本發(fā)明涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除c-反應性蛋白質(crp)的用途，其中親和色譜式移除crp通過將crp與用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧?ca²⁺-依賴性)結合而進行。

發(fā)明背景

按照世界衛(wèi)生組織(worldhealthorganization，who)的信息在2008年有約17,000,000人死于心血管疾病。由此，心血管疾病是非傳染性疾病中最常見的死因并且導致全世界每年發(fā)生的死亡的大約三分之一。按照估計，該數(shù)字到2030年將增加到大約23,000,000例死亡/年。

因此心血管疾病不僅是全世界的主要死亡原因，而且也導致國家衛(wèi)生系統(tǒng)和疾病保險公司的巨額醫(yī)療成本。心血管疾病的兩種最常見且最有害的現(xiàn)象是出現(xiàn)動脈硬化和血栓形成，其反過來又尤其導致心肌梗死和卒中。

近年來，心血管疾病的治療實現(xiàn)了長足的進展。這些進展不僅通過關于疾病引發(fā)機制的增加的知識成為可能，而且還通過風險患者的早期識別成為可能。事實上，疾病風險的鑒定及其早期治療是現(xiàn)代醫(yī)學實踐的重要特征。在近25年中，鑒定出多個因素和臨床參數(shù)，它們與疾病的當前狀況或與心血管疾病的未來可能性相關聯(lián)。這樣的風險因素能夠是可測量的生化或生理學參數(shù)例如血清-膽固醇-，hdl-，ldl-，和纖維蛋白原-水平，但也包括行為模式例如超重和吸煙。在風險因素不僅指示疾病或其發(fā)生而且事實上參與引起疾病發(fā)生的情況下，對風險因素的治療影響能夠影響疾病進程或減少其發(fā)生風險。

c-反應性蛋白質(crp)是先天免疫系統(tǒng)的急性-階段-蛋白質部分并且在肝中與炎癥反應相關聯(lián)地形成并釋放到血液中。在這方面，crp的形成首先通過細胞因子誘導，其在急性或慢性炎癥反應的范圍中表達。在這方面，形成crp的最強刺激物是白細胞介素-6(il-6)。因此，血液中的crp水平和il-6水平都是局部或全身炎癥反應的指標。慢性炎癥據(jù)推測是心血管疾病的基本的和支持性的病理學現(xiàn)象之一。由此出發(fā)越來越清楚的是，crp不僅斷言了心血管疾病，而且也因果性地參與其發(fā)生或者能夠影響其進程。

yeh(clincardiol.,2005,28:408-412)顯示，能夠用crp-水平來預測心血管疾病風險，crp額外是炎癥反應的指征，而炎癥則促進動脈粥樣硬化的全部階段。zoccali等人，(semin.nephrol.,2005,25:358-362)顯示，crp-水平斷言了腎臟疾病終末期患者的心血管死亡風險。按照nurmohamed等人，(neth.j.med.,2005,63:376-381)crp-水平斷言了血液透析患者的心血管死亡風險。

sola等人，(j.card.fail.,2005,11:607-612)能夠顯示為此能夠利用他汀類藥物治療，其降低crp的量并因此借此降低心血管疾病造成的死亡率和發(fā)病率。但是，這些治療形式并不足以顯著減少在心肌梗死后出現(xiàn)的高crp-量(直至正常值的1000倍)或透析患者血液中的高crp-量。

人血液中的crp正常值變化因人而異但平均為大約0.8mgcrp/升血液，但在急性或慢性炎癥反應(例如細菌感染，動脈粥樣硬化，心肌梗死后)的情況下能夠升高至明顯高于100mgcrp/升血液。因為crp在血液中的半衰期(約19小時)恒定并且因此獨立于患者的健康狀況，crp的合成速率單獨負責調節(jié)血液crp-水平(pepys&hirschfield,j.clin.invest.,2003,111:1805-1812)。在急性病理條件下劇烈升高的crp合成因此對患者(高?；颊呋蚣毙曰颊?crp-移除的治療手段提出特別的要求，原因在于必須清除顯著量的crp以將血液crp-水平降低至正常值。

因此存在對治療方法的增加的興趣，其減少患者的血液crp-水平。此外，基于crp的臨床意義存在對純化crp的有效方法的興趣，以隨后將經(jīng)純化crp用于其他實驗中，例如研究其分子功能。

wo2004/076486公開抑制免疫學、炎性和/或病理生理學應答的方法，其通過向具有增加crp-水平的患者給藥crp-結合性分子進行。然而其中并未公開的是，體外處理生物液體以從所述生物液體移除crp。

wo90/12632公開體外處理生物液體的方法和設備，其目標是從這些生物液體移除crp以及抗-磷酸膽堿-抗體，以治療癌癥。為此使用的含磷酸膽堿基質能夠例如由硅土，瓊脂糖，乙?；?acrylbeads)或瓊脂糖組成，其中通過所含的磷酸膽堿不僅結合crp而且結合抗-磷酸膽堿-抗體。

us2007/225226a1公開特定的肽，其結合crp并因此能夠在crp-單采血液成分術中用作功能柱材料。所述結合獨立于鈣地發(fā)生。還描述了一些體外血液凈化裝置，其在使用這些柱材料的情況下適于crp-單采血液成分術，包括移除內毒素的系統(tǒng)，檸檬酸鹽在其中用作抗凝血劑。crp是五聚體，其亞單位各自結合兩個ca²⁺-離子，在它們的幫助下發(fā)生與本發(fā)明中使用的配體的結合。因為檸檬酸鹽與高親和力的ca²⁺-離子結合，至今的推論是，在使用ca²⁺-依賴性配體的情況下，檸檬酸鹽對結合crp的柱容量具有負面效果。當然本申請的發(fā)明人能夠顯示，在使用配體的情況下容量更高。crp是調理素并且能夠以結合形式在c1q上激活補體系統(tǒng)。然而能夠出人意料地顯示的是，檸檬酸鹽防止補體激活，這又進一步提高容量，從而檸檬酸鹽在使用配體的情況下導致進一步增容。在ca²⁺-依賴性配體的情況下發(fā)生的這些效果在us2007/225226a1的背景下是完全出人意料的。

wo2007/076844公開方法，其通過從血漿通過單采血液成分術進行體外crp-移除降低患者(通過增加的血液crp-水平造成的)風險。根據(jù)該發(fā)明，為此使用包含基質的柱，其上結合磷酸膽堿-衍生物用于結合crp并從血漿清除，并且因此治療和/或預防自身免疫疾病，心血管疾病，糖尿病以及腎功能不全。

slagman等人(bloodpurif.,2011,31:9)展示豬模型，其在心肌梗死后通過體外單采血液成分術成功降低血液crp-水平。

在體外使用血液和血漿發(fā)生的問題是，無論是分析或制備應用的情況下還是在透析或單采血液成分術的情況下，發(fā)生的凝血不僅阻礙使用本身或使其變得不可能，而且同樣能夠阻塞或污染所用的設備。出于該原因，在從人或動物體移除后向血液或血漿直接添加凝血抑制劑(所謂的抗凝劑)。

抑制凝血的一種可能是給予ca²⁺-螯合劑例如edta(乙二胺四乙酸)，草酸鹽和檸檬酸鹽。在凝血期間作為一些凝血因子的輔因子需要鈣。借助ca²⁺-螯合劑從血液或血漿抽取鈣，并因此抑制凝結。然而，此處對于通過磷酸膽堿或磷酸乙醇胺或磷酸膽堿-衍生物或磷酸乙醇胺-衍生物移除crp的親和色譜方法存在一個重要問題。因為crp與磷酸膽堿或與其衍生物的結合需要ca²⁺(blacketal.,journalofbiologicalchemistry,2004,279:48487；thompsonetal.,structure,1999,7(2):169-177)，現(xiàn)有技術中的一致意見是，在crp與磷酸膽堿結合期間絕對避免提供ca²⁺-螯合劑(參見例如wo90/12632)。因此，在crp與磷酸膽堿的親和色譜結合期間使用含檸檬酸的結合緩沖液按照現(xiàn)有技術是完全不合適的。然而含檸檬酸的溶液適于(類似于提供edta)作為洗脫緩沖液，亦即用于使所結合的crp再次從磷酸膽堿脫落。

ca²⁺-獨立的抗凝作用的一種可能在于給予肝素。肝素是內源性物質，其通過肥大細胞生產(chǎn)并且抑制性地作用于凝血級聯(lián)。通過肝素與抗凝血酶ii(在血液循環(huán)中的蛋白酶抑制劑，其能夠滅活已活化的凝血因子如凝血酶和因子xa)的結合，觸發(fā)抗凝血酶ii的構象變化。由此，抗凝血酶ii-介導的凝血因子失活被加速2000-倍，從而停止凝血。因此，在從血液或血漿通過磷酸膽堿和磷酸膽堿-衍生物或磷酸乙醇胺和磷酸乙醇胺-衍生物親和色譜式移除crp的方法中至今僅將肝素用作抗凝劑。

然而這具有一些缺點，原因是在使用肝素的情況下，尤其是在未分級的肝素的情況下，除了出血還能夠發(fā)生免疫反應即肝素誘導的血小板減少癥(hit)。在此肝素誘導靜脈和動脈血栓形成。在同樣可能應用crp-單采血液成分術的卒中患者中，接受未分級的肝素的hit風險是約3％。此外肝素不允許與離心細胞分離器一起使用，后者經(jīng)常用來將血液分離為細胞成分和血漿。

本發(fā)明的任務是，為親和色譜式移除crp提供抗凝劑，其避免現(xiàn)有技術中與肝素-有關的問題，并且此外不妨礙crp與磷酸膽堿或磷酸乙醇胺及其衍生物的ca²⁺-依賴性結合。

該任務通過獨立權利要求的教導解決。從說明書、實例和未決專利權利要求產(chǎn)生其他有利設計。

出人意料地發(fā)現(xiàn)，通過采用檸檬酸溶液從生物液體借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷酰基氧基官能化的柱材料親和色譜式移除crp，不僅出人意料地使得從生物液體有效移除crp成為可能，并且因此也消除了現(xiàn)有技術中的問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及檸檬酸溶液的用途，其用于從生物液體通過用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧嫌H和色譜式移除crp。

術語"crp"如本文所用與"c-反應性蛋白質"同義。其在本文中優(yōu)選指人c-反應性蛋白質。

術語"親和色譜式移除crp"如本文所用意指，移除crp通過crp與用于移除crp的試劑成分之間的特異性結合而發(fā)生。就此而言也能夠表述為"親和色譜移除crp"或"選擇性移除crp"。在crp和相應官能化的柱材料之間的這種特異性結合基于crp-蛋白質的結構特性，并且能夠包括例如crp與磷酸膽堿的特征結合或者crp與指向crp表位的抗體的結合。選擇性或分子特異性移除crp意味著，crp與生物液體的其它成分相比以更高的親和力與官能化的柱材料結合。因此，與移除crp有關的術語"選擇性"如本申請所用意指，經(jīng)移除的crp與在生物液體中包含的crp量的比例是其它經(jīng)移除的物質與在生物液體中包含的物質的各自比例的至少三倍。然而，與移除crp有關的術語"選擇性"如本申請所用不僅意指crp移除。此處對技術人員明顯的是，在這種親和色譜式移除crp的情況下在一定程度上必然也能夠使其它物質(無意)與柱材料結合，并因此也在一定程度上隨之移除。例如，蛋白質中在一定程度上存在與crp結構一致的結構，其負責與ω-膦?；趸榛@基和/或與ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸奶禺愋越Y合，因此這些結構相似的蛋白質也在一定程度上被結合。一種實例是例如抗體，其指向磷酸膽堿并因此在用磷酸膽堿官能化的柱材料的情況下能夠同樣結合。又一可能性則在于，從未完全避免的生物液體成分與例如基質襯底材料的非特異性結合。

如上所述，crp與磷酸膽堿或其衍生物或者磷酸乙醇胺或其衍生物的結合取決于ca²⁺的存在，并且因此crp與在柱材料之中或之上固定化的ω-膦?；趸榛@基和/或與ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸慕Y合也同樣取決于ca²⁺的存在。

因此本發(fā)明同樣涉及檸檬酸溶液從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其中所述親和色譜式移除crp借助crp與用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧系?ca²⁺-依賴性)結合而進行。

根據(jù)本發(fā)明的檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其中所述親和色譜式移除crp借助crp與用ω-膦酰基氧基烷基銨基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧系?ca²⁺-依賴性)結合來進行，自然意指在crp-移除之前將檸檬酸溶液與應從其移除crp的生物液體混合。檸檬酸溶液因此在crp與柱材料的ω-膦酰基氧基烷基銨基和/或ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸南ＭY合期間存在。因此能夠根據(jù)親和色譜領域以外的術語提及的是，檸檬酸溶液用作"結合緩沖液"。

然而這并不意味著，檸檬酸溶液用作"洗脫溶液"(或用作"洗脫緩沖液")和因此用于從用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷酰基氧基官能化的柱材料移除crp，并因此再生柱材料。

術語"結合緩沖液"(也稱為"結合溶液")如本文所用在從試樣(本文的生物液體例如血液或血漿)通過親和色譜方法移除物質(本文中選擇性和ca²⁺-依賴性移除crp)的情況下表示一種溶液，其被添加至試樣并且然后隨試樣一起施用至用于移除物質的柱材料上(本文中的用ω-膦酰基氧基烷基銨基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧?。借助結合緩沖液應該保證用于待移除物質與柱材料的特異性結合的充足條件。

術語"洗脫緩沖液"(也稱為"洗脫溶液")如本文所用在從試樣(本文的生物液體例如血液或血漿)通過親和色譜方法移除物質(本文的選擇性和ca²⁺-依賴性移除crp)的情況下表示一種溶液，其在將試樣施用至柱材料并且待移除物質與柱材料特異性結合發(fā)生之后應用，以再次解開特異性結合并因此將待移除物質再次從柱材料解開(或洗脫)。不同于結合緩沖液，因此應該借助洗脫緩沖液在柱材料中形成條件，所述條件并不使待移除物質的結合成為可能，而是甚至相反地防止所述結合。

本發(fā)明因此也涉及檸檬酸溶液從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其中所述親和色譜式移除crp借助crp與用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷酰基氧基官能化的柱材料(ca²⁺-依賴性)結合而進行，其中所述檸檬酸溶液在從生物液體親和色譜式移除crp的情況下充當結合緩沖液(或結合溶液)。

術語"生物液體"如本文所用是指出現(xiàn)在哺乳動物和優(yōu)選人當中的水性溶液，例如腦脊液，腹腔液，胸膜液，腹水，血液，血漿，肝提取物和組織間液。本發(fā)明自然是指包含crp的生物液體。

本發(fā)明因此同樣指向檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧蟻磉M行，其中所述生物液體是指血液或血漿。

換句話說，本發(fā)明同樣指向檸檬酸溶液用于從血液和/或血漿親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧蟻磉M行。

檸檬酸溶液

術語"檸檬酸鹽"如本文所用是指檸檬酸陰離子，亦即檸檬酸的鹽，或換言之下述化學式的有機三羧酸鹽：

檸檬酸鹽/酯能夠以不同形式(或化合物)出現(xiàn)，亦即例如作為檸檬酸(1至3質子化的形式)，作為檸檬酸與其它(不同于h⁺的)無機陽離子結合的鹽(例如作為與金屬陽離子的金屬鹽或作為與銨離子的銨鹽)，但也作為檸檬酸偏酯。就此而言本文也使用術語"檸檬酸化合物"。

如果檸檬酸的鹽亦即檸檬酸陰離子與無機陽離子復合，在此也作為檸檬酸化合物的特殊形式提為"檸檬酸鹽"。

術語"檸檬酸溶液"如本文所用因此包括包含至少一種檸檬酸化合物的水性溶液。檸檬酸溶液成分的更詳細信息進一步提供于下文。

然而本發(fā)明優(yōu)選，檸檬酸溶液的檸檬酸濃度不小于1mm，優(yōu)選不小于1.1mm，優(yōu)選不小于1.2mm，進一步優(yōu)選不小于1.3mm，還進一步優(yōu)選不小于1.4mm和通常優(yōu)選不小于1.5mm。

此外本發(fā)明優(yōu)選，檸檬酸化合物是本發(fā)明檸檬酸溶液的重要組成部分。在這方面"重要組成部分"意指，檸檬酸溶液中全部檸檬酸化合物的總摩爾濃度與檸檬酸溶液中的其他化合物(然而除了水以外)相比，排在檸檬酸溶液中出現(xiàn)的最高的三個濃度。

本發(fā)明因此也指向檸檬酸溶液從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，其中所述檸檬酸溶液包含選自下組的至少一種檸檬酸化合物，所述組包含下述由下述組成：檸檬酸，檸檬酸二氫鈉，檸檬酸氫二鈉，檸檬酸三鈉，檸檬酸三鈉二水合物，檸檬酸二氫鉀，檸檬酸氫二鉀，檸檬酸三鉀，檸檬酸二氫鋰，檸檬酸氫二鋰，檸檬酸三鋰，檸檬酸二氫銨，檸檬酸氫二銨，檸檬酸三銨，二檸檬酸三鈣(檸檬酸鈣)，二檸檬酸三鎂(檸檬酸鎂)和/或檸檬酸偏酯。

按照本發(fā)明同樣可能的是，檸檬酸溶液包含多種上文列出的檸檬酸化合物的混合物。

術語"檸檬酸化合物"如本文所用不僅包括檸檬酸而且包括其鹽。

在本申請中使用一般術語"檸檬酸鈉"時，所述術語包括檸檬酸鈉的不同質子化形式，亦即不僅包括非質子化的形式(檸檬酸三鈉)，而且包括簡單質子化的形式(檸檬酸氫二鈉)或雙質子化的形式(檸檬酸二氫鈉)。

在本申請使用一般術語"檸檬酸鉀"時，所述術語包括檸檬酸鉀的不同質子化形式，亦即不僅包括非質子化的形式(檸檬酸三鉀)，而且包括簡單質子化的形式(檸檬酸氫二鉀)或雙質子化的形式(檸檬酸二氫鉀)。

在本申請中使用一般術語"檸檬酸鋰"時，所述術語包括檸檬酸鋰的不同質子化形式，亦即不僅包括非質子化的形式(檸檬酸三鋰)，而且包括簡單質子化的形式(檸檬酸氫二鋰)或雙質子化的形式(檸檬酸二氫鋰)。

在本申請中使用一般術語"檸檬酸銨"時，所述術語包括檸檬酸銨的不同質子化形式，亦即不僅包括非質子化的形式(檸檬酸三銨)，而且包括簡單質子化的形式(檸檬酸氫二銨)或雙質子化的形式(檸檬酸二氫銨)。

術語"檸檬酸偏酯"如本文所用表示檸檬酸的酯，然而其中并非檸檬酸的全部三個羧基(即-coo^-)都被酯化(即-coor，其中r是有機殘基)，而是檸檬酸的三個羧基中最多二個、然而優(yōu)選檸檬酸的三個羧基中最多一個被酯化。除了1至2個酯基，檸檬酸偏酯還包含1至2個生理學相容的無機陽離子(例如金屬陽離子如na⁺，k⁺)，其與1或2個未酯化的檸檬酸羧基復合。

本發(fā)明的優(yōu)選實施方式因此涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，其中所述檸檬酸溶液包含至少一種選自下組的檸檬酸化合物，所述包含下述或由下述組成：檸檬酸，檸檬酸二氫鈉，檸檬酸氫二鈉，檸檬酸三鈉，檸檬酸三鈉二水合物，檸檬酸二氫鉀，檸檬酸氫二鉀，檸檬酸三鉀，檸檬酸二氫鋰，檸檬酸氫二鋰，檸檬酸三鋰，檸檬酸二氫銨，檸檬酸氫二銨，檸檬酸三銨，二檸檬酸三鈣(檸檬酸鈣)，二檸檬酸三鎂(檸檬酸鎂)和/或檸檬酸偏酯，其中所述至少一種檸檬酸化合物選自檸檬酸以及與一價金屬陽離子的檸檬酸鹽。

本發(fā)明優(yōu)選，檸檬酸溶液不含檸檬酸鐵(ii)。還更優(yōu)選，檸檬酸溶液不含檸檬酸鐵(iii)。此外本發(fā)明優(yōu)選，檸檬酸溶液不含檸檬酸銅(ii)(二檸檬酸三銅)和不含檸檬酸鋁。

在本發(fā)明的其他優(yōu)選實施方式中，檸檬酸溶液不包含檸檬酸鈣(也稱為二檸檬酸三鈣)。

在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式中，檸檬酸溶液不包含檸檬酸鎂(也稱為二檸檬酸三鎂)或包含最高1mm濃度的檸檬酸鎂。

在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，檸檬酸溶液不包含檸檬酸鈣和不包含檸檬酸鎂或包含最高1mm濃度的檸檬酸鎂。

如果在本申請中提及溶液不包含某些物質則其是指，這些溶液完全不包含所述物質或者至少考慮到可能的不可避免的雜質，包含不超過0.01重量百分比的所述物質。

本發(fā)明的特別優(yōu)選實施方式因此涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，其中所述檸檬酸溶液包含至少一種選自下組的檸檬酸化合物，所述組包含下述或由下述組成：檸檬酸，檸檬酸二氫鈉，檸檬酸氫二鈉，檸檬酸三鈉，檸檬酸三鈉二水合物，檸檬酸二氫鉀，檸檬酸氫二鉀，檸檬酸三鉀，檸檬酸二氫鋰，檸檬酸氫二鋰，和/或檸檬酸三鋰。然而還優(yōu)選檸檬酸，檸檬酸二氫鈉，檸檬酸氫二鈉，檸檬酸三鈉，檸檬酸三鈉二水合物，檸檬酸二氫鉀，檸檬酸氫二鉀和/或檸檬酸三鉀。然而最通常優(yōu)選檸檬酸，檸檬酸二氫鈉，檸檬酸氫二鈉，檸檬酸三鈉和檸檬酸三鈉二水合物。

本發(fā)明還優(yōu)選，檸檬酸溶液除了所述一種或多種檸檬酸化合物之外并不包含額外的也即其他的螯合ca²⁺的非-檸檬酸-基物質(所謂的ca²⁺-螯合劑)。

本發(fā)明的優(yōu)選實施方式因此涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦酰基氧基烷基銨基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，其中所述檸檬酸溶液不包含化學上并不基于檸檬酸化合物的ca²⁺-螯合劑。化學上不基于檸檬酸化合物且因此不優(yōu)選的ca²⁺-螯合劑的可能實例是edta(乙二胺四乙酸)，egta(乙二醇-二(氨基乙基醚)-ν,ν,ν',ν'-四乙酸)，bapta(1,2-二(o-氨基苯氧基)乙烷-n,n,n',n'-四乙酸)以及草酸。

本發(fā)明的優(yōu)選實施方式因此涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，其中檸檬酸溶液包含至少一種選自下組的檸檬酸化合物，所述組包含下述或由下述組成：檸檬酸，檸檬酸二氫鈉，檸檬酸氫二鈉，檸檬酸三鈉，檸檬酸三鈉二水合物，檸檬酸二氫鉀，檸檬酸氫二鉀，檸檬酸三鉀，檸檬酸二氫鋰，檸檬酸氫二鋰，檸檬酸三鋰，檸檬酸二氫銨，檸檬酸氫二銨，檸檬酸三銨，二檸檬酸三鈣(檸檬酸鈣)，二檸檬酸三鎂(檸檬酸鎂)和/或檸檬酸偏酯，其中所述檸檬酸溶液除了檸檬酸化合物之外不含額外ca²⁺-螯合劑。

本發(fā)明因此還優(yōu)選，檸檬酸溶液不含edta(乙二胺四乙酸)，egta(乙二醇-二(氨基乙基醚)-n,n,n',n'-四乙酸)，bapta(1,2-二(o-氨基苯氧基)乙烷-n,n,n',n'-四乙酸)或草酸。

除了上文指定的檸檬酸化合物，檸檬酸溶液能夠包含額外的物質，然而其不具備ca²⁺-螯合特性。因此例如其他物質可能作為添加劑，其有助于檸檬酸溶液的容量滲透摩爾濃度大致對應生物液體亦即例如血液或血漿的容量滲透摩爾濃度。用于調節(jié)容量滲透摩爾濃度的這種物質包括無機鹽例如氯化鈉，氯化鉀，但也包括糖例如葡萄糖，右旋糖(d-葡萄糖)，果糖和蔗糖或肝素。術語葡萄糖和d-葡萄糖是同義詞并且能夠因此在本文中用作同義詞。

其他物質同樣可能充當添加劑，其起到調整檸檬酸溶液ph值為規(guī)定值例如生物液體(亦即例如血液或血漿)ph值的作用。本文例如可能的是，額外包含的物質與檸檬酸化合物一起形成緩沖系統(tǒng)，其能夠調整檸檬酸溶液的ph值并且能夠補償ph值的輕微波動。檸檬酸溶液包含由檸檬酸化合物和非-檸檬酸-緩沖物質組成的緩沖系統(tǒng)，因此也使用術語"含檸檬酸的緩沖液"。所加緩沖物質，其不是檸檬酸化合物(亦即非-檸檬酸-緩沖物質)，的可能實例包括磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，乳酸鹽和醋酸鹽。

由檸檬酸化合物和非-檸檬酸-緩沖物質組成的緩沖系統(tǒng)，亦即根據(jù)本發(fā)明的含檸檬酸緩沖液形式的檸檬酸溶液，的可能實例是檸檬酸與磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀的組合。然而特別優(yōu)選檸檬酸與磷酸氫二鈉的組合。

然而檸檬酸溶液包含二種不同的檸檬酸化合物，它們一起同樣代表緩沖系統(tǒng)，因此也使用術語"檸檬酸-緩沖液"。

由二種不同檸檬酸化合物構成的緩沖系統(tǒng)，亦即根據(jù)本發(fā)明的檸檬酸-緩沖液形式的檸檬酸溶液，的可能實例是檸檬酸與檸檬酸二氫鈉，檸檬酸氫二鈉，檸檬酸三鈉，檸檬酸二氫鉀，檸檬酸氫二鉀或檸檬酸三鉀的組合；檸檬酸二氫鈉與檸檬酸氫二鈉，檸檬酸三鈉，檸檬酸氫二鉀或檸檬酸三鉀的組合；檸檬酸二氫鉀與檸檬酸氫二鈉，檸檬酸三鈉檸檬酸氫二鉀或檸檬酸三鉀的組合；檸檬酸氫二鈉與檸檬酸三鈉或檸檬酸三鉀的組合；以及檸檬酸氫二鉀與檸檬酸三鈉或檸檬酸三鉀的組合。

然而特別優(yōu)選檸檬酸與檸檬酸三鈉的組合作為檸檬酸-緩沖液形式的檸檬酸溶液。

自然同樣可以想象的是，向包含二種不同檸檬酸化合物的檸檬酸溶液(亦即檸檬酸-緩沖液)繼續(xù)添加物質以調節(jié)容量滲透摩爾濃度。

本發(fā)明優(yōu)選，檸檬酸溶液僅由下述組成：水，一種或多種上文列出的檸檬酸-化合物，以及任選的一種或多種上文列出的調節(jié)容量滲透摩爾濃度的化合物(也稱為"等滲物(osmolytika)")和/或任選的一種或多種上文列出的非-檸檬酸-緩沖物質。

本發(fā)明的其他實施方式因此涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦酰基氧基烷基銨基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，其中所述檸檬酸溶液由下述組成：水；和

至少一種選自下組的檸檬酸化合物，所述組包含下述或由下述組成：檸檬酸，檸檬酸二氫鈉，檸檬酸氫二鈉，檸檬酸三鈉，檸檬酸三鈉二水合物，檸檬酸二氫鉀，檸檬酸氫二鉀，檸檬酸三鉀，檸檬酸二氫鋰，檸檬酸氫二鋰，檸檬酸三鋰，檸檬酸二氫銨，檸檬酸氫二銨，檸檬酸三銨，二檸檬酸三鈣(檸檬酸鈣)，二檸檬酸三鎂(檸檬酸鎂)和/或檸檬酸偏酯；和

(任選的)至少一種選自下組的化合物，所述組包含下述或由下述組成：氯化鈉，氯化鉀，葡萄糖，果糖和蔗糖，和/或

(任選的)至少一種選自下組的化合物，所述組包含下述或由下述組成：磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，乳酸鹽和醋酸鹽。

本發(fā)明的優(yōu)選實施方式因此涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷酰基氧基官能化的柱材料進行，其中所述檸檬酸溶液由檸檬酸，檸檬酸三鈉和水組成。

本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式因此涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，其中所述檸檬酸溶液包含38mm檸檬酸，74.8mm檸檬酸三鈉，和水。

本發(fā)明優(yōu)選實施方式因此涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷酰基氧基官能化的柱材料進行，其中所述檸檬酸溶液由檸檬酸，檸檬酸三鈉，d-葡萄糖和水組成。

由檸檬酸，檸檬酸三鈉，d-葡萄糖和水組成的檸檬酸溶液也稱為"酸-檸檬酸-葡萄糖-溶液(acd-溶液)"。

本發(fā)明優(yōu)選變型使用的檸檬酸溶液涉及acd-溶液，其包含在22.9mm和38.0mm之間的檸檬酸，在44.9mm和74.8mm之間的檸檬酸三鈉，在74.2mm和123.6mm之間的d-葡萄糖和水。

本發(fā)明特別優(yōu)選的變型使用的檸檬酸溶液涉及acd-溶液，其包含38mm檸檬酸，74.8mm檸檬酸三鈉，123.6mmd-葡萄糖和水。其也稱為"acd-a溶液"。

本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式因此涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷酰基氧基官能化的柱材料進行，其中所述檸檬酸溶液包含38mm檸檬酸，74.8mm檸檬酸三鈉，123.6mmd-葡萄糖和水。

本發(fā)明的其他優(yōu)選實施方式涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦酰基氧基烷基銨基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，其中所述檸檬酸溶液由檸檬酸，檸檬酸三鈉，磷酸氫鈉，d-葡萄糖和水組成。

由檸檬酸，檸檬酸三鈉，磷酸氫鈉，d-葡萄糖和水組成的檸檬酸溶液也稱為"檸檬酸-磷酸-葡萄糖-溶液(cpd)"。

本發(fā)明優(yōu)選變型使用的檸檬酸溶液涉及cpd-溶液，其包含15.6mm檸檬酸，89.4mm檸檬酸三鈉，128.7mmd-葡萄糖，16.1mm磷酸氫鈉和水。

本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式因此涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，其中所述檸檬酸溶液包含15.6mm檸檬酸，89.4mm檸檬酸三鈉，128.7mmd-葡萄糖，16.1mm磷酸氫鈉和水。

本發(fā)明其他優(yōu)選實施方式涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷酰基氧基官能化的柱材料進行，其中所述檸檬酸溶液由檸檬酸，檸檬酸三鈉，磷酸氫鈉，d-葡萄糖，腺嘌呤和水組成。

由檸檬酸，檸檬酸三鈉，磷酸氫鈉，d-葡萄糖，腺嘌呤和水組成的檸檬酸溶液也稱為"含腺嘌呤的檸檬酸-磷酸-葡萄糖-溶液(cpda)"。

本發(fā)明的優(yōu)選變型使用的檸檬酸溶液涉及cpda-溶液，其包含15.6mm檸檬酸，89.4mm檸檬酸三鈉，在128.7mm和160.9mm之間的d-葡萄糖，16.1mm磷酸氫鈉，2mm腺嘌呤和水。本發(fā)明其他優(yōu)選變型使用的檸檬酸溶液涉及cpda-溶液，其包含15.6mm檸檬酸，89.4mm檸檬酸三鈉，128.7mmd-葡萄糖，16.1mm磷酸氫鈉，2mm腺嘌呤和水。本發(fā)明特別優(yōu)選變型使用的檸檬酸溶液涉及cpda-溶液，其包含15.6mm檸檬酸，89.4mm檸檬酸三鈉，160.9mmd-葡萄糖，16.1mm磷酸氫鈉，2mm腺嘌呤和水。

本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式因此涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，其中所述檸檬酸溶液包含15.6mm檸檬酸，89.4mm檸檬酸三鈉，在128.7mm和160.9mm之間的d-葡萄糖，16.1mm磷酸氫鈉，2mm腺嘌呤和水。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式優(yōu)選，檸檬酸溶液不含與多價即二價或三價陽離子的金屬鹽。因此在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式中檸檬酸溶液不包含鈣鹽。在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式檸檬酸溶液不包含鎂鹽或至少包含最高1mm濃度的鎂鹽。

換句話說，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式優(yōu)選，檸檬酸溶液只包含與一價陽離子的金屬鹽。

檸檬酸濃度和用生物液體稀釋

本發(fā)明優(yōu)選實施方式因此涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦酰基氧基烷基銨基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，其中所述檸檬酸溶液具有在50mm至200mm，優(yōu)選60mm至150mm，還優(yōu)選70mm至120mm，還優(yōu)選75mm至115mm，和最通常優(yōu)選74.8mm至113mm范圍的檸檬酸總濃度。

本發(fā)明的優(yōu)選實施方式因此同樣涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，其中所述檸檬酸溶液具有優(yōu)選50mm，150mm，200mm，優(yōu)選60mm，優(yōu)選120mm，還優(yōu)選115mm，還優(yōu)選70mm，還優(yōu)選75mm，還優(yōu)選74.8mm，最通常優(yōu)選113mm的檸檬酸總濃度。

自然地，檸檬酸濃度不僅在原本的檸檬酸溶液中是重要的，并且特別在檸檬酸溶液和生物液體亦即例如血液或血漿組成的混合物中的最終濃度也是重要的。因此所用的檸檬酸溶液稀釋也是重要的。

因此本發(fā)明也涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，其中所述生物液體在移除crp之前與檸檬酸溶液混合。

本發(fā)明同樣涉及檸檬酸溶液作為結合緩沖液(或結合溶液)從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，其中所述生物液體在移除crp之前與檸檬酸溶液混合。

本發(fā)明因此也涉及檸檬酸溶液的用途從生物液體親和色譜式移除crp，其中所述親和色譜式移除crp借助crp與用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧系?ca²⁺-依賴性)結合而進行，并且其中所述生物液體在移除crp之前與檸檬酸溶液混合。

在檸檬酸溶液與生物液體(亦即例如血液或血漿)混合之后，將檸檬酸溶液和生物液體組成的混合物施用至用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷酰基氧基官能化的柱材料，從而發(fā)生crp與所述官能化的柱材料的(ca²⁺-依賴性)結合。

本發(fā)明因此同樣涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦酰基氧基烷基銨基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，其中所述檸檬酸溶液以1:50至1:5，優(yōu)選1:40至1:10，優(yōu)選1:30至1:20，優(yōu)選1:20至1:15，優(yōu)選1:15至1:10的范圍用生物液體稀釋。

本發(fā)明因此同樣涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦酰基氧基烷基銨基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，其中所述檸檬酸溶液以1:50，優(yōu)選1:45，進一步優(yōu)選1:40，優(yōu)選1:35，優(yōu)選1:30，優(yōu)選1:25，進一步優(yōu)選1:20，進一步優(yōu)選1:15，進一步優(yōu)選1:10，優(yōu)選1:5用生物液體稀釋。

本發(fā)明優(yōu)選實施方式因此涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，其中所述檸檬酸溶液以1:50至1:5的范圍用生物液體稀釋。

本發(fā)明的優(yōu)選實施方式因此也涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦酰基氧基烷基銨基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，其中所述檸檬酸溶液具有50mm至200mm，優(yōu)選60mm至150mm，還優(yōu)選70mm至120mm，還優(yōu)選75mm至115mm，和最通常優(yōu)選74.8mm至113mm的范圍的檸檬酸總濃度；并且其中所述檸檬酸溶液以1:50至1:5，優(yōu)選1:40至1:10，優(yōu)選1:30至1:20，優(yōu)選1:20至1:15，優(yōu)選1:15至1:10的范圍用生物液體稀釋。

本發(fā)明的進一步優(yōu)選實施方式因此也涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷酰基氧基官能化的柱材料進行，其中所述檸檬酸溶液具有70mm至120mm的范圍的檸檬酸總濃度；并且其中所述檸檬酸溶液以1:50至1:5的范圍用生物液體稀釋。

自然也可以想象使用檸檬酸溶液，其包含比前述段落的描述更低或者更高的檸檬酸濃度。因此，自然必須相應地減少(檸檬酸濃度較低)或提高(檸檬酸濃度較高)生物液體稀釋度。然而，在前述段落中描述的檸檬酸濃度和稀釋被證明是對本發(fā)明檸檬酸溶液從生物液體親和色譜式移除crp的用途特別有利的。

因為溶液ph值對從酸和堿(亦即也例如檸檬酸)的離解具有關鍵影響，并因此在本發(fā)明的情況下也影響與ca²⁺的結合，所使用的檸檬酸溶液的ph值是本發(fā)明的重要方面。

本發(fā)明因此也涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷酰基氧基官能化的柱材料進行，其中所述檸檬酸溶液具有ph4.0至ph7.0，優(yōu)選ph4.5至ph6.5，進一步優(yōu)選ph4.7至ph6.0，還進一步優(yōu)選ph4.9至ph5.8，還進一步優(yōu)選ph5.0至ph5.6，和最通常優(yōu)選ph5.0至ph5.5范圍的ph值。

crp的ca²⁺-依賴性配體

如已多次提及的，為了從生物液體例如從血液或血漿親和色譜式移除crp而使用柱材料，其包含磷酸膽堿和/或磷酸乙醇胺或其衍生物，由此crp與所述官能化的柱材料的ca²⁺-依賴性結合是可能的。

為此將磷酸膽堿，磷酸乙醇胺或其衍生物固定化在柱材料上。這通常通過有機連接體基團發(fā)生，磷酸膽堿，磷酸乙醇胺或其衍生物通過該基團吸附地或更優(yōu)選共價地與柱材料結合。這樣獲得所謂的"官能化的柱材料"，其中負責與crp的ca²⁺-依賴性結合的化學基團向外暴露，從而存在于生物液體中的crp也能接觸所述化學基團。

換句話說，術語"官能化的柱材料"如本文所用是指用于親和色譜法的柱材料，其攜帶官能化的化學基團。在這方面，官能化的化學基團能夠通過吸附或離子相互作用但優(yōu)選通過共價結合與柱材料結合。自然重要的是官能化的化學基團與柱材料結合，使得官能化的基團是活化且暴露的，從而保留其功能。因此可能的是，固定在柱材料上的基團(此處：ω-膦?；趸榛@基和/或ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸?與來自試樣(此處：生物液體例如血液或血漿)的配體(此處：crp)能夠相互作用或者能夠與其結合。

根據(jù)磷酸膽堿、磷酸乙醇胺或其衍生物通過銨基團或通過磷酸基團通過有機連接體與柱材料結合來區(qū)分用ω-膦酰基氧基烷基銨基官能化的(通過銨基團聯(lián)接)柱材料，和用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑?通過磷酸基團聯(lián)接)柱材料。

與柱材料(必要時通過有機連接體)的聯(lián)接在下式(i)和(ii)中通過銨基團氮原子上或磷酸基團氧原子上的虛線顯示。

術語"ω-膦?；趸榛@基"如本文所用能夠與"omega-膦酰基氧基烷基銨"同義地使用并且描述下述通式(i)的化合物

其中

n選自2和3；

r¹和r²彼此獨立地選自：-h，-ch3，-c2h5，-c3h7，-c4h9，-c5h11，-c6h13，或r¹和r²與它們與之結合的氮原子一起能夠形成選自下述的雜環(huán)：

其中一個或多個氫原子能夠被氟原子替換。

本發(fā)明因此同樣指向檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，其特征在于，ω-膦?；趸榛@基具有下述通式(i)

其中

n選自2和3；

r¹和r²彼此獨立地選自：-h，-ch3，-c2h5，-c3h7，-c4h9，-c5h11，-c6h13，或者r¹和r²與它們與之結合的氮原子一起能夠形成選自下述的雜環(huán)：

其中一個或多個氫原子能夠被氟原子替換。

優(yōu)選的ω-膦?；趸榛@基包括通式(i)化合物

其中

n＝2或3；

r¹和r²彼此獨立地選自：-h，-ch3，-c2h5，-c3h7或者r¹和r²與它們與之結合的氮原子一起能夠形成選自下述的雜環(huán)：

特別優(yōu)選的ω-膦?；趸榛@基包括通式(i)化合物

其中

n＝2；

r¹和r²選自：-h，-ch3，-c2h5，和特別優(yōu)選-ch3和-c2h5或者r¹和r²與它們與之結合的氮原子一起能夠形成選自下述的雜環(huán)：

包含上述ω-膦?；趸榛@基的和適于官能化相應柱材料的優(yōu)選化合物包括例如：

2-[2-(2-氨基乙氧基)乙基-二乙基-銨基]乙基-磷酸氫鹽，2-[4-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]嗎啉-4-鎓-4-基]乙基-磷酸氫鹽，2-[1-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]哌啶-1-鎓-1-基]乙基-磷酸氫鹽，2-[2-(2-氨基乙氧基)乙基-二甲基-銨基]乙基-磷酸氫鹽，2-[3-氨基丙基-(二甲基)銨基]乙基-磷酸氫鹽，2-[二甲基(4-硫烷基丁基)銨基]乙基-磷酸氫鹽，2-[4-疊氮基丁基(二甲基)銨基]乙基-磷酸氫鹽，2-[二甲基(戊-4-炔基)銨基]乙基-磷酸氫鹽，2-[3-(6-氨基己?；?氨基)丙基-二乙基-銨基]乙基-磷酸氫鹽，2-[1-[2-[2-(6-氨基己?；?氨基)乙氧基]乙基]哌啶-1-鎓-1-基]乙基-磷酸氫鹽，2-[4-[2-[2-[3-(6-氨基己?；被?丙?；被鵠乙氧基]乙基]嗎啉-4-鎓-4-基]乙基-磷酸氫鹽，2-[1-[2-[2-[6-(6-氨基己?；被?己?；被鵠乙氧基]乙基]吡咯烷-1-鎓-1-基]乙基-磷酸氫鹽，2-[2-烯丙氧基乙基(二甲基)銨基]乙基-磷酸氫鹽，2-[2-烯丙氧基乙基(二乙基)銨基]乙基-磷酸氫鹽，2-[4-(2-烯丙氧基乙基)嗎啉-4-鎓-4-基]乙基-磷酸氫鹽，2-[1-(2-烯丙氧基乙基)哌啶-1-鎓-1-基]乙基-磷酸氫鹽，2-[2-[2-(6-氨基己?；被?乙氧基]乙基-二甲基-銨基]乙基-磷酸氫鹽，2-[2-[2-[3-(6-氨基己?；被?丙?；被鵠乙氧基]乙基-二甲基-銨基]乙基-磷酸氫鹽，2-[3-疊氮基丙基(二甲基)銨基]乙基-磷酸氫鹽，2-[二甲基-[2-[2-(丙-2-炔氧基羰基氨基)乙氧基]乙基]銨基]乙基-磷酸氫鹽，2-[2-[2-(烯丙氧基羰基氨基)乙氧基]乙基-二甲基-銨基]乙基-磷酸氫鹽，2-[2-[2-[6-(烯丙氧基羰基氨基)己?；被鵠乙氧基]乙基-二甲基-銨基]乙基-磷酸氫鹽，2-[2-(6-氨基己?；被?乙基-二甲基-銨基]乙基-磷酸氫鹽，2-[二甲基-[3-[6-(丙-2-炔氧基羰基氨基)己?；被鵠丙基]銨基]乙基-磷酸氫鹽，以及2-[3-(6-氨基己?；被?丙基-二甲基-銨基]乙基-磷酸氫鹽。

術語"ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸?如本文所用能夠與"omega-銨烷氧基-羥基-磷酰基氧基"同義地使用并且描述下述通式(ii)化合物

其中

n選自2和3；

r¹，r²和r³彼此獨立地選自：-h，-ch3；-c2h5，-c3h7，-c4h9，-c5h11，-c6h13,

或者r¹和r²與它們與之結合的氮原子一起能夠形成選自下述的雜環(huán)：

和

r³選自：-h，-ch3，-c2h5，-c3h7，-c4h9，-c5h11，-c6h13，和優(yōu)選-h；

其中一個或多個氫原子能夠被氟原子替換。

優(yōu)選的ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸ㄍㄊ?ii)化合物

其中

n選自2和3；

r¹，r²和r³彼此獨立地選自：-h，-ch3，-c2h5，-c3h7，

或者r¹和r²與它們與之結合的氮原子一起能夠形成選自下述的雜環(huán)：

和r³＝-h。

在本發(fā)明范圍中特別優(yōu)選，ω-銨烷氧基-羥基-磷酰基氧基是指ω-三烷基銨烷氧基-羥基-磷?；趸?。

因此包括特別優(yōu)選的通式(ii)的ω-銨烷氧基-羥基-磷酰基氧基化合物

其中

n＝2；

和r¹，r²和r³選自：-h，-ch3，-c2h5和特別優(yōu)選-ch3和-c2h5。

因此同樣特別優(yōu)選，ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸侵甫?三甲基銨基乙氧基-羥基-磷?；趸颚?三甲基銨基丙氧基-羥基-磷?；趸?。

包含如上述ω-銨烷氧基-羥基-磷酰基氧基的和適于官能化相應柱材料的優(yōu)選化合物包括例如：p-氨基苯基磷酰膽堿(appc)，4-[[羥基[2-(三甲基銨基)乙氧基]氧膦基]氧基]-苯重氮基(p-重氮-苯基磷酸膽堿)或p-硝基苯-6-(o-磷酸膽堿)羥基丁酸酯。

本發(fā)明也指向檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，其特征在于ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸哂邢率鐾ㄊ?ii)

其中

n選自2和3；

r¹，r²和r³彼此獨立地選自：-h，-ch3，-c2h5，-c3h7，-c4h9，-c5h11，-c6h13,

或r¹和r²與它們與之結合的氮原子一起能夠形成選自下述的雜環(huán)：

和

r³選自：-h，-ch3，-c2h5，-c3h7，-c4h9，-c5h11，-c6h13，和優(yōu)選-h；

其中一個或多個氫原子能夠被氟原子替換。

本發(fā)明因此同樣指向檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷酰基氧基官能化的柱材料進行，其特征在于ω-膦?；趸榛@基具有下述通式(i)

其中

n選自2和3；

r¹和r²彼此獨立地選自：-h，-ch3，-c2h5，-c3h7，-c4h9，-c5h11，-c6h13，或者r¹和r²與它們與之結合的氮原子一起能夠形成選自下述的雜環(huán)：

其中一個或多個氫原子能夠被氟原子替換；

并且其特征在于ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸哂邢率鐾ㄊ?ii)

其中

n選自2和3；

r¹，r²和r³彼此獨立地選自：-h，-ch3，-c2h5，-c3h7，-c4hg，-c5h11，-c6h13,

或者r¹和r²與它們與之結合的氮原子一起能夠形成選自下述的雜環(huán)：

和

r³選自：-h，-ch3，-c2h5，-c3h7，-c4h9，-c5h11，-c6h13，和優(yōu)選-h；

其中一個或多個氫原子能夠被氟原子替換。

因此本發(fā)明同樣涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其中親和色譜式移除crp通過crp與用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷酰基氧基官能化的柱材料(ca²⁺-依賴性)結合而進行，其中ω-膦?；趸榛@基具有下述通式(i)

其中

n選自2和3；

r¹和r²彼此獨立地選自：-h，-ch3，-c2h5，-c3h7，-c4h9，-c5h11，-c6h13，或者r¹和r²與它們與之結合的氮原子一起能夠形成選自下述的雜環(huán)：

其中一個或多個氫原子能夠被氟原子替換。

本發(fā)明也指向檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其中親和色譜式移除crp通過crp與用ω-膦酰基氧基烷基銨基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧?ca²⁺-依賴性)結合而進行，其中ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸哂邢率鐾ㄊ?ii)

其中

n選自2和3；

r¹，r²和r³彼此獨立地選自：-h，-ch3，-c2h5，-c3h7，-c4h9，-c5h11，-c6h13,

或者r¹和r²與它們與之結合的氮原子一起能夠形成選自下述的雜環(huán)：

和

r³選自：-h，-ch3，-c2h5，-c3h7，-c4h9，-c5h11，-c6h13，和優(yōu)選-h；

其中一個或多個氫原子能夠被氟原子替換。

因此本發(fā)明同樣涉及檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其中親和色譜式移除crp通過crp與用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷酰基氧基官能化的柱材料(ca²⁺-依賴性)結合而進行，其中ω-膦酰基氧基烷基銨基具有下述通式(i)

其中

n選自2和3；

r¹和r²彼此獨立地選自：-h，-ch3，-c2h5，-c3h7，-c4h9，-c5h11，-c6h13，或者r¹和r²與它們與之結合的氮原子一起能夠形成選自下述的雜環(huán)：

其中一個或多個氫原子能夠被氟原子替換；和其中ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸哂邢率鐾ㄊ?ii)

其中

n選自2和3；

r¹，r²和r³彼此獨立地選自：-h，-ch3，-c2h5，-c3h7，-c4h9，-c5h11，-c6h13,

或者r¹和r²與它們與之結合的氮原子一起能夠形成選自下述的雜環(huán)：

和

r選自：-h，-ch3，-c2h5，-c3h7，-c4h9，-c5h11，-c6h13，和優(yōu)選-h；

其中一個或多個氫原子能夠被氟原子替換。

在本發(fā)明的可能實施方式中，ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸ㄟ^磷酸酯鍵與甘油分子(有機連接體)的羥基聯(lián)接，其中所產(chǎn)生的甘油酯然后通過甘油的第二羥基與柱材料聯(lián)接。在這樣的實施方式中還可能的是，甘油的剩余的第三羥基與脂肪酸酯化或與第二ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸セ?。此外甘油分子上的各酯化位置能夠變化。能夠用作脂肪酸的是通常飽和的、單烯烴、多烯烴、單炔烴、不飽和的線性和/或支化的具有8至28個碳原子的脂肪酸。優(yōu)選的脂肪酸殘基是棕櫚酸，花生四烯酸，氧代戊酸，戊二酸，環(huán)氧異前列烷和硬脂酸。

柱材料

原則上為了生產(chǎn)用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线m當?shù)氖侨慷栊陨V材料或柱材料用作材料，其特別地不與血液或血漿反應或者不改變或污染血液或血漿，使得血液或血漿在與柱材料接觸后不再能夠注射給患者。因此，本發(fā)明適當?shù)闹牧习ǖ幌抻冢?imgfile="bda0001319807550000322.gif"wi="299"he="79"img-content="drawing"img-format="gif"orientation="portrait"inline="no"/>聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，聚砜(ps)，聚醚砜(pes)，聚芳基醚砜(paes)，聚丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯-樹脂如聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)和聚(縮水甘油基甲基丙烯酸酯)(pgma)，聚(羥基甲基丙烯酸酯)，聚苯乙烯(ps)，聚四氟乙烯(ptfe)，聚丙烯酰胺，聚丙烯醛，丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(abs)，聚丙烯腈(pan)，聚氨酯(pu)，丙烯基-珠，瓊脂糖，纖維素基質，聚乙二醇(peg)，海藻酸鹽，角叉菜，殼多糖，淀粉，硝化纖維素，陶瓷基質，玻璃珠和/或固相-硅土或這些物質的混合物和/或衍生物。固相-硅土-基質能夠包括幾乎每種形式的具體硅土，包括無定形二氧化硅，如膠體硅土，硅膠，沉淀的硅土，和煙熏或熱解硅土；微晶硅土如硅藻土；和結晶硅土如石英。硅土應該具有大約45至120目(對應約345μm至125μm)范圍，優(yōu)選大約45至60目(對應約345μm至212μm)范圍的粒徑。

為了用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑?jīng)常使用已經(jīng)"預官能化"(即提供化學基團)的柱材料，其然后反過來使得ω-膦酰基氧基烷基銨基和/或ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸墓矁r連接成為可能。

柱材料的這種"預官能化"通過技術人員眾所周知的方法實現(xiàn)(chinjchem2012,30,2473；polymint2013,62,991)。還可商購得到一些已經(jīng)"預官能化的"柱材料，例如：af-環(huán)氧，af-氨基，af-三氟乙磺?；?，三氟乙磺?；?，環(huán)氧-活化6b(gehealthcarelifesciences)，cnbr-活化4快流(gehealthcarelifesciences)，ech4b(gehealthcarelifesciences)，nhs-活化4快流(gehealthcarelifesciences)，終端乙烯基砜活化4快流(affiland)，醛(agarose)4b，ech(agarose)4b(separopore)，sterogene生物分離公司的瓊脂糖，例如環(huán)氧-ultraflow-4瓊脂糖(sterogenebioseparations,inc.)，環(huán)氧-ultraflow-6瓊脂糖(sterogenebioseparations,inc.)，empbiotechgmbh的瓊脂糖，環(huán)氧-ultraflow-4瓊脂糖(empbiotechgmbh)，環(huán)氧-ultraflow-6瓊脂糖(empbiotechgmbh)，任何交聯(lián)度的活化瓊脂糖。

為了從血液或血漿體外移除crp特別適當?shù)氖歉鶕?jù)本發(fā)明的檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷酰基氧基官能化的柱材料進行，其用于在心臟驟停后復蘇以及用于預防和/或治療心血管疾病，其中心血管疾病特別是指心肌梗死(心肌梗塞)，卒中和肺栓塞。為了從血液或血漿體外移除crp同樣適當?shù)氖歉鶕?jù)本發(fā)明的檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，其用于預防和/或治療免疫系統(tǒng)的過度反應，其中所述免疫系統(tǒng)的過度反應選自慢性炎癥，移植排斥反應和變應性反應。根據(jù)本發(fā)明的檸檬酸溶液的用途因此特別適于從血液或血漿體外移除crp，從而預防和/或治療選自下組的慢性炎癥：痛風，骨關節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥，慢性炎性腸道疾病如克羅恩病和潰瘍性結腸炎，類風濕性關節(jié)炎，銀屑病關節(jié)炎，重癥肌無力，巴塞多氏病(graves病)，自身免疫性甲狀腺炎如hashimoto-甲狀腺炎和ord-甲狀腺炎，尋常型銀屑病，強直性脊柱炎(別赫捷列夫氏病)，肺出血腎炎-綜合征和特發(fā)性血小板減少性紫癜(itp)，紅斑狼瘡，硬皮病，舍格倫-綜合征，韋格納-肉芽腫(韋格納病)，多發(fā)性肌炎和皮肌炎。上述慢性炎癥包括屬于上位術語類風濕病的一些疾病，例如類風濕性關節(jié)炎，銀屑病關節(jié)炎，重癥肌無力，巴塞多氏病(graves病)，hashimoto-甲狀腺炎，ord-甲狀腺炎，尋常型銀屑病，強直性脊柱炎(別赫捷列夫氏病)，肺出血腎炎-綜合征和特發(fā)性血小板減少性紫癜(itp)，紅斑狼瘡，硬皮病，舍格倫-綜合征，韋格納-肉芽腫(韋格納病)，血管炎，風濕性多肌痛，多發(fā)性肌炎和皮肌炎。

檸檬酸是良好的抗凝劑，原因在于其防止血小板聚合以及補體激活。在使用血漿離心機時其是特別重要的。這需要檸檬酸，否則則發(fā)生凝結。這通過肝素的純抗凝作用是不可行的。此外檸檬酸在肝中于tca循環(huán)中快速代謝?；颊咭虼瞬活~外全身抗凝。特別是在梗死患者的情況下很有意義，原因是他們在標準梗死治療的范圍中無論如何已經(jīng)是強抗凝的(例如通過乙酰水楊酸，氯吡格雷)。額外的抗凝放大危急的出血風險。血漿離心機額外允許實現(xiàn)比膜(過濾器)基初級分離系統(tǒng)要小得多的血流。通常或期望的血漿流量為約30ml/分鐘。膜初級分離系統(tǒng)為此需要約150-200ml/分鐘的血流(效率為約17％)。血漿離心機滿足≤60ml/分鐘血流(效率約87％)。較小的血流量特別是在具有較少潛力的老年患者等的情況下簡單得多地實現(xiàn)。額外地，對于膜基初級分離系統(tǒng)通常需要創(chuàng)傷性很大的且對抗凝患者由于出血風險而危險的中央接觸(例如導管)，而在使用血漿離心機期間通過例如更大注射套管的周圍接觸(不帶來出血問題)通常就已足夠。

附圖說明

圖1：顯示純化crp的多個色譜過程的結果，其中以半對數(shù)表示crp-消耗％與應用的基質體積。將crp-濃度50mg/l的人血漿以1:5，1:10，1:20或1:50與檸檬酸溶液加入，將其施用至含0.5gappc-偶合的環(huán)氧-ultraflow-4瓊脂糖(sterogene)作為基質的色譜柱。不加檸檬酸的試樣作為對照。柱過程在5，10，25，50，和75基質體積流量捕獲于1ml級分中。隨后確定級分中的crp-濃度，根據(jù)crp起始濃度(施用前)確定crp-消耗％。數(shù)據(jù)點代表至少二個獨立實驗的平均值。

圖2：柱狀圖，其顯示血漿中的crp消耗量，其加和不加檸檬酸地通過用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行親和色譜純化。

圖3：顯示血漿施用至其上的sds-凝膠，其在不同的三天各自加和不加檸檬酸地通過用ω-膦酰基氧基烷基銨基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行親和色譜純化。箭頭標記c1q-條帶。在來自加入acd-a的血漿的洗脫液中，這些條帶包含較少蛋白質。

實施例

術語"基質體積"(也縮寫為mv)如本文所用是指各親和色譜中使用的柱材料體積。

實施例1：添加檸檬酸溶液對從血漿親和色譜純化crp的影響的比較研究

作為原料首先將crp-濃度約50mg/l的人血漿用35μm-過濾器過濾和必要時加入檸檬酸溶液(見下文)。

親和色譜的一般過程

為了進行色譜使用低壓-色譜系統(tǒng)(biologic^tmlp系統(tǒng)，bio-rad，münchen德國，目錄編號731-8300)、柱(mobicol"classic"，mobitecgmbh，德國，產(chǎn)品編號m1002)和35μμ-過濾器(mobitecgmbh，產(chǎn)品編號m523515)，其中填充0.5gappc-偶合的瓊脂糖(環(huán)氧-ultraflow-4瓊脂糖，sterogene)作為柱材料(1.6mgappc/ml)，即具有sepharose-基質的柱材料，所述基質偶合了磷酸膽堿-衍生物p-氨基苯基磷酰膽堿(appc)。將柱用3倍基質體積(mv)的洗滌緩沖液(0.1mtris，0.2mnacl，2mmcacl2，ph8.0)平衡，拋棄流過物。

隨后，將試樣施用至柱。通過柱下游的餾分收集器(biofrac^tmfractioncollector，bio-rad，目錄編號741-0002)將柱流過物分為各自1ml的級分。在5mv，10mv，25mv，50mv，75mv和100mv流量收集1ml-級分(也稱為流過級分)，而其余級分合并至所謂的"流過池"。

在樣品施加后隨后將柱用25mv洗滌緩沖液洗滌。隨后通過應用7.5mv洗脫緩沖液1(0.1mtris0.2mnacl，2mmedta，ph8.0)將柱結合的crp洗脫。在此，于uv-吸收超過0.01才隨后將洗脫液分餾并捕獲。

隨后將5mv洗脫緩沖液2(甘氨酸緩沖液ph2.8)用于柱的再生。在通過洗脫緩沖液1并未完全進行洗脫的情況下，在所述級分中還能夠存在蛋白質和特別是crp。為了crp在洗脫緩沖液2的2.8酸性ph值不變性，向洗脫液添加中和緩沖液(3.5mtris，ph9.0)。最終將柱再用20mv洗滌緩沖液洗滌。

過濾原料、流過池以及收集級分的crp-含量通過競爭的和對人crp特異性的免疫測試(參見例如實施例2)來進行確定。

從原料中的平均crp-濃度(也稱為平均[crp])出發(fā)，按照下述方程確定每個級分的百分比crp-消耗。

因此能夠根據(jù)級分(亦即柱流過物)中的crp-濃度，考慮到同樣確定的原料中的crp-濃度，推導出crp通過柱的保留。

能夠計算在柱上保留的總-crp-量，其方式為從原料中的總-crp-量減去流過池和各級分中的總-crp-量。

檸檬酸的影響

為了研究檸檬酸對從生物液體例如血漿親和色譜純化crp的影響，其通過用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行，以不同混合比例將檸檬酸溶液加入人血漿。所用的檸檬酸溶液組成如下：7.3g檸檬酸(無水)/升(即38mm檸檬酸)，22.0g檸檬酸三鈉二水合物/升(即74.8mm檸檬酸三鈉二水合物)，用水加至1l。檸檬酸溶液額外包含24.5g葡萄糖(一水合物)/升(即123.6mm葡萄糖一水合物)的實驗提供相同的結果。

在這方面研究了下述混合比例：

1:50即1份檸檬酸溶液+49份血漿

1:20即1份檸檬酸溶液+19份血漿

1:10即1份檸檬酸溶液+9份血漿

1:5即1份檸檬酸溶液+4份血漿

不加檸檬酸的人血漿作為參考樣本。向人血漿添加檸檬酸溶液在柱前用梯度混合器進行。

對于參考樣本(不加檸檬酸)以及對于各檸檬酸濃度進行二個獨立的親和色譜過程。

結果

在圖1中可見，在參考測量(即無檸檬酸)的情況下發(fā)生從血液的有效crp-消耗。在這方面，在樣品施加至柱的初始階段百分比消耗超過90％(參見5gv)，然后在樣品施加的額外進程降至不到50％。這樣降低解釋如下，隨著持續(xù)的測試任務所用的柱結合越來越多的crp，因此越來越飽和。

然而，在1:50至1:5的混合比例令人驚訝地顯示crp-消耗，其對應參考條件下的消耗效能(同樣參見圖1)。因此完全出乎意料的是，本發(fā)明的檸檬酸溶液用于從生物液體親和色譜式移除crp的用途能夠從血漿有效移除crp，其借助用ω-膦?；趸榛@基和/或用ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧线M行。

實施例2：hu-crp-elisa用于測定試樣中的crp-濃度

為了能夠確定從生物液體例如血漿親和色譜純化crp的有效性，通過免疫測試(elisa，酶聯(lián)免疫吸附測定法)進行對應試樣的人crp(hu-crp)的濃度測定。

為此首先將微量滴定板的凹槽用針對人crp的抗體涂層，其方式為各凹槽分別含100μl來自家兔的多克隆抗-人crp-抗體的溶液(dako，hamburg，德國；產(chǎn)品編號q0329)，以1:500稀釋于涂層緩沖液(0.1mnahco3)中，在室溫溫育1h。隨后用至少250μlpbst(0.1％tween20/pbs)洗滌四次。

為了濃度測定如下使用不加調節(jié)的樣品緩沖液(5mmedta/pbst)以及濃度300，200，100，50，30，15和8.3ngcrp/ml的標準系列(在樣品緩沖液中)。對于標準系列，將商購可得的crp-標準(人血清c-反應性蛋白質標準，162mgcrp/l；dako，產(chǎn)品編號x0923)相應地用樣品緩沖液稀釋。

此外，將具有高crp-濃度的參考樣本(人血清c-反應性蛋白質高對照；dako，產(chǎn)品編號x0926)以1:600和1:1500用樣品緩沖液稀釋以及具有低crp-濃度得到參考樣本(人血清c-反應性蛋白質低對照；dako，產(chǎn)品編號x0925)以1:250和1:1000用樣品緩沖液稀釋，并且用作elisa的額外參考樣本。將真正待測量的試樣(亦即例如原料、流過池、流過級分)以各自三份稀釋(在樣品緩沖液中)施用至微量滴定板。

微量滴定板每凹槽各自應用100μl，在室溫和在攪動下于振動裝置(600轉/分鐘)上溫育1.5h，隨后再用至少250μlpbst洗滌四次。

為了檢測隨后在封閉液(1％酪蛋白，0.9％nacl，0.001％硫柳汞)中添加過氧化物酶(pod)-標記的抗體(家兔-抗-hucrp-pod-共軛物，20μg/ml母液，1:1000稀釋)以及來自家兔的競爭性多克隆抗-人crp-抗體(dako，產(chǎn)品編號q0329，1:2000稀釋)。再施用各100μl/凹槽，在室溫和在攪動下于振動裝置(600轉/分鐘)溫育1.5h，后來再用至少250μlpbst洗滌四次。

隨后添加用于證明反應的底物。為此將3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb，25mg/ml，在dmso和etoh中)的溶液以1:250稀釋于底物緩沖液(0.01％h2o2/0.2m檸檬酸，ph3.95)，由此將各100μl移液入每個凹槽。在避光溫育10至15分鐘之后，通過添加50μl停止溶液/凹槽停止證明反應。隨后進行光度法檢測：通過借助微量滴定板-讀取器(biorad680xr，biorad，münchen，德國)測定450nm的消光(參考655nm)。

每個微量滴定板各自進行雙重測定以消除儀器測量誤差。此外每個測試手段重復三次，以提高結果的重現(xiàn)性。

在初步測試中，能夠排除所用的檸檬酸濃度對hu-crp-elisa可靠性的影響。

自然在此應指出，也能夠應用測定crp的其它方法來確定待研究試樣的crp-濃度。

實施例3：在檸檬酸情況下的crp消耗

將具有定義的crp-濃度(38.8mg/l)的血漿分為各自12.5ml。一半在添加檸檬酸(酸檸檬酸葡萄糖溶液a(acda)-溶液，1:15稀釋)的情況下通過親和色譜柱(0.5ml基質體積，由瓊脂糖和與之偶聯(lián)的4-氨基苯基磷酰膽堿組成)，另一半不加acda通過相同的柱。在單采血液成分術之前和之后確定crp-含量。由此計算移除的crp量。顯示的是，在添加檸檬酸之后更多crp在柱上結合并且被移除。結果顯示在圖2中。

此外將洗脫物應用至sds-凝膠上，其照片示于圖3。在此顯示的是，與不用檸檬酸溶液得到單采血液成分術相比，使用檸檬酸(acda)的單采血液成分術移除更少的補體(c1q)。

發(fā)明人如下解釋由于檸檬酸導致的柱容量增加，但不強求正確性。補體與crp結合，后者與ω-膦酰基氧基烷基銨基或ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸Y合。似乎的是，在檸檬酸存在下更少的補體被激活并且結合更少的c1q/c1r/c1s-復合物。在柱材料上直接或間接結合更少的c1q/c1r/c1s-復合物的情況下，也更少發(fā)生通過這些很大復合物的crp-結合的空間阻礙。

總之，向待純化的生物液體添加檸檬酸溶液導致通過ω-膦?；趸榛@基和/或ω-銨烷氧基-羥基-磷?；趸倌芑闹牧系娜萘刻岣?。此外，更少的補體被激活。在與肽配體比較的情況下，未觀察到這種通過檸檬酸的容量增加。