pyridone324＝(a324，30ulcys-a324，0ulcys)/(3.0×10^-5m×1cm)

mtschunck：δε4-thoil-pyridone324＝(a324，30ucys-a324，0ulcys)/(3.0×10^-5m×1cm)

接下來(lái)的步驟包括了一些發(fā)生在載片上的巰基的還原，可以采取分步反應(yīng)，也可以采取一步反應(yīng)的策略。完成前一個(gè)步驟后用fitc-gsh檢查固定在微珠表面的巰基(圖12)。具體的操作步驟是在前面制備好的載體片取10片，移入到一個(gè)1毫升的離心管中，將離心管放置在一個(gè)250毫升的密閉的干燥器中，并放置4-5袋除氧型干燥劑，在離心管中加入200微升2％tba，含有3微升的巰基乙醇，在干燥器中反應(yīng)4-5小時(shí)，取出500rpm離心除去液體，用1xpbs洗滌后使用。

實(shí)施例7：用微流芯片測(cè)定mda的含量

任意選擇一個(gè)在前面實(shí)施例中制備的微流芯片系統(tǒng)，具體的指定例如圖9的一種結(jié)構(gòu)說明后續(xù)的步驟，分別組裝反應(yīng)區(qū)，緩沖區(qū)，加樣區(qū)后封合，制備這樣的芯片40只供測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)曲線以及志愿者提供的尿樣；期中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法是：用1xpbs(ph7.25)作為溶劑配制mda的標(biāo)準(zhǔn)液各1毫升，濃度分別為：0.0umol/l，1.5umol/l，4.0umol/l，8.0umol/l，16.0umol/l每次的測(cè)試方法都一樣，具體是，在每一只芯片的上樣孔加樣70微升后，把芯片插入閱讀器的插槽中讀取數(shù)值，計(jì)算r2＝0.975(圖14)。測(cè)定志愿者尿樣的方法是：任意選擇一個(gè)在前面實(shí)施例中制備的微流芯片系統(tǒng)，具體指定例如圖7的一種結(jié)構(gòu)說明后續(xù)的步驟，分別用前面實(shí)施例中制備的載片，結(jié)構(gòu)等組裝反應(yīng)區(qū)，并在反應(yīng)區(qū)所在的載片上添加折合到每一個(gè)載片的體積是5微升實(shí)施例6中制備的微珠到緩沖區(qū)，加樣區(qū)后封合制備這樣的芯片40只供測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)曲線以及隨即抽樣的17名健康志愿者提供的尿樣；期中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法是；用1xpbs(ph7.25)作為溶劑配制mda的標(biāo)準(zhǔn)液各1毫升，濃度分別為；0.0umol/l，0.5umol/l，1.0umol/l，2.0umol/l，4.0umol/l，8.0umol/。每次的測(cè)試方法都一樣，具體是，在每一只芯片的上樣孔加樣70微升后，把芯片插入閱讀器的插槽中讀取數(shù)值，正常人尿樣的mda濃度范圍分布在0.71umol/l-2.96umol/l之間。

實(shí)施例8：用微流芯片測(cè)定2型糖尿病病人的mda的含量

任意選擇一個(gè)在前面實(shí)施例中制備的微流芯片系統(tǒng)，具體的指定例如圖10的一種結(jié)構(gòu)說明后續(xù)的步驟，分別組裝反應(yīng)區(qū)，緩沖區(qū)，加樣區(qū)后封合，制備這樣的芯片200只供測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)曲線以及志愿者提供的尿樣。對(duì)志愿者尿樣的收集方法是：挑選20名確診為2型糖尿病的病人，年齡分布在35周歲到55周歲之間，男性和女性的比例接近1∶1，其中10個(gè)人病歷中沒有任何1項(xiàng)關(guān)于以下的記錄：1)視網(wǎng)膜水腫，視覺模糊；2)心律不齊，心電圖異常，心梗歷史；3)陽(yáng)痿；4)動(dòng)脈粥樣硬化；5)有服用魚油的習(xí)慣；6)牙齒脫落；7)下肢創(chuàng)傷和感染史；8)尿白蛋白或者尿糖陽(yáng)性；9)晨間臥床心率>85次/分鐘；10)夜尿明顯增多，這10名病人組成complication(-)陰性組；另外10個(gè)人病歷中至少有以上中的1項(xiàng)記錄，這10名病人組成complication(+)陽(yáng)性組。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法是：用1xpbs(ph7.25)作為溶劑配制mda的標(biāo)準(zhǔn)液各1毫升，濃度分別為：0.0umol/l，1.0umol/l，2.0umol/l，4.0umol/l，8.0umol/。每次的測(cè)試方法都一樣，具體是，在每一只芯片的上樣孔加樣75微升后，把芯片插入閱讀器的插槽中讀取數(shù)值。測(cè)試的結(jié)果為complication(-)陰性組mda濃度為2.80.7umol/l，complication(+)陽(yáng)性組mda濃度為4.81.2umol/l(圖16)。把complication(-)陰性組，complication(+)陽(yáng)性組合并后的mda濃度為3.81.4umol/l，與前面17名健康志愿者相比的結(jié)果1.80.8umol/l相比較直觀顯示為圖17。