本申請(qǐng)要求2014年4月4日提交的名稱(chēng)為“Active Transport of Charged Molecules，into，Within，and/or from Charged Matrices”的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)61/975,575的權(quán)益，其通過(guò)引用整體并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

提供了用于向基質(zhì)中、在基質(zhì)中和/或從基質(zhì)中主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)(activetransport)分子的制品(article)和方法，所述基質(zhì)包括生物基質(zhì)。

背景技術(shù)：

分子的轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)于生命和許多工程化系統(tǒng)是必要的。轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程可以是被動(dòng)的或主動(dòng)的。被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)(passive transport)的一個(gè)實(shí)例是擴(kuò)散。擴(kuò)散是分子從高濃度區(qū)域向低濃度區(qū)域移動(dòng)的過(guò)程。在擴(kuò)散中，分子通過(guò)布朗運(yùn)動(dòng)(Brownian motion)移動(dòng)并且經(jīng)歷隨機(jī)游走(random walk)，這導(dǎo)致分子向低濃度方向上的凈位移。主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程利用能量來(lái)移動(dòng)分子。在一些主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，向包含分子的系統(tǒng)施加力，使得分子在力的方向上移動(dòng)。盡管分子可以通過(guò)被動(dòng)或主動(dòng)方式轉(zhuǎn)運(yùn)，但是分子的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)于許多應(yīng)用是有利的。因此，需要用于分子的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的改進(jìn)的制品和方法。

發(fā)明概述

提供了用于向基質(zhì)中、在基質(zhì)中和/或從基質(zhì)中主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)分子的制品和方法。在一些情況下，本發(fā)明的主題涉及相關(guān)產(chǎn)品、特定問(wèn)題的替代解決方案和/或一種或更多種系統(tǒng)和/或制品的多種不同用途。

在一組實(shí)施方案中，提供了制品。在一個(gè)實(shí)施方案中，制品包含電場(chǎng)發(fā)生器(electric field generator)；能夠定位在由所述發(fā)生器提供的場(chǎng)中的室，其中所述室的至少一部分由半透材料(semipermeable material)限定；和所述室中的樣品定位器(sample positioner)。

在另一組實(shí)施方案中，提供開(kāi)了方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括使用動(dòng)電場(chǎng)(electrodynamic field)驅(qū)動(dòng)分子通過(guò)基質(zhì)的至少一部分。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括使用電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)分子通過(guò)帶電基質(zhì)的至少一部分，從而使所述基質(zhì)的所述分子的濃度改變至少約10％，同時(shí)所述基質(zhì)變形(deforming)的量小于10％。

在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括在基質(zhì)的存在下使分子暴露于電場(chǎng)，以及使所述分子與所述基質(zhì)中的結(jié)合伴侶(binding partner)締合(associating)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括使用電場(chǎng)使分子分布到整個(gè)基質(zhì)中，其中整個(gè)所述基質(zhì)中所述分子的濃度的變化小于25％。

在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括在抑制分子的至少一部分與結(jié)合伴侶之間結(jié)合的條件下，使分子分布在包含所述分子的結(jié)合伴侶的整個(gè)基質(zhì)中。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括使用強(qiáng)度大于或等于10V/m的電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)分子通過(guò)帶電基質(zhì)。

在結(jié)合附圖考慮時(shí)，本發(fā)明的另一些優(yōu)點(diǎn)和新特征將通過(guò)本發(fā)明多個(gè)非限制性實(shí)施方案的以下詳細(xì)描述變得明顯。在本說(shuō)明書(shū)和通過(guò)引用并入的文獻(xiàn)包含沖突和/或不一致公開(kāi)內(nèi)容的情況下，應(yīng)以本說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。

附圖簡(jiǎn)述

將參照附圖通過(guò)舉例來(lái)描述本發(fā)明的一些非限制性實(shí)施方案，所述附圖是示意性的而并未旨在按比例繪制。在圖中，示出的每個(gè)相同的或接近相同的組件通常由單個(gè)附圖標(biāo)記表示。為了清楚起見(jiàn)，并沒(méi)有標(biāo)出每幅圖中的每個(gè)組件，并且在對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解本發(fā)明不必要示出的情況下，并沒(méi)有示出本發(fā)明的每個(gè)實(shí)施方案的每個(gè)組件。在附圖中：

圖1A-1B示出了根據(jù)某些實(shí)施方案，(1A)在基質(zhì)存在下分子的布朗運(yùn)動(dòng)，和(1B)分子通過(guò)擴(kuò)散向基質(zhì)中被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)；

圖2A-2B示出了根據(jù)一組實(shí)施方案，(2A)在基質(zhì)存在下使用電場(chǎng)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，和(2B)分子通過(guò)電泳線(xiàn)性運(yùn)動(dòng)向基質(zhì)中主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)；

圖3A-3B示出了根據(jù)某些實(shí)施方案，(3A)在基質(zhì)存在下使用電場(chǎng)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，和(3B)分子通過(guò)電泳線(xiàn)性運(yùn)動(dòng)向基質(zhì)中主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)；

圖4A-4B示出了根據(jù)一組實(shí)施方案，(4A)在基質(zhì)存在下使用電場(chǎng)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)；和(4B)分子通過(guò)電泳隨機(jī)游走向基質(zhì)中主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)；

圖5A-5C示出了根據(jù)某些實(shí)施方案，使用電場(chǎng)使(5A)分子向基質(zhì)中注入(infusion)，(5B)分子從基質(zhì)中移出，和(5C)分子分布在基質(zhì)中；

圖6A-6B示出了根據(jù)一組實(shí)施的方案，(6A)分子與具有分子的結(jié)合伴侶的基質(zhì)締合，和(6B)在某些條件下，分子在具有分子的結(jié)合伴侶的基質(zhì)中分布和締合；

圖7示出了根據(jù)一組實(shí)施方案，用于分子的電泳運(yùn)動(dòng)的制品；

圖8A-8F示出了根據(jù)某些實(shí)施方案，用于電泳隨機(jī)游走的方法和制品；

圖9A-9F示出了根據(jù)某些實(shí)施方案，在抑制或促進(jìn)分子與結(jié)合伴侶的締合的條件下用于電泳隨機(jī)游走的方法和制品；以及

圖10A-10G示出了根據(jù)一組實(shí)施方案，(10A-10D)免疫染色分子向腦組織中主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，和(10E-10G)厚腦樣品的免疫染色；

圖11A-11C示出了根據(jù)某些實(shí)施方案，(11A)用于分子的電泳運(yùn)動(dòng)的制品，(11B)五小時(shí)后使用靜態(tài)電轉(zhuǎn)運(yùn)清理(clear)的腦和通過(guò)隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)清理的腦，和(11C)使用靜態(tài)電轉(zhuǎn)運(yùn)清理的腦、使用隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)清理的腦和使用被動(dòng)擴(kuò)散清理的腦；

圖12A-12B示出了根據(jù)一組實(shí)施方案，(12A)經(jīng)受SYTO 16、Dylight 594綴合的番茄凝集素和Alexa 647綴合的抗組蛋白H3抗體的電泳運(yùn)動(dòng)的腦，和(12B)經(jīng)受SYTO 16、Dylight 594綴合的番茄凝集素和Alexa 647綴合的抗組蛋白H3抗體的被動(dòng)運(yùn)動(dòng)的腦；

圖13A-13B示出了根據(jù)某些實(shí)施方案，(13A)用于間接免疫組織化學(xué)的方案和(13B)全腦免疫染色后小鼠腦的腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmentalarea)的3D渲染(3D rendering)。

發(fā)明詳述

一般性描述了用于向基質(zhì)中、在基質(zhì)中和/或從基質(zhì)中主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)分子的制品和方法。在一些實(shí)施方案中，電場(chǎng)可用于改變分子相對(duì)于基質(zhì)的位置。電場(chǎng)可用于使分子移動(dòng)到基質(zhì)中的新位置、從基質(zhì)中移出分子或使分子注入到基質(zhì)中。例如，電場(chǎng)可用于使在基質(zhì)中具有結(jié)合伴侶的分子移動(dòng)到所述結(jié)合伴侶附近或離開(kāi)所述結(jié)合伴侶附近。在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)使分子暴露于動(dòng)電場(chǎng)改變分子的位置。在這樣的一些實(shí)施方案中，相對(duì)于常規(guī)分子轉(zhuǎn)運(yùn)方法，并且在一些情況下，相對(duì)于暴露于靜電場(chǎng)的分子，暴露于動(dòng)態(tài)電場(chǎng)的分子可具有增強(qiáng)的遷移率和最小的不利基質(zhì)相互作用。本文中所述的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方法和制品可特別好地適用于多種應(yīng)用，包括組織學(xué)、生物學(xué)和藥學(xué)應(yīng)用。

科學(xué)和技術(shù)中的多種應(yīng)用需要向基質(zhì)中、在基質(zhì)中或從基質(zhì)中轉(zhuǎn)運(yùn)分子。用于相對(duì)于基質(zhì)定位分子的常規(guī)方法通常依賴(lài)于被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方法，例如擴(kuò)散。但是，分子的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)可能相對(duì)緩慢，并且對(duì)于許多應(yīng)用，使用被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方法不能在必要的時(shí)間框架(timeframe)中實(shí)現(xiàn)相對(duì)于基質(zhì)的期望分子排布。圖1A-1B中示出了被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的一個(gè)實(shí)例。圖1A示出了分子20(例如，20A和20B)向基質(zhì)中擴(kuò)散。由于分子通過(guò)擴(kuò)散的運(yùn)動(dòng)是基于碰撞的，分子進(jìn)行小的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)，并且兩個(gè)分子的凈位移相對(duì)較小。因此，如圖1B中所示，分子20隨時(shí)間向基質(zhì)25的滲透相對(duì)最小并且分子積累在基質(zhì)的表面。

被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的替代方式是主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。常規(guī)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方法通常依賴(lài)于向含有分子和基質(zhì)的系統(tǒng)施加力(例如，水動(dòng)力(hydrodynamic force))。力可導(dǎo)致分子在力的方向上遷移，使得分子在力的方向上的凈位移與力的強(qiáng)度成正比。然而，許多常規(guī)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)受到能夠產(chǎn)生的力的大小和/或力對(duì)分子和/或基質(zhì)的影響的限制。例如，在一些實(shí)施方案中，高于某閾值的力和/或基質(zhì)長(zhǎng)時(shí)間暴露于力可不利地影響基質(zhì)。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明某些實(shí)施方案的情況下，可使用電場(chǎng)實(shí)現(xiàn)分子向基質(zhì)中、在基質(zhì)中和/或從基質(zhì)中迅速轉(zhuǎn)運(yùn)而不會(huì)不利地影響分子和/或基質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，可以以誘導(dǎo)非常規(guī)電泳運(yùn)動(dòng)的方式向分子施加電場(chǎng)，使得分子的凈位移相對(duì)于某些常規(guī)技術(shù)增強(qiáng)。不受理論的限制，在某些實(shí)施方案中，認(rèn)為本文中所述制品和方法可用于通過(guò)電泳隨機(jī)游走誘導(dǎo)分子運(yùn)動(dòng)，其模擬布朗運(yùn)動(dòng)，但是導(dǎo)致相對(duì)大的分子凈位移。

圖2-4中示出了本文中所述的使用電場(chǎng)的分子主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的實(shí)例。在一些實(shí)施方案中，帶電分子30(例如，30A和30B)可暴露于靜電場(chǎng)，如圖2A-2B中所示。帶電分子30(例如，30A和30B)所經(jīng)受的靜電場(chǎng)可誘導(dǎo)分子在靜電場(chǎng)方向上的電泳運(yùn)動(dòng)。如圖2A中所示，在電場(chǎng)中，具有較高電荷密度的分子30B可比具有較小電荷密度的分子30A移動(dòng)得更快。在這樣的一些實(shí)施方案中，如圖2A-2B中所示，電場(chǎng)可以是1維的，帶電分子可以在靜電場(chǎng)方向上線(xiàn)性移動(dòng)。如圖2B中所示，在某些實(shí)施方案中，分子30可在場(chǎng)方向(如箭頭所示)上迅速分布在基質(zhì)35中，而不會(huì)不利地影響分子和/或基質(zhì)和分子。在這樣的一些實(shí)施方案中，分子可以相對(duì)均勻地分布到整個(gè)基質(zhì)中。例如，分子可以分布到整個(gè)基質(zhì)中，使得整個(gè)基質(zhì)的分子濃度變化小于或等于約25％(例如，小于或等于約20％、小于或等于約15％、小于或等于約10％、小于或等于約5％)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，電場(chǎng)可用于驅(qū)動(dòng)分子通過(guò)帶電基質(zhì)的至少一部分，使得基質(zhì)中的分子濃度改變至少約10％(例如，至少約75％)，但是基質(zhì)的橫截面尺寸的變化或任何其他變形小于10％。在一些實(shí)施方案中，使用靜態(tài)電場(chǎng)使分子向基質(zhì)中、在基質(zhì)中和/或從基質(zhì)中主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)可很好地適用于不帶電基質(zhì)和具有相對(duì)低電荷密度的基質(zhì)等基質(zhì)。

在另一些實(shí)施方案中，如圖3A中所示，基質(zhì)45(例如，生物系統(tǒng))可具有相對(duì)高的電荷密度，以使基質(zhì)所經(jīng)受的靜電場(chǎng)誘導(dǎo)如圖3A中所示分子40(例如，分子40A和40B)和如圖3B中所示基質(zhì)45的電泳運(yùn)動(dòng)。在某些實(shí)施方案中，帶電基質(zhì)的電泳運(yùn)動(dòng)可比帶電分子的電泳運(yùn)動(dòng)顯著更慢，使得分子的至少一部分被驅(qū)動(dòng)進(jìn)入高度帶電的基質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，如圖3B中所示，高電荷基質(zhì)持續(xù)暴露于靜電場(chǎng)可造成基質(zhì)的橫截面尺寸改變和/或基質(zhì)的其他變形。在一些實(shí)施方案中，非傳統(tǒng)電泳方法和制品可用于使分子向基質(zhì)中、在基質(zhì)中和/或從基質(zhì)中移動(dòng)，而不會(huì)不利地影響分子和/或基質(zhì)和分子。

在一些實(shí)施方案中，如圖4B中所示，可使用動(dòng)電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)分子通過(guò)基質(zhì)(例如，高度帶電基質(zhì))的至少一部分，而不會(huì)不利地影響分子和/或基質(zhì)。例如，具有高電荷密度的基質(zhì)55可暴露于具有至少一種動(dòng)態(tài)特性(例如，作為時(shí)間的函數(shù)變化的方向和/或強(qiáng)度)的電場(chǎng)。在這樣的一些實(shí)施方案中，可避免由于電場(chǎng)和/或帶電分子的流動(dòng)使帶電基質(zhì)在單方向上經(jīng)受持續(xù)和顯著的力?；|(zhì)上應(yīng)力的降低顯著降低了基質(zhì)的變形。這可以是這樣的情況，例如，帶電基質(zhì)由于施加場(chǎng)而移動(dòng)，但是由于其相互連接性，基質(zhì)不能像基質(zhì)中相對(duì)未連接的分子移動(dòng)的那么多。當(dāng)電場(chǎng)相對(duì)于基質(zhì)變化(例如，場(chǎng)的方向變化)時(shí)，相對(duì)于更加相互連接的基質(zhì)，通常更廣泛地驅(qū)動(dòng)分子。隨著時(shí)間的凈效應(yīng)是分子比基質(zhì)顯著更廣泛地遷移(有時(shí)貫穿整個(gè)基質(zhì))，而基質(zhì)經(jīng)歷少得多的總凈運(yùn)動(dòng)，有時(shí)基本上沒(méi)有凈運(yùn)動(dòng)。例如，動(dòng)電場(chǎng)可用于驅(qū)動(dòng)分子通過(guò)相對(duì)高度帶電基質(zhì)的至少一部分，使得基質(zhì)中的分子濃度改變至少約10％(至少約75％)，但是基質(zhì)橫截面尺寸的變化小于或等于約10％(例如，小于或等于約3％)。

在一些實(shí)施方案中，動(dòng)電場(chǎng)可造成分子50經(jīng)歷電泳隨機(jī)游走，如圖4A中所示。電泳隨機(jī)游走可至少部分地由以下事實(shí)造成：隨著電場(chǎng)方向相對(duì)于基質(zhì)改變，以不同方向推動(dòng)(urge)基質(zhì)中的帶電分子。這與一些基質(zhì)中可存在的固有隨機(jī)路線(xiàn)(類(lèi)似于包含孔隙(void)和更剛性區(qū)域的泡沫中的通道)相結(jié)合，導(dǎo)致分子采取半隨機(jī)或隨機(jī)、非線(xiàn)性、變化的、可能扭曲的運(yùn)動(dòng)路線(xiàn)。不受理論的約束，認(rèn)為分子通過(guò)電泳隨機(jī)游走移動(dòng)的凈位移與電遷移率和電場(chǎng)乘積大小的二次方成比例，而電泳線(xiàn)性運(yùn)動(dòng)與電遷移率和電場(chǎng)乘積大小線(xiàn)性地成比例。這種二次方依賴(lài)性選擇性地加強(qiáng)了僅自由移動(dòng)的具有高電遷移率的帶電分子的遷移，而抑制具有低電遷移率的帶電基質(zhì)的運(yùn)動(dòng)。例如，在游離帶電分子具有比基質(zhì)束縛的分子高三個(gè)數(shù)量級(jí)的電遷移率的一個(gè)實(shí)施方案中，在誘導(dǎo)帶電分子1mm位移的條件下，束縛的分子在動(dòng)電場(chǎng)中僅移動(dòng)1nm(通過(guò)電泳隨機(jī)游走)，在靜電場(chǎng)中為1μm(例如，通過(guò)電泳線(xiàn)性運(yùn)動(dòng))。因此，認(rèn)為動(dòng)電場(chǎng)可用于提高分子向基質(zhì)中、在基質(zhì)中或從基質(zhì)中轉(zhuǎn)運(yùn)的速率。

本文中使用的術(shù)語(yǔ)“靜電場(chǎng)”和“靜態(tài)電場(chǎng)”具有其在本領(lǐng)域中的普通含義，可指不作為時(shí)間的函數(shù)改變的非零電場(chǎng)。相反地，術(shù)語(yǔ)“動(dòng)電場(chǎng)”和“動(dòng)態(tài)電場(chǎng)”具有其在本領(lǐng)域中的普通含義，可指具有至少一種作為時(shí)間的函數(shù)改變的特性的電場(chǎng)。通常來(lái)說(shuō)，所述特性可以是電場(chǎng)強(qiáng)度、電場(chǎng)方向、電場(chǎng)頻率或基質(zhì)在靜態(tài)電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)，或者同時(shí)兩種或更多種特性，但是也包括可以導(dǎo)致動(dòng)電場(chǎng)的其他電場(chǎng)變量特征。在一些實(shí)施方案中，電場(chǎng)的形狀可以改變以產(chǎn)生動(dòng)電場(chǎng)。電場(chǎng)的可以以允許電場(chǎng)“聚焦”于目標(biāo)區(qū)域的方式“成形(shaped)”。例如，可以操縱電場(chǎng)的形狀，使得跨越某個(gè)小的目標(biāo)區(qū)域的電勢(shì)差比電場(chǎng)中的其他周?chē)鷧^(qū)域的大。一般來(lái)說(shuō)，可使用動(dòng)電場(chǎng)的一個(gè)或更多個(gè)特性的任何合適的變化，只要基質(zhì)經(jīng)歷的電場(chǎng)是動(dòng)態(tài)的即可。在一些情況下，動(dòng)電場(chǎng)的一個(gè)或更多個(gè)特性的變化可以是規(guī)律的、無(wú)規(guī)律的和/或隨機(jī)的。在超過(guò)一種特性作為時(shí)間的函數(shù)變化的一些實(shí)施方案中，兩種或更多種特性的變化可以相同或不同。在一些設(shè)置中，對(duì)動(dòng)電場(chǎng)的可變性的貢獻(xiàn)可包括場(chǎng)強(qiáng)度在一段或更多段時(shí)間中降低到零或零附近。

還應(yīng)理解的是，本文使用的術(shù)語(yǔ)“靜電”場(chǎng)和“動(dòng)電”場(chǎng)是指當(dāng)施加場(chǎng)時(shí)基質(zhì)在大部分或全部時(shí)間點(diǎn)所經(jīng)歷的場(chǎng)。例如，定位在兩個(gè)靜止并且?guī)喾措姾傻狞c(diǎn)電荷之間的規(guī)律振蕩的異質(zhì)基質(zhì)可被稱(chēng)為在動(dòng)電場(chǎng)中并且可使用動(dòng)電場(chǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)分子。又例如，可向基質(zhì)施加動(dòng)電場(chǎng)，所述基質(zhì)的運(yùn)動(dòng)與電場(chǎng)的動(dòng)態(tài)特性相耦合，使得在所有時(shí)間點(diǎn)基質(zhì)對(duì)于電場(chǎng)的相對(duì)位置保持相同。所述基質(zhì)將稱(chēng)為在靜電場(chǎng)中并且可使用靜電場(chǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)分子。在另一個(gè)實(shí)例中，由電場(chǎng)發(fā)生器提供的靜電場(chǎng)中的靜止基質(zhì)可以稱(chēng)為在靜電場(chǎng)中并且可使用靜電場(chǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)分子。在一些實(shí)施方案中，本文中所述的制品可配置成產(chǎn)生動(dòng)態(tài)或靜態(tài)電場(chǎng)。

圖5A-5C中示出了驅(qū)動(dòng)分子通過(guò)基質(zhì)的至少一部分的非限制性實(shí)例。在一些實(shí)施方案中，如圖5A中所示，分子60可以是在基質(zhì)65的存在下。在一些實(shí)施方案中，分子的至少一部分可以在基質(zhì)外部。本文中所述的電場(chǎng)(例如，動(dòng)態(tài)、靜態(tài))可以施加于包含分子和基質(zhì)的區(qū)域。電場(chǎng)可以造成分子的至少一部分如箭頭所示擴(kuò)散到基質(zhì)的至少一部分中。在一些實(shí)施方案中，分子可以相對(duì)均勻地分布到整個(gè)基質(zhì)中，如圖5A中所示。例如，整個(gè)基質(zhì)的分子濃度變化可小于或等于約25％(例如，小于或等于約20％、小于或等于約15％、小于或等于約10％、小于或等于約5％、小于或等于約3％、小于或等于約2％、小于或等于約1％)。

在一些實(shí)施方案中，如圖5B中所示，分子70可以在基質(zhì)75內(nèi)。本文中所述的電場(chǎng)(例如，動(dòng)態(tài)、靜態(tài))可以施加于包含分子和基質(zhì)的區(qū)域。電場(chǎng)可以造成至少一部分分子如箭頭所示從基質(zhì)的至少一部分中移除。在某些實(shí)施方案中，電場(chǎng)可造成大百分比的分子從基質(zhì)中移除。例如，在一些實(shí)施方案中，電場(chǎng)可用于從基質(zhì)(例如，帶電基質(zhì))中移除至少約50％(例如，至少約60％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％)的期望的帶電分子。在某些實(shí)施方案中，可從基質(zhì)中移除基本上所有的所述分子，如圖5B中所示。

在一些實(shí)施方案中，基質(zhì)85可包含均勻分布在基質(zhì)內(nèi)的分子80，如圖5C中所示。在一些情況下，分子可以集中于基質(zhì)內(nèi)的一個(gè)或更多個(gè)位置，使得整個(gè)基質(zhì)內(nèi)的分子濃度具有相對(duì)大的變化。在這樣的一些實(shí)施方案中，整個(gè)基質(zhì)內(nèi)的分子濃度可以相對(duì)不均勻，使得基質(zhì)內(nèi)的不同區(qū)域之間存在顯著的濃度梯度。例如，分子可以集中于基質(zhì)內(nèi)部的一個(gè)位置，使得所述位置的分子濃度相對(duì)高，而基質(zhì)內(nèi)其他位置(例如，表面附近)的分子濃度相對(duì)低或?yàn)榱?。在一些?shí)施方案中，如圖5C中所示，本文中所述電場(chǎng)(例如，動(dòng)態(tài)、靜態(tài))可以施加于包含分子和基質(zhì)的區(qū)域。電場(chǎng)可以造成分子分布到整個(gè)基質(zhì)中，使得整個(gè)基質(zhì)中的分子濃度變化降低和/或相對(duì)低。例如，整個(gè)基質(zhì)中的分子濃度的變化可以小于或等于約25％(例如，小于或等于約20％、小于或等于約15％、小于或等于約10％、小于或等于約5％、小于或等于約3％、小于或等于約2％、小于或等于約1％)。

一般來(lái)說(shuō)，本文中所述的方法和制品可用于改變基質(zhì)中的分子濃度，如圖5中所示。在一些實(shí)施方案中，本文中所述的方法和制品可用于使基質(zhì)的分子濃度改變至少約10％(例如，至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約95％、至少約97％)。在一些實(shí)施方案中，本文中所述的方法和制品可用于使基質(zhì)的分子濃度改變相對(duì)大的百分比(例如，至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％或至少約95％)。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)本文中所述的方法和制品用于分別向基質(zhì)中注入和/或從基質(zhì)中移除分子時(shí)，可發(fā)生大的濃度變化。

在某些實(shí)施方案中，本文中所述的方法和制品可用于使基質(zhì)的分子濃度改變小的百分比，例如小于或等于約25％、小于或等于約20％、小于或等于約15％、小于或等于約10％或者小于或等于約5％。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)本文中所述方法和制品用于使已在基質(zhì)中的分子重排或分布時(shí)，可能發(fā)生小的分子濃度變化。

如本文中所述，在一些實(shí)施方案中，可以向基質(zhì)中、在基質(zhì)中或從基質(zhì)中轉(zhuǎn)運(yùn)分子，而不會(huì)不利地影響基質(zhì)。例如，帶電分子可以向基質(zhì)中、在基質(zhì)中或從基質(zhì)中移動(dòng)，而不顯著地改變基質(zhì)的一個(gè)或更多個(gè)橫截面尺寸或者基質(zhì)的其他形式的變形。例如，在某一實(shí)施方案中，所述方法可以以如下量改變基質(zhì)的一個(gè)或更多個(gè)橫截面尺寸或者基質(zhì)的其他形式的變形：小于約15％、小于約12％、小于約10％、小于約8％、小于約5％、小于約3％、小于約2％或小于約1％。例如，方法可以使用電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)分子通過(guò)帶電基質(zhì)的至少一部分，從而使基質(zhì)的分子濃度改變至少約10％(例如，至少約75％)，而基質(zhì)變形的量小于10％(例如，小于約3％)。

在一些實(shí)施方案中，基質(zhì)可包含一種或更多種待轉(zhuǎn)運(yùn)分子的一種或更多種結(jié)合伴侶。例如，如圖6A中所示，分子90可以是在包含分子的結(jié)合伴侶100的基質(zhì)95的存在下。如本文中所述，包含分子和基質(zhì)的區(qū)域可以暴露于電場(chǎng)(例如，動(dòng)態(tài)、靜態(tài))。電場(chǎng)可以如箭頭所示造成分子的至少一部分注入到基質(zhì)的至少一部分中，并且與結(jié)合伴侶締合。

在一些實(shí)施方案中，在驅(qū)動(dòng)分子通過(guò)基質(zhì)的至少一部分(進(jìn)入基質(zhì)的至少一部分、在基質(zhì)的至少一部分中和/或離開(kāi)基質(zhì)的至少一部分)之前和/或同時(shí)，分子和/或基質(zhì)可以暴露于抑制分子與結(jié)合伴侶之間締合的條件。例如，如圖6B中所示，分子和基質(zhì)110可暴露于改變分子特性(例如，電荷、分子構(gòu)象)的條件(例如，pH、離子濃度、化學(xué)物質(zhì)濃度)，其抑制分子與結(jié)合伴侶115之間的締合。圖6B示出了在暴露于所述條件之前具有特性A的分子105-A，其在暴露于所述條件后具有特性B，因此形成了分子105-B。然后可以驅(qū)動(dòng)分子105-B通過(guò)基質(zhì)的至少一部分。在一些實(shí)施方案中，在轉(zhuǎn)運(yùn)期間抑制分子與結(jié)合伴侶的締合可以提高轉(zhuǎn)運(yùn)速率和/或有利于分子在基質(zhì)中分布。例如，在分子總數(shù)小于結(jié)合伴侶總數(shù)的一些實(shí)施方案中，注入到基質(zhì)中的分子可在基質(zhì)表面或表面附近不均衡地與結(jié)合伴侶締合。在這樣的一些實(shí)施方案中，整個(gè)基質(zhì)中的分子濃度具有相對(duì)大的變化。

如圖6B中所示，在轉(zhuǎn)運(yùn)期間使分子和/或基質(zhì)暴露于抑制分子與結(jié)合伴侶之間締合的條件可允許分子分布到整個(gè)基質(zhì)中，使得整個(gè)基質(zhì)中的分子濃度變化相對(duì)低(例如，小于或等于約25％)。在分子105-B已分布在基質(zhì)中后，分子和/或基質(zhì)可暴露于促進(jìn)或不抑制分子與結(jié)合伴侶之間締合的條件。在這樣的一些實(shí)施方案中，分子105-B可形成分子105-A并且與結(jié)合伴侶締合。在某些實(shí)施方案中，促進(jìn)或不抑制締合的條件在一些情況下可以增強(qiáng)分子與結(jié)合伴侶締合的能力。

圖7中示出了本文中所述用于使用電場(chǎng)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)分子的制品120的實(shí)例。在一些實(shí)施方案中，所述制品可包含電場(chǎng)發(fā)生器140、室125、至少一個(gè)半透材料135和樣品定位器130，如圖7中所示。所述室可以能夠定位在由所述電場(chǎng)發(fā)生器(例如，兩個(gè)電極，陽(yáng)極和陰極)提供的場(chǎng)中，并且所述室的至少一部分由半透材料(例如，多孔材料、納米多孔材料)限定，所述半透材料具有特定的截留分子量(例如，約50,000至約500,000g/mol；約100,000g/mol至約500,000；約500g/mol至約10,000g/mol)。

一般來(lái)說(shuō)，可使用任何能夠產(chǎn)生電場(chǎng)的合適電場(chǎng)發(fā)生器。在一些情況下，電場(chǎng)發(fā)生器包含由來(lái)自電源(power supply)的電動(dòng)勢(shì)(electromotive force)來(lái)源驅(qū)動(dòng)的兩個(gè)或更多個(gè)電極(例如，陽(yáng)極和陰極)。在一些實(shí)施方案中，電場(chǎng)發(fā)生器可以能夠產(chǎn)生靜電場(chǎng)或動(dòng)電場(chǎng)?？梢允褂萌魏翁峁╈o態(tài)或動(dòng)態(tài)電場(chǎng)的合適方法。在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)在至少兩個(gè)電極之間提供靜態(tài)電勢(shì)差來(lái)產(chǎn)生靜電場(chǎng)，所述至少兩個(gè)電極在該過(guò)程中不相對(duì)于基質(zhì)移動(dòng)。動(dòng)電場(chǎng)可以多種方式產(chǎn)生。在一種中，產(chǎn)生場(chǎng)的設(shè)備的方向可以相對(duì)于基質(zhì)改變。例如，用于產(chǎn)生場(chǎng)的一組電極可以通過(guò)旋轉(zhuǎn)或者相對(duì)于基質(zhì)的其他運(yùn)動(dòng)等來(lái)相對(duì)于基質(zhì)移動(dòng)?；|(zhì)可以移動(dòng)，電極可以移動(dòng)，或者二者均可以移動(dòng)?；蛘撸⒎撬须姌O都需要相對(duì)于基質(zhì)移動(dòng)，但是任何電極相對(duì)于基質(zhì)的運(yùn)動(dòng)通常將改變場(chǎng)相對(duì)于基質(zhì)的方向。在另一組配置中，電極可以不相對(duì)于基質(zhì)移動(dòng)，但是施加于電極的電荷的極性和/或程度可以改變。例如，基質(zhì)可被若干電極圍繞，每個(gè)相對(duì)基質(zhì)定向不同，并且不改變相對(duì)于基質(zhì)的位置。施加于電極的電動(dòng)勢(shì)的強(qiáng)度可以隨時(shí)間改變，以產(chǎn)生隨時(shí)間變化的場(chǎng)，并且電極之間的極性可以改變，使得場(chǎng)相對(duì)于基質(zhì)以多種方式中的任一種移動(dòng)。在另一組配置中，可以通過(guò)動(dòng)態(tài)地改變基質(zhì)或基質(zhì)周?chē)牧黧w的電阻(resistance)來(lái)產(chǎn)生動(dòng)電場(chǎng)。例如，可以在電極之間注入高度黏性液體或引入氣泡以提高周?chē)黧w的電阻，其有效地增強(qiáng)通過(guò)基質(zhì)的電流。通過(guò)該描述，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠容易地確定這些技術(shù)中的變化和/或利用其他技術(shù)產(chǎn)生適于特定應(yīng)用的動(dòng)電場(chǎng)。

一般來(lái)說(shuō)，室可以是能夠定位在電場(chǎng)發(fā)生器之間的任何合適的容器，其至少一部分由半透材料限定，包圍樣品定位器并且保留流體。在某些實(shí)施方案中，室可以能夠定位在由電場(chǎng)發(fā)生器提供的場(chǎng)中。例如，如圖7中所示，室125定位在電場(chǎng)發(fā)生器140之間。在電場(chǎng)發(fā)生器包含電極的一些實(shí)施方案中，室可以能夠定位在兩個(gè)電極(例如，陽(yáng)極和陰極)之間。在某些實(shí)施方案中，室可移動(dòng)，并且可以手動(dòng)或通過(guò)自動(dòng)控制移動(dòng)到場(chǎng)中。在另一些情況下，室可以是靜止的并且如此定位以使室在電場(chǎng)發(fā)生器提供電場(chǎng)的區(qū)域中。

在一些實(shí)施方案中，室的至少一部分由半透材料限定。半透材料可以是選擇性滲透膜。在一些實(shí)施方案中，半透材料可允許某些分子保留在室中，而允許另一些分子離開(kāi)室。在這樣的一些實(shí)施方案中，期望分子在室中的保留可以使實(shí)現(xiàn)用于給定應(yīng)用的期望結(jié)果所需分子的量最小化。例如，保留用于基質(zhì)染色的分子可使基質(zhì)染色所需染色分子的量最小化。在一些實(shí)施方案中，保留某些分子可以允許分子均勻分布在室中和/或阻止分子與電場(chǎng)發(fā)生器相互作用。在一些實(shí)施方案中，半透材料135可以具有某截留分子量和/或截留尺寸，使得半透材料對(duì)于處于或高于截留分子量和/或尺寸的分子是基本上不可滲透的。例如，如圖7中的插圖中所示，半透材料135對(duì)于分子150可能是基本上不可滲透的，但是對(duì)于具有較小分子量和/或尺寸的另一些分子(例如，155和160)是可滲透的。在一些實(shí)施方案中，半透材料可以是多孔的。例如，半透材料可以是納米多孔材料。

本文中使用的術(shù)語(yǔ)“截留分子量”具有其在本領(lǐng)域中的普通含義，可指大于90％的分子被半透材料保留或者大于99％的分子被半透材料保留時(shí)的最低分子量。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將意識(shí)到，半透材料保留分子的能力還依賴(lài)于分子的形狀，例如在一些情況下，具有所需分子量的分子可由于其形狀而不被保留。例如，具有所需分子量的線(xiàn)性分子可能不被保留，而具有相同分子量的球蛋白分子被保留。術(shù)語(yǔ)“截留尺寸”具有其在本領(lǐng)域中的普通含義，可指大于90％的分子被半透材料保留或者大于99％的分子被半透材料保留時(shí)的最小分子尺寸。分子的尺寸可以通過(guò)分子的分子量或分子的橫截面尺寸(例如，球狀分子)限定。

一般來(lái)說(shuō)，可以基于待保留分子的一種或更多種特性來(lái)選擇截留分子量和/或尺寸。例如，具有相對(duì)高截留分子量和/或尺寸(例如，約50,000g/mol至約500,000g/mol；約100,000g/mol至約500,000g/mol)的半透材料可用于保留具有高分子量的分子，例如抗體。在另一些實(shí)例中，具有相對(duì)低截留分子量和/或尺寸(例如，約500g/mol至約10,000g/mol；約500g/mol至約5,000g/mol；約500g/mol至約3,000g/mol)的半透材料可用于保留具有低分子量的分子，例如肽、小分子、寡聚體、引物等。在一些實(shí)施方案中，半透材料的截留分子量可以為約500,000g/mol、約350,000g/mol、約200,000g/mol、約100,000g/mol、約75,000g/mol、約50,000g/mol、約25,000g/mol、約10,000g/mol、約5,000g/mol、約3,000g/mol、約2,000g/mol、約1,000g/mol或約500g/mol。在某些實(shí)施方案中，截留分子量可以為約500g/mol至約500,000g/mol、約1,000g/mol至約500,000g/mol、約10,000g/mol至約500,000g/mol、約50,000g/mol至約500,000g/mol、約100,000g/mol至約500,000g/mol、約500g/mol至約50,000g/mol、約500g/mol至約10,000g/mol、約500g/mol至約5,000g/mol、約1,000g/mol至約50,000g/mol或約1,000g/mol至約10,000g/mol。在一些實(shí)施方案中，半透材料的截留尺寸可以是約10微米、約5微米、約3微米、約2微米、約1微米、約0.8微米、約0.6微米、約0.5微米、約0.3微米、約0.2微米、約0.1微米、約0.05微米、約0.01微米、約0.005微米、約0.001微米或約0.0005微米。在一些實(shí)施方案中，截留尺寸可以是約0.001微米至約10微米、約0.001微米至約5微米、約0.001微米至約1微米、約0.001微米至約0.5微米、約0.001微米至約0.1微米、約0.1微米至約10微米、約0.1微米至約10微米或約1微米至約10微米。

在一些實(shí)施方案中，半透材料的平均孔徑可小于或等于約5微米、小于或等于約3微米、小于或等于約2微米、小于或等于約1微米、小于或等于約0.8微米、小于或等于約0.6微米、小于或等于約0.5微米、小于或等于約0.3微米、小于或等于約0.2微米、小于或等于約0.1微米、小于或等于約0.05微米、小于或等于約0.02微米、小于或等于約0.01微米或者小于或等于約0.005微米并且大于零。

在一些實(shí)施方案中，用于使用電場(chǎng)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)分子的制品還可包含樣品定位器。樣品定位器可以配置為容納基質(zhì)(例如，生物系統(tǒng))。在一些實(shí)施方案中，樣品定位器還可配置為在室中移動(dòng)。所述基質(zhì)可充分固定于所述樣品定位器，使得基質(zhì)隨樣品定位器移動(dòng)。在某些實(shí)施方案中，樣品定位器可以能夠沿著限定路徑振蕩和/或移動(dòng)。在一些實(shí)施方案中，樣品定位器的運(yùn)動(dòng)可用于形成動(dòng)電場(chǎng)。例如，基質(zhì)(例如，生物系統(tǒng))可定位在樣品定位器上，并且樣品定位器可旋轉(zhuǎn)，使得基質(zhì)經(jīng)歷動(dòng)電場(chǎng)。一般來(lái)說(shuō)，樣品電位器可配置為產(chǎn)生用于形成靜態(tài)或動(dòng)態(tài)電場(chǎng)的任何合適的運(yùn)動(dòng)。例如，在一些實(shí)施方案中，樣品定位器可連續(xù)或周期性移動(dòng)。在一些實(shí)施方案中，定位器可與控制樣品定位器運(yùn)動(dòng)的控制系統(tǒng)連接。

在一些實(shí)施方案中，除了上述組件以外，制品可任選地包含外室、溫度控制器、混合器、緩沖液循環(huán)器、流體入口或流體出口中的一種或更多種。在一些實(shí)施方案中，制品可以包含圍繞室125的至少一部分的外室。外室可包含流體。在一些情況下，外室與流體再循環(huán)系統(tǒng)連接，所述流體再循環(huán)系統(tǒng)被配制為通過(guò)一個(gè)或更多個(gè)流體入口和出口轉(zhuǎn)運(yùn)流體進(jìn)入室或離開(kāi)室。在一些實(shí)施方案中，外室和室可以通過(guò)半透材料彼此流體連通。在一些實(shí)施方案中，制品包含與外室和/或室流體連通的一個(gè)或更多個(gè)緩沖液循環(huán)器。所述緩沖液循環(huán)器可用于替換、補(bǔ)充或移動(dòng)室(例如，外室)的至少一部分中的緩沖液。在一些實(shí)施方案中，制品可包含溫度控制器。溫度控制器可用于控制制品的至少一部分中的流體的溫度。例如，溫度控制器可用于控制外室和/或室中流體的至少一部分的溫度。在一些實(shí)施方案中，制品可包含混合器，其允許一種或更多種流體在進(jìn)入室之前混合和/或在一個(gè)或更多個(gè)室中混合一種或更多種流體。

在一些實(shí)施方案中，本文中所述分子可以是或包含大分子(例如，聚合物)、生物大分子、配體、多核苷酸、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、抗體、小分子(例如，有機(jī)的、無(wú)機(jī)的)、核酸、多糖或生物學(xué)分子(biologic)。在某些實(shí)施方案中，超過(guò)一種分子可以移入基質(zhì)、在基質(zhì)中移動(dòng)或移出基質(zhì)。在這樣的一些情況下，分子可以是相同類(lèi)型或不同類(lèi)型，并且可以選自上文中提到的組。在一些實(shí)施方案中，分子可以是光致發(fā)光分子或包含光致發(fā)光分子，例如染料、熒光分子或其他光致發(fā)光分子。在其中分子是或包含染料的一些實(shí)施方案中，染料可用于體外成像。在一些實(shí)施方案中，分子可以是或包含藥物活性劑(即，藥物)。藥物活性劑可以是任何生物活性劑。在一些實(shí)施方案中，藥物活性劑可選自美國(guó)食品和藥品管理局(F.D.A.)出版的“Approved Drug Products with Therapeutic Equivalenceand Evaluations”(“橙皮書(shū)”(Orange Book))。在其中分子是或包含藥物活性劑(即，藥物)的一些實(shí)施方案中，可以驅(qū)動(dòng)藥物活性劑進(jìn)入基質(zhì)，并且包含所述藥物活性劑的基質(zhì)可用于治療應(yīng)用。

在一些實(shí)施方案中，本文中所述的基質(zhì)可以是或包含生物系統(tǒng)(例如組織、細(xì)胞)、聚合物基質(zhì)(例如，交聯(lián)的、未交聯(lián)的)、生物衍生基質(zhì)、無(wú)機(jī)基質(zhì)、有機(jī)基質(zhì)或其組合。在一些實(shí)施方案中，基質(zhì)可以是生物基質(zhì)。本文中使用的生物基質(zhì)可指包含至少一個(gè)生物細(xì)胞的基質(zhì)。生物細(xì)胞可以是活細(xì)胞或非活細(xì)胞(例如，原核細(xì)胞、真核細(xì)胞)。生物基質(zhì)的非限制性實(shí)例包括單細(xì)胞、單細(xì)胞生物體(細(xì)菌)、多細(xì)胞生物體、細(xì)胞聚集體、生物組織或整個(gè)器官或其組合。在一些實(shí)施方案中，生物基質(zhì)可以包含一種或更多種生物組織(例如，神經(jīng)組織)。合適組織的非限制性實(shí)例包括結(jié)締組織、神經(jīng)組織、肌肉組織(例如，骨骼肌組織、心肌組織、平滑肌組織)和上皮組織。在一些實(shí)施方案中，生物基質(zhì)可以是整個(gè)器官(例如，腦)或器官的一部分。可以部分地或整體上作為生物基質(zhì)使用的器官的非限制性實(shí)例包括腦、心臟、肺、腸、胃、脾、皮膚、肝、前列腺、膀胱、胰腺、甲狀腺、腎、骨骼、脊髓和眼等。在一些實(shí)施方案中，基質(zhì)可以是聚合物基質(zhì)?？梢允褂萌魏魏线m的聚合物基質(zhì)。在一些情況下，聚合物基質(zhì)可以是帶電聚合物基質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，基質(zhì)可以是凝膠(例如，水凝膠)。

如本文中所述，基質(zhì)可以是生物基質(zhì)。在這樣的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞可以是細(xì)菌或其他單細(xì)胞生物體、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞可以是單細(xì)胞生物體。單細(xì)胞生物體的非限制性實(shí)例包括原生生物、錐蟲(chóng)、變形蟲(chóng)、酵母細(xì)胞和藻類(lèi)。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞可以是動(dòng)物細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞(例如，來(lái)自果蠅的細(xì)胞)、魚(yú)細(xì)胞(例如，斑馬魚(yú)細(xì)胞)、兩棲動(dòng)物細(xì)胞(例如，蛙細(xì)胞)、爬行動(dòng)物細(xì)胞、鳥(niǎo)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，人細(xì)胞、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞、牛細(xì)胞、馬細(xì)胞、豬細(xì)胞、山羊細(xì)胞、狗細(xì)胞、貓細(xì)胞、來(lái)自嚙齒類(lèi)動(dòng)物(例如大鼠或小鼠)的細(xì)胞)。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞可以是人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞可以來(lái)自多細(xì)胞生物體。例如，細(xì)胞可以是神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、肝細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞(例如，T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞)或干細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，分子和結(jié)合伴侶可以通過(guò)化學(xué)和/或生物學(xué)相互作用締合。在一些實(shí)施方案中，分子和結(jié)合伴侶可以通過(guò)化學(xué)相互作用(例如化學(xué)鍵)締合?；瘜W(xué)鍵可以是共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵。在一些情況下，化學(xué)鍵是非共價(jià)鍵，例如氫鍵、離子鍵、配位鍵(dative bond)和/或范德華相互作用。在一些實(shí)施方案中，分子和結(jié)合伴侶可以包含能夠形成這樣的鍵的官能團(tuán)。例如，分子可以包含至少一個(gè)能夠與結(jié)合伴侶的氫鍵受體上的電子對(duì)相互作用以形成氫鍵的氫原子。在一些實(shí)施方案中，分子和/或結(jié)合伴侶可包含富電子或缺電子部分，使得其可與其他結(jié)合伴侶和/或分子形成靜電相互作用。應(yīng)理解的是，組分之間的共價(jià)和非共價(jià)鍵可通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何類(lèi)型的反應(yīng)，使用合適的官能團(tuán)經(jīng)過(guò)這樣的反應(yīng)形成。根據(jù)本文中的描述，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易選擇適于本文中所述的多個(gè)實(shí)施方案使用的化學(xué)相互作用。

在一些實(shí)施方案中，分子與結(jié)合伴侶之間的締合可通過(guò)生物學(xué)結(jié)合事件(即，在互補(bǔ)的生物分子對(duì)之間)進(jìn)行。例如，分子可包含實(shí)體(例如生物素)，其可以與結(jié)合伴侶上的互補(bǔ)實(shí)體(例如親和素或鏈霉親和素)特異性結(jié)合。可以在生物大分子對(duì)之間形成生物鍵的生物分子的其他實(shí)例包括但不限于蛋白質(zhì)、核酸、糖蛋白、碳水化合物、激素等。具體實(shí)例包括但不限于抗體/肽對(duì)、抗體/抗原對(duì)、抗體片段/抗原對(duì)、抗體/抗原片段對(duì)、抗體片段/抗原片段對(duì)、抗體/半抗原對(duì)、酶/底物對(duì)、酶/抑制劑對(duì)、酶/輔因子對(duì)、蛋白質(zhì)/底物對(duì)、核酸/核酸對(duì)、蛋白質(zhì)/核酸對(duì)、肽/肽對(duì)、蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)對(duì)、小分子/蛋白質(zhì)對(duì)、谷胱甘肽/GST對(duì)、抗-GFP/GFP融合蛋白對(duì)、Myc/Max對(duì)、麥芽糖/麥芽糖結(jié)合蛋白對(duì)、碳水化合物/蛋白質(zhì)對(duì)、碳水化合物衍生物/蛋白質(zhì)對(duì)、金屬結(jié)合標(biāo)簽/金屬/螯合物、肽標(biāo)簽/金屬離子-金屬螯合物對(duì)、肽/NTA對(duì)、凝集素/碳水化合物對(duì)、受體/激素對(duì)、受體/效應(yīng)物對(duì)、互補(bǔ)核酸/核酸對(duì)、配體/細(xì)胞表面受體對(duì)、病毒/配體對(duì)、A蛋白/抗體對(duì)、G蛋白/抗體對(duì)、L蛋白/抗體對(duì)、Fc受體/抗體對(duì)、生物素/親和素對(duì)、生物素/鏈霉親和素對(duì)、藥物/靶標(biāo)對(duì)、鋅指/核酸對(duì)、小分子/肽對(duì)、小分子/蛋白質(zhì)對(duì)、小分子/靶標(biāo)對(duì)、碳水化合物/蛋白質(zhì)對(duì)(例如麥芽糖/MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白))、小分子/靶標(biāo)對(duì)或金屬離子/螯合劑對(duì)。根據(jù)本文中對(duì)其功能的描述、這樣的生物學(xué)相互作用的實(shí)例以及本文中和本領(lǐng)域中對(duì)于鑒定合適化學(xué)相互作用的簡(jiǎn)單技術(shù)的知識(shí)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地選擇適合用于本文中所述實(shí)施方案的分子和結(jié)合伴侶之間的生物學(xué)相互作用。

在一些實(shí)施方案中，抑制、促進(jìn)或增強(qiáng)分子與結(jié)合伴侶之間的締合的條件可以是pH、離子濃度、化學(xué)物質(zhì)(例如，甲醛、表面活性劑)濃度或溫度中的一種。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將知曉抑制、促進(jìn)或增強(qiáng)分子與結(jié)合伴侶之間締合的條件。

如本文中所述，分子和/或基質(zhì)可以是帶電的。一般來(lái)說(shuō)，待被電場(chǎng)移動(dòng)的分子是帶電的或者是帶電分子的前體。在一些實(shí)施方案中，本文中所述的方法和制品可特別好地適用于帶電基質(zhì)存在下帶電分子的運(yùn)動(dòng)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“帶電分子”和“帶電基質(zhì)”具有其在本領(lǐng)域中的普通含義，可指包含一個(gè)或更多個(gè)帶電部分的分子或基質(zhì)。本文中使用的“帶電部分”是攜帶形式電荷(formal charge)的化學(xué)部分，例如一價(jià)(+1)、二價(jià)(+2)、三價(jià)(+3)等。帶電部分可以是陰離子(即，帶負(fù)電)或陽(yáng)離子(即，帶正電)。帶負(fù)電基團(tuán)或其前體的實(shí)例包括羧酸根基團(tuán)、磺酸根基團(tuán)、硫酸根基團(tuán)、膦酸根基團(tuán)、磷酸根基團(tuán)、羥基等。帶正電荷部分的實(shí)例包括胺基團(tuán)(例如，伯胺、仲胺和/或叔胺)、銨基團(tuán)、吡啶基團(tuán)、咪唑基團(tuán)。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，帶電部分包含磺酸根基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，帶電部分可包含-OH、-NH₃+、-COO-、-SH、-CHO、酮、疊氮化物和/或鹵化物。在一些實(shí)例中，帶電部分的電荷可以隨環(huán)境條件變化，例如pH的變化可改變所述部分的電荷，和/或造成所述部分變得帶電和/或不帶電。通常來(lái)說(shuō)，在使用分子和/或基質(zhì)的環(huán)境條件下確定部分的電荷。一般來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)需要選擇分子和/或基質(zhì)的電荷密度。

在一些情況下，分子和/或基質(zhì)可包含一個(gè)或更多個(gè)可以轉(zhuǎn)化成帶電部分的前體部分。例如，分子和/或基質(zhì)可以包含中性部分，所述中性部分可水解形成帶電部分，例如上述那些。作為非限制性特定實(shí)例，基質(zhì)可以包含丙烯酸叔丁酯和/或甲基丙烯酸叔丁酯，其可分別水解形成丙烯酸或甲基丙烯酸。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠確定給定的化學(xué)部分是否攜帶形式電荷(例如，通過(guò)檢查、pH滴定、離子電導(dǎo)性測(cè)量等)和/或給定的化學(xué)部分是否可以反應(yīng)(例如，水解)以形成攜帶形式電荷的化學(xué)部分。

應(yīng)理解術(shù)語(yǔ)“帶電”或“帶電部分”并不是指分子或基質(zhì)上的“局部負(fù)電荷”或“部分正電荷”。術(shù)語(yǔ)“部分負(fù)電荷”和“部分正電荷”以其在本領(lǐng)域中的普通含義給出?！安糠重?fù)電荷”在這樣的情況下形成：官能團(tuán)包含的鍵變得極化，使得電子密度拉向鍵的一個(gè)原子，在所述原子上產(chǎn)生部分負(fù)電荷。通常來(lái)說(shuō)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)識(shí)別可以以這種方式變得極化的鍵。

如本文中所述，電場(chǎng)可用于使分子移入基質(zhì)、在基質(zhì)中移動(dòng)或移出基質(zhì)的只是一部分。一般來(lái)說(shuō)，可根據(jù)給定應(yīng)用的需要選擇電場(chǎng)的大小。例如，在一些實(shí)施方案中，電場(chǎng)的大小可大于或等于約1V/m、大于或等于約2V/m、大于或等于約3V/m、大于或等于約5V/m、大于或等于約10V/m、大于或等于約20V/m、大于或等于約40V/m、大于或等于約50V/m、大于或等于約75V/m、大于或等于約100V/m、大于或等于約200V/m、大于或等于約500V/m、大于或等于約1,000V/m、大于或等于約2,500V/m、大于或等于約5,000V/m、大于或等于約10,000V/m、大于或等于約25,000V/m、大于或等于約50,000V/m或者大于或等于約75,000V/m。在一些情況下，電場(chǎng)的大小可小于或等于約100,000V/m、小于或等于約75,000V/m、小于或等于約50,000V/m、小于或等于約25,000V/m、小于或等于約10,000V/m、小于或等于約5,000V/m、小于或等于約2,500V/m、小于或等于約1,000V/m、小于或等于約500V/m、小于或等于約200V/m、小于或等于約100V/m、小于或等于約50V/m或者小于或等于約10V/m。上述范圍的組合也是可能的(例如，大于或等于約10V/m并且小于或等于約100,000V/m、大于或等于約20V/m并且小于或等于約100,000V/m)。其他值也是可能的。應(yīng)理解，動(dòng)電場(chǎng)的強(qiáng)度可指場(chǎng)的平均強(qiáng)度或動(dòng)態(tài)場(chǎng)中使用的任何強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，可達(dá)到更高的電場(chǎng)強(qiáng)度，而不會(huì)不利地影響使用電動(dòng)態(tài)場(chǎng)的基質(zhì)。

在一些實(shí)施方案中，動(dòng)態(tài)電場(chǎng)可用于使分子相對(duì)于基質(zhì)移動(dòng)。在某些實(shí)施方案中，電場(chǎng)的至少一種或更多種特性可作為時(shí)間的函數(shù)變化。在一些情況下，電場(chǎng)的一種或更多種特性變化的頻率可大于或等于約0.0001Hz、大于或等于約0.001Hz、大于或等于約0.01Hz、大于或等于約0.1Hz、大于或等于約1Hz、大于或等于約5Hz、大于或等于約10Hz、大于或等于約20Hz、大于或等于約50Hz、大于或等于約100Hz、大于或等于約250Hz、大于或等于約500Hz、大于或等于約750Hz、大于或等于約1,000Hz、大于或等于約5,000Hz、大于或等于約10,000Hz、大于或等于約50,000Hz、大于或等于約100,000Hz或者大于或等于約500,000Hz。在一些情況下，電場(chǎng)的一種或更多種特性變化的頻率可小于或等于約1,000,000Hz、小于或等于約500,000Hz、小于或等于約100,000Hz、小于或等于約50,000Hz、小于或等于約10,000Hz、小于或等于約5,000Hz、小于或等于約1,000Hz、小于或等于約750Hz、小于或等于約500Hz、小于或等于約250Hz、小于或等于約100Hz、小于或等于約50Hz、小于或等于約20Hz、小于或等于約10Hz、小于或等于約5Hz或者小于或等于約1Hz。上述范圍的組合也是可能的(例如，大于或等于約0.0001Hz并且小于或等于約10,000Hz、大于或等于約0.0001Hz并且小于或等于約100Hz)。其他值也是可能的。

在一些實(shí)施方案中，電場(chǎng)的兩種或更多種特性可作為時(shí)間的函數(shù)變化。在這樣的一些實(shí)施方案中，兩種或更多種特性可以以相同或不同頻率變化。在一些實(shí)施方案中，兩種或更多種特性可以以相同頻率變化。例如，電場(chǎng)的強(qiáng)度和方向可以以相同或不同頻率變化。在一些實(shí)施方案中，一種或更多種特性可具有在第一時(shí)間框架中的第一頻率和在第二時(shí)間框架中的第二頻率。例如，電場(chǎng)的方向可具有0.01Hz的頻率5分鐘，以及10Hz的頻率3分鐘。在一些實(shí)施方案中，具有某頻率的特性可以以規(guī)律間隔、無(wú)規(guī)律間隔和/或隨機(jī)間隔變化。例如，電場(chǎng)可具有1Hz的頻率，但是電場(chǎng)方向可變化，使得電場(chǎng)具有第一方向0.75秒和第二方向0.25秒。在另一些情況下，電場(chǎng)也可具有1Hz的頻率，但是電場(chǎng)的方向可變化，使得電場(chǎng)具有第一方向0.5秒和第二方向0.5秒。

一般來(lái)說(shuō)，可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生電場(chǎng)。在一些實(shí)施方案中，電場(chǎng)可以是一維、二維或三維電場(chǎng)。在一些實(shí)施方案中，多維動(dòng)電場(chǎng)可以在一個(gè)多更多個(gè)維度是動(dòng)態(tài)的。

一般來(lái)說(shuō)，室(例如，室、外室)可具有合適的形狀或尺寸。在一些實(shí)施方案中，可根據(jù)需要選擇室的尺寸。應(yīng)理解的是，室可具有任何合適的橫截面尺寸。例如，在一些實(shí)施方案中，室的最大橫截面尺寸可以大于或等于約0.01cm、大于或等于約0.05cm、大于或等于約0.1cm、大于或等于約1cm、大于或等于約2cm、大于或等于約5cm、大于或等于約10cm、大于或等于約20cm、大于或等于約30cm、大于或等于約40cm、大于或等于約50cm、大于或等于約60cm、大于或等于約70cm、大于或等于約80cm或者大于或等于約90cm。在一些情況下，室的最大橫截面尺寸可小于或等于約100cm、小于或等于約90cm、小于或等于約80cm、小于或等于約70cm、小于或等于約60cm、小于或等于約50cm、小于或等于約40cm、小于或等于約30cm、小于或等于約20cm、小于或等于約10cm或者小于或等于約5cm。上述范圍的組合也是可能的(例如，大于或等于約1cm并且小于或等于約100cm)。最大橫截面尺寸的其他值也是可能的。

在一些情況下，室的至少一個(gè)或至少兩個(gè)橫截面尺寸(例如，高和寬)可大于或等于約0.01cm、大于或等于約0.05cm、大于或等于約0.1cm、大于或等于約1cm、大于或等于約2cm、大于或等于約5cm、大于或等于約10cm、大于或等于約20cm、大于或等于約30cm、大于或等于約40cm、大于或等于約50cm、大于或等于約60cm、大于或等于約70cm、大于或等于約80cm或者大于或等于約90cm。在一些情況下，室的至少一個(gè)或至少兩個(gè)橫截面尺寸可小于或等于約100cm、小于或等于約90cm、小于或等于約80cm、小于或等于約70cm、小于或等于約60cm、小于或等于約50cm、小于或等于約40cm、小于或等于約30cm、小于或等于約20cm、小于或等于約10cm或者小于或等于約5cm。上述范圍的組合也是可能的(例如，大于或等于約1cm并且小于或等于約100cm)。其他值也是可能的。

室可具有一定的寬高比(width-to-height ratio)。在某些情況下，室的寬高比可大于或等于約1∶1、大于或等于約2∶1、大于或等于約5∶1、大于或等于約10∶1、大于或等于約15∶1或者大于或等于約20∶1。在一些情況下，室的寬高比可小于或等于約30∶1、小于或等于約20∶1、小于或等于約15∶1、小于或等于約10∶1、小于或等于約5∶1或者小于或等于約2∶1。上述范圍的組合也是可能的(例如，大于或等于約1∶1并且小于或等于約20∶1)。其他值也是可能的。

如本文中所述，室的至少一部分可由半透材料限定。在一些實(shí)施方案中，半透材料可形成室的一個(gè)或更多個(gè)壁的一部分。在某些實(shí)施方案中，室的一個(gè)或更多個(gè)壁或整個(gè)室由半透材料限定的百分比可大于或等于約1％、大于或等于約5％、大于或等于約10％、大于或等于約20％、大于或等于約30％、大于或等于約40％、大于或等于約50％、大于或等于約60％、大于或等于約70％、大于或等于約80％、大于或等于約90％、大于或等于約95％或者大于或等于約97％。在一些實(shí)施方案中，室的一個(gè)或更多個(gè)壁或整個(gè)室由半透材料限定的百分比可小于或等于約100％、小于或等于約95％、小于或等于約90％、小于或等于約80％、小于或等于約70％、小于或等于約60％、小于或等于約50％、小于或等于約40％、小于或等于約30％、小于或等于約20％或者小于或等于約10％。上述范圍的組合也是可能的(例如，大于或等于約5％并且小于或等于約90％、大于或等于約5％并且小于或等于約100％)。其他值也是可能的。

一般來(lái)說(shuō)，樣品定位器可具有任何合適的形狀或尺寸。在一些實(shí)施方案中，樣品定位器可占據(jù)室的很大一部分。例如，在一些實(shí)施方案中，室的橫截面積與樣品定位器的橫截面積之比可小于或等于約30∶1、小于或等于約20∶1、小于或等于約15∶1、小于或等于約10∶1、小于或等于約5∶1或者小于或等于約2∶1。在一些情況下室的橫截面積與樣品定位器的橫截面積之比可大于或等于約1∶1、大于或等于約1.5∶1、大于或等于約2∶1、大于或等于約5∶1、大于或等于約10∶1、大于或等于約15∶1或者大于或等于約20∶1。上述范圍的組合也是可能的(例如，大于或等于約1∶1并且小于或等于約20∶1)。其他值也是可能的。

在一些實(shí)施方案中，可根據(jù)需要選擇樣品定位器的尺寸。應(yīng)理解，樣品定位器可具有任何合適的橫截面尺寸。例如，在一些實(shí)施方案中，樣品定位器的最大橫截面尺寸可大于或等于約0.01cm、大于或等于約0.05cm、大于或等于約0.1cm、大于或等于約1cm、大于或等于約2cm、大于或等于約5cm、大于或等于約10cm、大于或等于約20cm、大于或等于約30cm、大于或等于約40cm、大于或等于約50cm、大于或等于約60cm、大于或等于約70cm、大于或等于約80cm或者大于或等于約90cm。在一些情況下，樣品定位器的最大橫截面尺寸可小于或等于約100cm、小于或等于約90cm、小于或等于約80cm、小于或等于約70cm、小于或等于約60cm、小于或等于約50cm、小于或等于約40cm、小于或等于約30cm、小于或等于約20cm、小于或等于約10cm或者小于或等于約5cm。上述范圍的組合也是可能的(例如，大于或等于約1cm并且小于或等于約100cm)。最大橫截面尺寸的其他值也是可能的。

在一些情況下，樣品定位器的至少一個(gè)或至少兩個(gè)橫截面尺寸(例如，高和寬)可大于或等于約0.01cm、大于或等于約0.05cm、大于或等于約0.1cm、大于或等于約1cm、大于或等于約2cm、大于或等于約5cm、大于或等于約10cm、大于或等于約20cm、大于或等于約30cm、大于或等于約40cm、大于或等于約50cm、大于或等于約60cm、大于或等于約70cm、大于或等于約80cm或者大于或等于約90cm。在一些情況下，樣品定位器的至少一個(gè)或至少兩個(gè)橫截面尺寸可小于或等于約100cm、小于或等于約90cm、小于或等于約80cm、小于或等于約70cm、小于或等于約60cm、小于或等于約50cm、小于或等于約40cm、小于或等于約30cm、小于或等于約20cm、小于或等于約10cm或者小于或等于約5cm。上述范圍的組合也是可能的(例如，大于或等于約1cm并且小于或等于約100cm)。其他值也是可能的。

樣品定位器可具有一定的寬高比(width-to-height ratio)。在某些情況下，室的寬高比可大于或等于約1∶1、大于或等于約2∶1、大于或等于約5∶1、大于或等于約10∶1、大于或等于約15∶1或者大于或等于約20∶1。在某些情況下，室的寬高比可小于或等于約30∶1、小于或等于約20∶1、小于或等于約15∶1、小于或等于約10∶1、小于或等于約5∶1或者小于或等于約2∶1。上述范圍的組合也是可能的(例如，大于或等于約1∶1并且小于或等于約20∶1)。其他值也是可能的。

術(shù)語(yǔ)抗體是指天然的或者完全或部分合成產(chǎn)生的免疫球蛋白或其一部分。保留特定結(jié)合能力的其全部衍生物也包括在該術(shù)語(yǔ)中。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源或很大程度上同源的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)可來(lái)自于天然來(lái)源，或者部分或完全合成產(chǎn)生?？贵w可以是單克隆的或多克隆的?？贵w可以是任何免疫球蛋白類(lèi)別的成員，包括任何人類(lèi)型：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。但是，IgG類(lèi)的衍生物在本發(fā)明中是優(yōu)選的。

生物大分子是多核苷酸(例如，RNA、DNA、RNA/DNA雜交體)蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)、天然產(chǎn)物或多糖。生物大分子可以是天然的或非天然的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，生物大分子的分子量大于500g/mol。

配體是指對(duì)于靶標(biāo)(例如，蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、肽、大分子、生物大分子、寡核苷酸、多核苷酸)具有結(jié)合親和力的任何化學(xué)化合物、多核苷酸、肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、小分子、天然產(chǎn)物、聚合物等。優(yōu)選地，靶標(biāo)是蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，配體對(duì)靶標(biāo)是特異性的。在一些實(shí)施方案中，配體對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合親和力為100mM至1pM、優(yōu)選1mM至1pM、更優(yōu)選1μM至1pM。配體可通過(guò)任何方式與其靶標(biāo)結(jié)合，所述方式包括疏水相互作用、氫鍵合、靜電相互作用、范德華相互作用、π堆疊、共價(jià)鍵合、磁性相互作用等。

多核苷酸或寡核苷酸是指核苷酸的聚合物。聚合物可包含天然核苷(即，腺苷、胸苷、鳥(niǎo)苷、胞苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥(niǎo)苷和脫氧胞苷)、核苷類(lèi)似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、7-脫氮腺苷、7-脫氮鳥(niǎo)苷、8-氧代腺苷、8-氧代鳥(niǎo)苷、O(6)-甲基鳥(niǎo)嘌呤和2-硫代胞苷)、化學(xué)修飾的堿基、生物學(xué)修飾的堿基(例如，甲基化堿基)、插入的堿基(intercalated base)、修飾的糖(例如，2′-氟核糖、核糖、2′-脫氧核糖、阿拉伯糖和己糖)或修飾的磷酸基團(tuán)(例如，硫代磷酸酯和5′-N-亞磷酰胺鍵聯(lián))。

蛋白質(zhì)包含通過(guò)肽(酰胺)鍵連接在一起的氨基酸殘基的聚合物。本文中使用的該術(shù)語(yǔ)是指任何尺寸、結(jié)構(gòu)或功能的蛋白質(zhì)、多肽和肽。通常來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)為至少3個(gè)氨基酸長(zhǎng)，優(yōu)選至少10個(gè)氨基酸長(zhǎng)，更優(yōu)選至少25個(gè)氫基酸長(zhǎng)，并且最優(yōu)選至少50個(gè)氫基酸長(zhǎng)。蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度還可大于100個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)可指單個(gè)蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的集合。蛋白質(zhì)可指全長(zhǎng)蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。本發(fā)明蛋白質(zhì)優(yōu)選僅包含天然氨基酸，但是可作為替代地使用本領(lǐng)域中已知的非天然氨基酸和/或氨基酸類(lèi)似物。另外，本發(fā)明蛋白質(zhì)中的一個(gè)或更多個(gè)氫基酸可被修飾，例如，通過(guò)添加化學(xué)實(shí)體，例如碳水化合物基團(tuán)、羥基基團(tuán)、磷酸基團(tuán)、法呢基基團(tuán)、異法呢基基團(tuán)、豆蔻?；鶊F(tuán)、脂肪酸基團(tuán)、用于綴合、功能化或其他修飾的接頭等。蛋白質(zhì)還可以是單分子或可以是包含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA、DNA、碳水化合物等的多分子復(fù)合物。蛋白質(zhì)可以是天然蛋白質(zhì)或肽的天然或非天然片段。蛋白質(zhì)可以是天然的、重組的或合成的，或者這些的任意組合。

本文中使用的術(shù)語(yǔ)小分子是指實(shí)驗(yàn)室中合成或天然發(fā)現(xiàn)的有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物，其分子量小于約2000g/摩爾，或小于約1000g/摩爾，甚至小于約500g/摩爾。本文中使用的小分子可指“天然產(chǎn)物樣”化合物，例如在結(jié)構(gòu)上與天然產(chǎn)物類(lèi)似，或者在立體中心的密度、功能團(tuán)的密度、環(huán)體系、3D結(jié)構(gòu)等方面類(lèi)似的小分子；但是，術(shù)語(yǔ)“小分子”不限于“天然產(chǎn)物樣”化合物，可包括并未基于或類(lèi)似于已知天然產(chǎn)物的化合物。小分子可包括例如核酸、肽、多肽、肽核酸、肽模擬物、碳水化合物、脂質(zhì)或其他有機(jī)(含碳)或無(wú)機(jī)部分。

以下實(shí)施例旨在舉例說(shuō)明本發(fā)明的某些實(shí)施方案，但沒(méi)有例示本發(fā)明的完全范圍。

實(shí)施例1

本實(shí)施例描述了使用電場(chǎng)將分子轉(zhuǎn)運(yùn)到基質(zhì)中。

對(duì)生物系統(tǒng)的全面理解受到缺少能夠在實(shí)際時(shí)間框架中對(duì)未切片的厚組織進(jìn)行光學(xué)和分子探詢(xún)的工具的阻礙。本實(shí)施例示出了一種基于電泳運(yùn)動(dòng)的新技術(shù)來(lái)解決該問(wèn)題。所述技術(shù)應(yīng)用于小鼠全腦組織，并且小鼠全腦組織可以在幾天(a couple of days)內(nèi)染色。

生物科學(xué)(尤其是神經(jīng)科學(xué))領(lǐng)域的一個(gè)重大挑戰(zhàn)是從復(fù)雜的生物系統(tǒng)中提取詳細(xì)的結(jié)構(gòu)和分子信息。生物系統(tǒng)(例如經(jīng)固定腦組織)的大部分研究強(qiáng)烈依賴(lài)于對(duì)目的結(jié)構(gòu)或分子進(jìn)行標(biāo)記然后顯微鏡檢查。標(biāo)記技術(shù)(例如免疫組織化學(xué)和原位雜交)是生物醫(yī)學(xué)的大部分實(shí)驗(yàn)室中的常規(guī)實(shí)踐，并且光學(xué)顯微術(shù)中的技術(shù)創(chuàng)新已經(jīng)能夠在亞細(xì)胞分辨率下觀察組織結(jié)構(gòu)的微小細(xì)節(jié)。但是，最常見(jiàn)的程序需要將厚組織切成μm或nm厚度的薄片以便光子和可視化分子探針二者能夠滲透整個(gè)厚度，這個(gè)過(guò)程耗時(shí)、易出錯(cuò)并且費(fèi)力或者昂貴(當(dāng)自動(dòng)化時(shí))。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了光學(xué)清理方法(optical clearing method)，其提高了光學(xué)顯微術(shù)的厚度，以在不切片的情況下對(duì)厚組織進(jìn)行成像，但是這些方法并沒(méi)有增強(qiáng)大分子滲透，因此并不與貫穿整個(gè)體積的分子表型分析兼容。作為克服這些問(wèn)題的第一步，開(kāi)發(fā)了賦予厚組織光學(xué)透明度和大分子可滲透性的技術(shù)。該技術(shù)能夠通過(guò)光學(xué)顯微術(shù)和分子表型分析技術(shù)(例如免疫組織化學(xué)和原位雜交)二者完全接近小鼠全腦和厚的死后人腦組織。但是，這些透明組織中的分子探詢(xún)(例如，染色)依然不實(shí)用地慢，因?yàn)樵诔赡晷∈笕X的情況下，探針?lè)肿?例如，抗體)被動(dòng)擴(kuò)散到整個(gè)組織厚度花費(fèi)數(shù)周至數(shù)月。

為了解決這些限制，電場(chǎng)用于使帶電分子移動(dòng)通過(guò)致密組織比擴(kuò)散快許多個(gè)數(shù)量級(jí)，并且速度與電場(chǎng)強(qiáng)度的二次方成比例。因此，電泳運(yùn)動(dòng)用于迅速和主動(dòng)地轉(zhuǎn)運(yùn)具有期望功能的帶電分子(例如，用于脂質(zhì)移除的去垢劑分子或用于免疫標(biāo)記的抗體分子)通過(guò)厚組織，允許快速的光學(xué)清理和分子表型分析。另外，通過(guò)策略性?xún)?yōu)化大流體回路(macrofluidic circuit)設(shè)置和調(diào)節(jié)溶液的組成、溫度和黏度，可以將電流流動(dòng)集中于組織并且加快所述過(guò)程。

在濃度梯度的存在下，降低濃度梯度的分子擴(kuò)散活動(dòng)(即，布朗運(yùn)動(dòng))導(dǎo)致順濃度梯度的凈質(zhì)量轉(zhuǎn)運(yùn)。這是當(dāng)不含特定抗體的組織放在含有所述抗體的浴中時(shí)抗體擴(kuò)散到組織中(雖然緩慢)的原因。這種被動(dòng)擴(kuò)散比電遷移慢數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)，在電遷移中帶電分子順電勢(shì)梯度移動(dòng)(圖8)。但是這種強(qiáng)力的定向運(yùn)動(dòng)對(duì)組織造成應(yīng)力，有時(shí)候使組織不可恢復(fù)地變形。但是，如果電場(chǎng)相對(duì)于組織旋轉(zhuǎn)，凈應(yīng)力可以最小化，同時(shí)提高了通過(guò)電泳擴(kuò)散進(jìn)入組織的質(zhì)量轉(zhuǎn)運(yùn)。理論預(yù)測(cè)電泳導(dǎo)致的有效擴(kuò)散是相對(duì)于速度大小的約二次方，因此改善了帶電分子的轉(zhuǎn)運(yùn)。在由50V和0.5rpm組成的該實(shí)驗(yàn)設(shè)置中，根據(jù)理論，抗體的擴(kuò)散率提高了四個(gè)數(shù)量級(jí)。

為了使小鼠全腦組織透明，在4℃下將丙烯酰胺單體、甲醛和聚合引發(fā)劑注入到腦中以使組織交聯(lián)并且使丙烯酰胺分子與組織連接。在37℃下的熱引發(fā)聚合反應(yīng)形成組織-丙烯酰胺聚合物雜交體結(jié)構(gòu)(hybrid cunstruct)。然后，在離子型去垢劑溶液中對(duì)組織-聚合物雜交體進(jìn)行電泳，以除去脂質(zhì)和其他未交聯(lián)的分子。為了加快清理過(guò)程(并且也為了隨后迅速的分子標(biāo)記)，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種新的電泳裝置，其包括大量外通道循環(huán)和少量?jī)?nèi)循環(huán)(圖8B-E)。這種裝置的重要特征是中央的含組織反應(yīng)室(內(nèi)循環(huán)的一部分)與周?chē)娊馐?外循環(huán)的一部分)通過(guò)納米多孔半透材料空間分離(圖8)。這使得能夠?qū)崿F(xiàn)反應(yīng)和電解室中溶液組成、溫度、導(dǎo)電率和反應(yīng)體積的獨(dú)立且通用的控制。

首先，隨著大體積的緩沖溶液在電解室和外通道循環(huán)，中央室的分離使得能夠使用大幅降低量的試劑，例如昂貴的去垢劑和抗體分子，同時(shí)保持高濃度。其次，這種設(shè)置阻止了試劑直接接觸電極，從而防止試劑分子被電化學(xué)反應(yīng)消耗并且產(chǎn)生可損害組織的有害副產(chǎn)物。第三，具有高鹽濃度的緩沖液可用于電解室，而低鹽含量緩沖液可用于反應(yīng)室，從而提高了反應(yīng)室的電阻以及反應(yīng)室末端之間的電壓降落。最后，可選擇性降低反應(yīng)室中的溶液的溫度(并因此降低黏度)以進(jìn)一步提高溶液的電阻。通過(guò)優(yōu)化鹽濃度和溫度，能夠在優(yōu)化后使反應(yīng)室末端之間的電壓降落提高約10倍(數(shù)據(jù)未示出)。冷卻很重要，因?yàn)榻M織中已經(jīng)表達(dá)的熒光團(tuán)可在高于37℃時(shí)淬滅。沒(méi)有溶液的循環(huán)，溫度可容易超過(guò)37℃。冷卻和循環(huán)使得能夠應(yīng)用高電壓。

將組織-聚合物雜交體放在連接于用于旋轉(zhuǎn)的步進(jìn)電機(jī)(step motor)的固定器(holder)上。旋轉(zhuǎn)使得帶電分子均勻分布于整個(gè)試樣中并防止清理程序期間的組織變形。另一個(gè)關(guān)鍵特征是大流體設(shè)置。進(jìn)入溶液有效洗走電解產(chǎn)物，防止了酸或堿在每個(gè)電極處濃縮。通過(guò)改變pH控制蛋白質(zhì)的電荷。在高pH下，大部分蛋白質(zhì)具有凈負(fù)電荷。

圖8舉例說(shuō)明了電泳隨機(jī)游走的原理和設(shè)備。圖8A-8C示出了布朗隨機(jī)游走(上)與電泳隨機(jī)線(xiàn)性轉(zhuǎn)運(yùn)(中)和電泳隨機(jī)游走(下)的比較。示出了計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果(A)、示意圖(B)和免疫染色結(jié)果(C)。圓1和2表示相同質(zhì)量的帶電顆粒，并且黑點(diǎn)表示具有較小質(zhì)量的顆粒。顆粒2具有比顆粒1更高的電荷。在布朗隨機(jī)游走中，顆粒進(jìn)行小的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致小的凈位移。因此，顆粒的組織滲透慢并且分子積累在表面。在電場(chǎng)中，具有較高電荷的顆粒比具有較小電荷的顆粒移動(dòng)得更快。帶電分子可迅速穿過(guò)組織，但是其分布跟隨電場(chǎng)梯度。這也對(duì)組織造成應(yīng)力，并且有時(shí)可使組織不可恢復(fù)地變形。在電場(chǎng)中旋轉(zhuǎn)組織模擬了布朗隨機(jī)游走，但是具有大的顆粒凈位移。通過(guò)電泳隨機(jī)游走可以實(shí)現(xiàn)顆粒的均勻部分。圖8C中所示結(jié)果通過(guò)Thy1-eGFP小鼠中eGFP的免疫染色獲得。注意到來(lái)自Alexa 555綴合的eGFP抗體的信號(hào)均勻分布到整個(gè)腦中。圖8D是裝置的圖像。電泳室由內(nèi)室和兩個(gè)外室組成。內(nèi)室具有蓋，所述蓋具有步進(jìn)電機(jī)及其控制器。圖8E是裝置的鳥(niǎo)瞰圖。內(nèi)室通過(guò)納米多孔膜與外室分離，并且組織能夠在內(nèi)部旋轉(zhuǎn)。外室在每一側(cè)包含用于電泳的鉑絲。圖8F是裝置的頂視圖。組織樣品與兩個(gè)電極中的電化學(xué)反應(yīng)分離。因?yàn)榧{米多孔膜對(duì)大分子不可滲透，具有期望特性的此類(lèi)大分子被限制在內(nèi)室的小體積中并且均勻分布。

圖9示出了具有動(dòng)態(tài)親和力變化(dynamic affinity shift)的電泳隨機(jī)游走，其使得能夠?qū)Υ蟮耐暾M織進(jìn)行迅速且均勻的免疫標(biāo)記。圖9A是免疫標(biāo)記裝置的示意圖。對(duì)于該實(shí)驗(yàn)，將13ml含有抗體的硼酸鋰緩沖液(50mM，pH 11)裝載到內(nèi)室中，并且大體積的冷卻的硼酸鋰緩沖液(50mM；pH 9；4℃)通過(guò)外室循環(huán)。向內(nèi)室施加50V。小緩沖液分子可自由通過(guò)納米多孔膜，但是抗體禁錮在內(nèi)室中。這種獨(dú)特的設(shè)計(jì)保護(hù)了重要的生物分子不被電氧化/還原降解。圖9B舉例說(shuō)明了電泳期間內(nèi)室中pH變化的時(shí)間過(guò)程。緩沖液離子通過(guò)納米多孔膜的自由運(yùn)動(dòng)經(jīng)過(guò)約4小時(shí)自然地將緩沖液的pH從11降低到9。n＝4。圖9C是不同pH的緩沖液中對(duì)eGFP染色的1mm厚Thy1-eGFP腦切片的代表性圖像。在pH 9發(fā)生更高的抗體-抗原結(jié)合。圖9D是整個(gè)組織中隨時(shí)間的抗體穿透和分布的示意圖?？贵w分子在高pH下高度帶電，因此，電泳隨機(jī)游走方案下抗體的組織滲透和均勻分布在高pH下最高效。隨著pH降低，分布的抗體開(kāi)始與其抗原結(jié)合。圖9E是對(duì)eGFP染色的全Thy1-eGFP小鼠腦的代表性圖像，(左)僅進(jìn)行電泳，(中)進(jìn)行電泳和旋轉(zhuǎn)，(右)電泳、旋轉(zhuǎn)和動(dòng)態(tài)親和力變化。

圖10舉例說(shuō)明了厚人腦樣品的迅速清理和免疫染色。圖10A是清理裝置的示意圖。帶電SDS膠束通過(guò)納米多孔膜限制在內(nèi)室中，并且主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)旋轉(zhuǎn)組織，以模擬隨機(jī)游走。SDS膠束不能穿過(guò)納米多孔膜，而SDS單體可以。圖10B是本技術(shù)(新清理)和現(xiàn)有技術(shù)(舊清理)pH隨時(shí)間變化的圖，其表明本發(fā)明技術(shù)并不造成pH降低。圖10C是不同時(shí)間點(diǎn)經(jīng)清理腦的代表性圖像。本發(fā)明技術(shù)比舊CLARITY更迅速地清理腦。圖10D表明利用本發(fā)明技術(shù)可以對(duì)厚人腦組織進(jìn)行均勻和完全的免疫染色。圖10E-G示出了腦組織的高放大率圖像。圖10H示出了使用本發(fā)明技術(shù)確定的給定大小的腦的樹(shù)枝狀橋(dendritic bridge)/神經(jīng)元的圖。

實(shí)施例2

本實(shí)施例描述了轉(zhuǎn)運(yùn)方法，其在本實(shí)施例中稱(chēng)為隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)(stochastic electrotransport)，所述方法使得能夠迅速且選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)帶電分子，而不破壞周?chē)鷰щ娀|(zhì)。最初，裝置設(shè)計(jì)為執(zhí)行去垢劑膠束的隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)，以能夠迅速且均勻地清理完整組織。利用該裝置，在短至3天中清理成年小鼠全腦組織。接著，設(shè)計(jì)了改進(jìn)的裝置以執(zhí)行分子探針的隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)，以能夠?qū)ν暾M織進(jìn)行迅速且均勻的染色。通過(guò)用合成核染色劑、碳水化合物結(jié)合蛋白和抗體對(duì)經(jīng)清理的水凝膠進(jìn)行成年小鼠全腦染色證明了這種方法的通用性。所述技術(shù)導(dǎo)致了在器官規(guī)模的哺乳動(dòng)物組織中多種生物分子的顯著均勻且迅速的標(biāo)記?？傊?，隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)一步促進(jìn)了大規(guī)模完整生物系統(tǒng)的迅速且多維探詢(xún)。

充分強(qiáng)的電場(chǎng)可加快離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，其速度線(xiàn)性地依賴(lài)于其電遷移率，而不帶電材料(例如，聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠)保持不動(dòng)。但是，如果基質(zhì)本身帶電，固定電梯度可使周?chē)|(zhì)不可逆地變形。帶電離子基質(zhì)是常見(jiàn)的并且包括全部生物組織，但是一個(gè)特別的實(shí)例是經(jīng)清理的水凝膠-組織雜交體。在某些水凝膠-組織雜交體中，將水凝膠網(wǎng)格的小構(gòu)建塊注入到組織中并隨后聚合以形成互相連接的納米多孔網(wǎng)。在這個(gè)過(guò)程中，內(nèi)源生物分子(例如，核酸、蛋白質(zhì)和小分子)通過(guò)與合成聚合物鏈交聯(lián)保持在其生理位置，而某些分子(例如，脂質(zhì))被從組織中移除以產(chǎn)生光學(xué)透明(“經(jīng)清理”)水凝膠-組織雜交體。但是，保持生理結(jié)構(gòu)所必需的高度交聯(lián)顯著降低了交聯(lián)分子的電遷移率，這些交聯(lián)分子在定向電場(chǎng)下緩慢遷移并且可損壞基質(zhì)。

為了解決該問(wèn)題，開(kāi)發(fā)了如本實(shí)施例中所述的隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)，其選擇性地加快自由移動(dòng)的帶電分子的轉(zhuǎn)運(yùn)，而不損壞周?chē)鷰щ娀|(zhì)。隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)依賴(lài)于這樣的理念：隨機(jī)電場(chǎng)可通過(guò)誘導(dǎo)電驅(qū)動(dòng)的“隨機(jī)游走”選擇性地增強(qiáng)具有大電遷移率的顆粒的轉(zhuǎn)運(yùn)。我們使用動(dòng)力學(xué)蒙特卡洛模型(Kinetic Monte Carlo model)的計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測(cè)，在通過(guò)動(dòng)態(tài)地改變電場(chǎng)引起的局部隨機(jī)電場(chǎng)和孔的無(wú)序分布的存在下，顆粒的均方位移(mean squared displacement)(R²)與其電遷移率和場(chǎng)強(qiáng)的乘積的二次方成比例(通過(guò)有效旋轉(zhuǎn)時(shí)標(biāo)P和實(shí)驗(yàn)時(shí)間t歸一化)。

這種獨(dú)特的二次方依賴(lài)性使得能夠選擇性地僅將高電遷移顆粒(例如，抗體)的轉(zhuǎn)運(yùn)提高至比被動(dòng)擴(kuò)散高數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)，而抑制具有低電遷移率的束縛分子(例如，內(nèi)源抗原)的運(yùn)動(dòng)。例如，在組織中分子探針的隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)中，誘導(dǎo)探針1mm位移的條件可僅使交聯(lián)的內(nèi)源生物分子移動(dòng)1nm(對(duì)比在靜態(tài)電泳中1μm)(假設(shè)前者的電遷移率比后者的電遷移率高3個(gè)數(shù)量級(jí))。因此，帶電基質(zhì)可保持幾乎不動(dòng)，而未結(jié)合的功能性分子迅速擴(kuò)散到整個(gè)基質(zhì)中。

首先，將這種新轉(zhuǎn)運(yùn)策略應(yīng)用于轉(zhuǎn)運(yùn)去垢劑十二烷基硫酸鈉(SDS)膠束，以加快從水凝膠包埋的完整組織中提取脂質(zhì)。利用某些靜態(tài)電泳技術(shù)，完全清理成年小鼠全腦耗費(fèi)數(shù)周。對(duì)組織施加更高電壓可加快該過(guò)程，但是這可以靜態(tài)電泳造成的組織變形為代價(jià)。另外，提高電壓造成組織過(guò)熱，促進(jìn)了電極對(duì)去垢劑的不期望的消耗，并且加快了可能不利地影響組織樣品(例如，循環(huán)溶液的pH迅速降低并且可使蛋白質(zhì)變性)的電解副產(chǎn)物的積累。

為了解決這些問(wèn)題并且有效地執(zhí)行SDS膠束的隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)，構(gòu)建了具有若干關(guān)鍵特征的新整合平臺(tái)。所述裝置在圖11A中示出。首先，樣品相對(duì)于靜電場(chǎng)連續(xù)旋轉(zhuǎn)以產(chǎn)生方向和強(qiáng)度二者隨時(shí)間動(dòng)態(tài)變化的電動(dòng)力(electric force)。這種動(dòng)電場(chǎng)與組織樣品中無(wú)序分布的孔組合導(dǎo)致電泳驅(qū)動(dòng)的帶電分子的隨機(jī)游走。其次，引入納米多孔膜以分離循環(huán)清理緩沖液(200mM SDS、10mM硼酸鋰，pH 9)和電泳緩沖液(10mM SDS，10mM硼酸鋰，pH 9)的“內(nèi)”通道和“外”通道。納米多孔膜僅允許小的化學(xué)物質(zhì)(包括載流離子(current-carrying ion)和SDS單體)自由移動(dòng)通過(guò)兩個(gè)通道，而將大的SDS膠束限制在內(nèi)部。這種獨(dú)特設(shè)計(jì)不僅保持了內(nèi)通道內(nèi)部的高SDS濃度，而且保護(hù)樣品免于破壞性化學(xué)反應(yīng)及其副產(chǎn)物(例如，多種酸和堿)。納米多孔膜有效地阻擋電解副產(chǎn)物進(jìn)入內(nèi)循環(huán)，因此保護(hù)了樣品。清理溶液選擇200mM的SDS濃度，因?yàn)镾DS膠束在200mM表現(xiàn)出最高的穩(wěn)定性和去垢力，考慮到SDS的臨界膠束濃度為～8.3mM，電泳緩沖液選擇10mM以使得10mM的SDS單體可在兩個(gè)通道之間平衡。最后，內(nèi)(清理)和外(電泳)溶液循環(huán)的分離使得能夠獨(dú)立控制其溫度和pH。

為了測(cè)試預(yù)期的隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)特性，將水凝膠包埋的成年小鼠腦組織放在裝置中并且施加具有組織旋轉(zhuǎn)的靜態(tài)電轉(zhuǎn)運(yùn)(“隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)”)或沒(méi)有組織旋轉(zhuǎn)的靜態(tài)電轉(zhuǎn)運(yùn)(“靜態(tài)電轉(zhuǎn)運(yùn)”)5小時(shí)。如所預(yù)期的，在經(jīng)受靜態(tài)電泳的樣品中觀察到顯著的變形，如圖11B中所示。利用SDS膠束的隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)，在3天中完全清理了小鼠腦而沒(méi)有顯著的組織變形，如圖11C中所示(注意到在折射率匹配溶液中孵育后組織的膨脹恢復(fù))。相同持續(xù)時(shí)間的組織的靜態(tài)電轉(zhuǎn)運(yùn)嚴(yán)重?fù)p壞了組織，而SDS膠束的被動(dòng)擴(kuò)散僅可部分地清理組織的表面?？傊@些結(jié)果證明，隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)使得能夠迅速清理完整組織而不造成變形。

接著，修改裝置以執(zhí)行分子探針向經(jīng)組織中的隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)。保持樣品旋轉(zhuǎn)，但是移除分離內(nèi)通道和外通道的納米多孔膜。相反，用納米多孔膜圍繞樣品室以保持室中的高探針濃度并且保護(hù)樣品和探針免于電解及其副產(chǎn)物。為了測(cè)試該整合系統(tǒng)，將大于小鼠腦的盤(pán)形丙烯酰胺凝膠(半徑9mm；高8mm)放在裝載有熒光素綴合的牛血清白蛋白(BSA-FITC)的室中并且施加隨機(jī)電場(chǎng)。如所預(yù)期的，在3小時(shí)內(nèi)觀察到了BSA-FITC向凝膠中顯著增強(qiáng)的擴(kuò)散樣轉(zhuǎn)運(yùn)以及BSA-FITC的均勻分布。接著，為了測(cè)試帶電基質(zhì)在隨機(jī)電場(chǎng)下是否保持完整，使經(jīng)清理小鼠全腦暴露于隨機(jī)電場(chǎng)，并且使另一個(gè)經(jīng)清理小鼠全腦暴露于靜態(tài)電場(chǎng)。在一小時(shí)中，暴露于固定電場(chǎng)的腦顯著損壞，而隨機(jī)電場(chǎng)下的腦保持不變。

使用這種隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)裝置，將數(shù)種不同類(lèi)型的分子探針遞送到經(jīng)清理水凝膠成年小鼠全腦中。選擇靶標(biāo)存在于整個(gè)全腦中的探針來(lái)徹底評(píng)價(jià)隨機(jī)電場(chǎng)可取得的均勻且完整染色的程度。選擇了SYTO 16，一種廣泛使用的有機(jī)核染料；熒光團(tuán)綴合的番茄(Lycopersicon Esculentum，tomato)凝集素，一種廣泛用作有效的血管標(biāo)志物的碳水化合物結(jié)合蛋白；和抗組蛋白H3蛋白，存在于所有細(xì)胞核中的針對(duì)組蛋白H3蛋白的抗體。同時(shí)將這些探針向小鼠腦中隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)1天實(shí)現(xiàn)了在整個(gè)腦中其靶標(biāo)的顯著均勻且完全的染色，如圖12A中所示。在探針溶液中搖動(dòng)著被動(dòng)孵育另一經(jīng)清理腦相同持續(xù)時(shí)間僅在表面染色，而核心幾乎沒(méi)有標(biāo)記，如圖12B中所示。在三種分子探針中，抗體具有最高分子量(～150kDa)，因此在被動(dòng)染色實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出最差的穿透(～300um)，而在隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)的情況下穿透完全貫穿成像的整個(gè)深度。這些數(shù)據(jù)證明隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)可用于使傳統(tǒng)組織化學(xué)技術(shù)擴(kuò)展至完整組織。

然后，確定了隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)染色組織的高分辨率成像是否允許對(duì)組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析。對(duì)另一個(gè)小鼠半球進(jìn)行番茄凝集素的隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)10小時(shí)。光片顯微術(shù)(light-sheet microscopy)用于迅速獲得高分辨率體積圖像。獲得的圖像顯示出了不同深度的毛細(xì)血管和較大血管的均勻染色。在30秒內(nèi)獲得了步長(zhǎng)2um的圖像的分離z堆疊(z-stack)。由于其高反差，獲得的圖像可容易矢量化并且分析多種參數(shù)(例如，直徑、總長(zhǎng)度和分支點(diǎn)的數(shù)目)。腦范圍血管的這種定量分析可揭示正?；蚧疾〗M織中血管網(wǎng)絡(luò)的重要結(jié)構(gòu)或病理學(xué)特征。因此，隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)可用于器官規(guī)模生物系統(tǒng)的快速和定量的表型分析。

圖11A示出了設(shè)計(jì)用于執(zhí)行用于組織清理的隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)的裝置的示意圖。清理溶液(200mM SDS，10mM LB，pH 9)的內(nèi)循環(huán)和電泳緩沖液(10mM SDS，10mM LB，pH 9)的外循環(huán)通過(guò)納米多孔膜(插圖)分離，其使SDS膠束保持在內(nèi)循環(huán)中，而電解反應(yīng)的副產(chǎn)物在外循環(huán)中。SDS單體和緩沖液離子可穿過(guò)納米多孔膜自由移動(dòng)。內(nèi)室和其他室二者中SDS單體濃度平衡為～10mM。在穿過(guò)導(dǎo)電緩沖液離子的納米多孔膜向內(nèi)室施加電壓，并且將組織室放在內(nèi)室中。組織室用電阻尼龍網(wǎng)包圍以允許SDS膠束和電流自由穿透，并且相對(duì)于電場(chǎng)旋轉(zhuǎn)以產(chǎn)生動(dòng)態(tài)變化的電場(chǎng)。使冷卻的(10-20℃)緩沖溶液循環(huán)以提供用于電泳的離子以及移除電泳期間產(chǎn)生的熱。在沒(méi)有納米多孔膜的情況下，內(nèi)部清理溶液的pH在1天迅速降低至～4.5。隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)在3天中迅速且均勻地清理水凝膠包埋的成年小鼠全腦組織而不損壞組織。注意到在折射率匹配的溶液中孵育后組織的膨脹恢復(fù)。利用相同功率(90W)，靜態(tài)電場(chǎng)在短至5小時(shí)內(nèi)使組織顯著變形，如圖11B中所示，并且在3天中使組織完全降解，如圖11C中所示。圖11B示出了冠狀面(coronal section)。箭頭指向組織的變形部分。在37℃下?lián)u動(dòng)相同持續(xù)時(shí)間的SDS被動(dòng)擴(kuò)散僅部分地清理了表面。所有網(wǎng)格為3mm×3mm。

圖12A示出了經(jīng)清理的水凝膠成年小鼠腦，其經(jīng)歷了SYTO 16(青藍(lán)色核染色劑)、Dylight 594綴合的番茄凝集素(標(biāo)記血管的碳水化合物結(jié)合蛋白)和Alexa 647綴合的抗組蛋白H3抗體(標(biāo)記所有細(xì)胞核)的隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)。水平截面顯示出了所使用的所有三種探針的全腦均勻且完全的染色。比例尺條為1mm。圖12B示出了被動(dòng)染色對(duì)照，其在37℃下通過(guò)輕輕搖動(dòng)孵育相同的持續(xù)時(shí)間。比例尺條為1mm。

實(shí)施例3

在本實(shí)施例中，描述了一種在本實(shí)施例中稱(chēng)為eTANGO(納米多孔凝膠器官雜交體中活性調(diào)節(jié)的分子的電隨機(jī)轉(zhuǎn)運(yùn))的新技術(shù)，其允許在小時(shí)時(shí)間尺度上對(duì)大規(guī)模完整生物系統(tǒng)進(jìn)行幾乎完全且均勻的原位分子標(biāo)記。這通過(guò)整合兩個(gè)新理念實(shí)現(xiàn)：隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)和動(dòng)態(tài)活性變化。隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)選擇性地且迅速(比被動(dòng)擴(kuò)散快數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí))地分散僅自由移動(dòng)的帶電分子(例如，抗體)，而不破壞周?chē)鷰щ娀|(zhì)(例如，腦)。通過(guò)動(dòng)態(tài)活性變化緊密控制探針-靶標(biāo)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，以使整個(gè)系統(tǒng)中的反應(yīng)時(shí)間同步。通過(guò)使用三種不同類(lèi)型的分子探針實(shí)現(xiàn)整個(gè)小鼠中的細(xì)胞核、血管和多種神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型的3D可視化，證明了該整合方法的通用性。還通過(guò)對(duì)遺傳表達(dá)的熒光蛋白進(jìn)行染色確認(rèn)了技術(shù)的特異性。所述技術(shù)允許在器官規(guī)模哺乳動(dòng)物組織中顯著均勻且迅速地標(biāo)記多種生物分子。

為了實(shí)現(xiàn)隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)的潛力，開(kāi)發(fā)了具有若干關(guān)鍵特征的新整合平臺(tái)。首先，樣品相對(duì)于靜電場(chǎng)持續(xù)旋轉(zhuǎn)以產(chǎn)生方向和強(qiáng)度二者隨時(shí)間動(dòng)態(tài)變化的電動(dòng)力。其次，用納米多孔膜包圍樣品室，僅允許小化學(xué)物質(zhì)(例如，載流離子、活性調(diào)節(jié)分子)自由移動(dòng)通過(guò)室，而將大探針?lè)肿酉拗圃趦?nèi)部。這種設(shè)計(jì)不僅保持了室中的高探針濃度，而且保護(hù)樣品和探針免于破壞性化學(xué)反應(yīng)及其副產(chǎn)物(例如，多種酸和堿)。最后，溫度控制的緩沖溶液繞著圓柱形室流動(dòng)以精細(xì)控制組織內(nèi)的反應(yīng)環(huán)境(例如，溫度和pH)。裝置與脫裝置組件(off-device component)整合以使隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程自動(dòng)化。

盡管隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)大幅縮短了分子穿透所需時(shí)間，但是由于探針遷移時(shí)間尺度(小時(shí))和反應(yīng)時(shí)間尺度(亞秒至分鐘)的差異，某些經(jīng)清理水凝膠組織中內(nèi)部的分子靶標(biāo)依然經(jīng)歷不同的反應(yīng)條件。如果單獨(dú)應(yīng)用被動(dòng)擴(kuò)散或隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)標(biāo)記大規(guī)模完整組織，在一些情況下，快的探針-靶標(biāo)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)可造成外部組織的飽和標(biāo)記，留下內(nèi)部結(jié)構(gòu)未檢查。為了克服該問(wèn)題，利用以下事實(shí)動(dòng)態(tài)地調(diào)節(jié)標(biāo)記過(guò)程中探針的結(jié)合活性：分子之間的非共價(jià)結(jié)合反應(yīng)由其弱的相互作用(例如，靜電、疏水、氫鍵合)控制，并且這樣的力的強(qiáng)度取決于周?chē)瘜W(xué)環(huán)境。設(shè)計(jì)了一種可動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的環(huán)境，其在探針轉(zhuǎn)運(yùn)步驟中抑制結(jié)合，并且隨后一旦探針均勻分散在整個(gè)組織中就全面“開(kāi)啟(swiched-on)”反應(yīng)。這種方法允許整個(gè)組織中的內(nèi)源分子靶標(biāo)經(jīng)歷類(lèi)似反應(yīng)條件(時(shí)間和化學(xué)濃度)。

為了實(shí)現(xiàn)這些，開(kāi)發(fā)了抑制或顯著減緩從小有機(jī)分子、碳水化合物結(jié)合蛋白到抗體的大范圍探針的結(jié)合反應(yīng)的通用緩沖體系。表1中示出了所使用的探針。首先，研究了通過(guò)簡(jiǎn)單地將pH從中性變成堿性來(lái)抑制結(jié)合反應(yīng)的能力。推斷可使用pH變化，因?yàn)閺闹行宰兂蓧A性pH可改變?cè)S多分子的電荷。通過(guò)變成堿性pH改變分子的電荷可破壞或改變?cè)谥行詐H下存在的分子的靜電相互作用。單獨(dú)使用pH，抑制了抗體亞組(包括α-GFP)中的反應(yīng)，但是所測(cè)試的大部分探針在pH 11硼酸鋰(lithiumborate，LB)緩沖液中表現(xiàn)出強(qiáng)反應(yīng)性。接著，確定添加低濃度離子型去垢劑是否可進(jìn)一步降低探針的反應(yīng)性。眾所周知，去垢劑化學(xué)物質(zhì)可破壞分子的相互作用。發(fā)現(xiàn)10mM十二烷基硫酸鈉(SDS)可有效抑制或顯著減緩所測(cè)試的所有探針在寬范圍的pH和緩沖體系中的結(jié)合反應(yīng)。使用這樣的小離子型分子(緩沖液離子或SDS)作為活性調(diào)節(jié)劑是有利的。可通過(guò)將化學(xué)物質(zhì)電泳轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)納米多孔膜迅速改變樣品室中小離子型分子的濃度。另外，pH 11與中性pH相比賦予了常用分子探針(例如，抗體)更高的負(fù)電荷，從而提高了電遷移率。因此，這種緩沖體系可容易地用于本文中所述隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，以在完整組織的分子標(biāo)記過(guò)程中動(dòng)態(tài)地調(diào)節(jié)探針的結(jié)合活性。這種“動(dòng)態(tài)活性變化”與隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)的整合在本實(shí)施例中稱(chēng)為eTANGO。

表1.本實(shí)施例中使用的探針

為了測(cè)試整合eTANGO方法的預(yù)期特性，利用廣泛使用的有機(jī)核染料PO-PRO-1對(duì)成年小鼠腦的整個(gè)半球進(jìn)行核染色。PO-PRO-1在pH 7.5tris-硼酸鹽(TB)緩沖液中表現(xiàn)出強(qiáng)烈標(biāo)記，而其在具有SDS的pH 11 LB中幾乎沒(méi)有信號(hào)。另外，不論pH，PO-PRO-1具有兩個(gè)正電荷，使得其適合于隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)和動(dòng)態(tài)活性變化二者。為了測(cè)試是否可使用eTANGO在小鼠腦的完整半球中實(shí)現(xiàn)迅速且均勻的核染色，將組織與PO-PRO-1和非結(jié)合緩沖液(含SDS的pH 11 LB緩沖液)一起裝載到樣品室中，所述非結(jié)合緩沖液有利于探針轉(zhuǎn)運(yùn)但是不允許探針-靶標(biāo)結(jié)合反應(yīng)發(fā)生。沒(méi)有探針的相同樣品緩沖液通過(guò)裝置循環(huán)，施加隨機(jī)電場(chǎng)以驅(qū)動(dòng)滅活探針進(jìn)入組織。隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)5小時(shí)后，將樣品移到促進(jìn)探針-樣品結(jié)合反應(yīng)的“結(jié)合緩沖液”(pH 7.5 TB緩沖液)中并且被動(dòng)孵育過(guò)夜。這種方法導(dǎo)致僅15小時(shí)內(nèi)整個(gè)半球顯著均勻且完全的核染色。為了評(píng)估通過(guò)eTANGO系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的標(biāo)記的均勻性，對(duì)半球的中部橫截面成像并且使用簡(jiǎn)單算法基于絕對(duì)強(qiáng)度閾值鑒定核，并且測(cè)量所有所鑒定核的染色強(qiáng)度。均勻標(biāo)記允許精確進(jìn)行這樣的簡(jiǎn)單算法；如果標(biāo)記不均勻，可需要復(fù)雜算法以將整個(gè)深度的不同信噪譜歸一化。另外，染色核的平均強(qiáng)度在整個(gè)組織中是均勻的，這支持了組織中的探針靶標(biāo)經(jīng)歷幾乎相同的反應(yīng)條件的聲明。相同持續(xù)時(shí)間的利用被動(dòng)擴(kuò)散或僅利用隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)(無(wú)動(dòng)態(tài)活性變化)的額外對(duì)照實(shí)驗(yàn)造成了在表面的飽和信號(hào)，而核心幾乎沒(méi)有標(biāo)記，僅隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)的條件產(chǎn)生了比被動(dòng)擴(kuò)散相應(yīng)實(shí)驗(yàn)稍微好的穿透。由于擴(kuò)散固有的緩慢性質(zhì)，僅利用動(dòng)態(tài)活性變化的其他對(duì)照實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致PO-PRO-1更好但是依然不足的穿透和弱的信號(hào)。這些結(jié)果證明，隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)和動(dòng)態(tài)活性變化的組合eTANGO允許迅速、均勻和系統(tǒng)范圍的核對(duì)比染色，其在用于解剖注釋的組織學(xué)中很重要，并且特別可用于操作和分析3D體積數(shù)據(jù)集。

接著，證明了eTANGO是否可用于利用基于蛋白質(zhì)之探針的分子表型分析。首先測(cè)試被廣泛用作有效血管標(biāo)志物的凝集素，一種碳水化合物-結(jié)合蛋白。熒光團(tuán)綴合的番茄(西紅柿)凝集素在中性pH下表現(xiàn)出強(qiáng)的與其靶標(biāo)的結(jié)合，并且在所測(cè)試的緩沖液中具有高背景，而在10mMSDS存在下的中性和堿性pH二者下結(jié)合較弱但是更特異性。使用具有SD的pH 11 LB緩沖液作為慢結(jié)合緩沖液，因?yàn)榈入婞c(diǎn)(pI)為9.0的凝集素在堿性pH下帶更高電荷，允許更快電泳轉(zhuǎn)運(yùn)。為了使非特異性結(jié)合最小化，省略了強(qiáng)結(jié)合步驟。使用這種簡(jiǎn)單的一步法，在10小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)了整個(gè)小鼠半球的全部血管的均勻且完全的染色。然后使用定制的折射率匹配的浸漬介質(zhì)對(duì)樣品進(jìn)行光學(xué)清理。光片顯微術(shù)(light-sheetmicroscopy)用于迅速獲得高分辨率體積圖像。所獲得的圖像顯示不同深度的毛細(xì)血管和更大血管的均勻染色。在30秒內(nèi)獲得步長(zhǎng)2um的圖像的分離z堆疊。由于其高反差，獲得的圖像可容易矢量化并且分析多種參數(shù)(例如，直徑、總長(zhǎng)度和分支點(diǎn)的數(shù)目)。腦范圍血管的這種定量分析可揭示正?；蚧疾〗M織中血管網(wǎng)的重要結(jié)構(gòu)或病理學(xué)特征。這將eTANGO的功用進(jìn)一步延伸到了器官規(guī)模生物系統(tǒng)的迅速且定量的表型分析。

最后，確定eTANGO是否與免疫組織化學(xué)方法相兼容。免疫組織化學(xué)是使用抗體-抗原結(jié)合反應(yīng)的最常用的分子表型分析技術(shù)之一。但是，由于抗體的大尺寸(15nm)及其慢移動(dòng)性，厚的完整組織的抗體標(biāo)記依然是主要挑戰(zhàn)。為了研究eTANGO是否允許大規(guī)模完整組織的迅速、完整且均勻的免疫標(biāo)記，進(jìn)行eTANGO以使用染料綴合的α-組蛋白H3(H3)抗體標(biāo)記整個(gè)小鼠半球中的全部細(xì)胞核。首先，確定單獨(dú)使用隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)是否可實(shí)現(xiàn)均勻染色。如所預(yù)期的且與我們先前利用PO-PRO-1進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)相一致，雖然通過(guò)隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)了抗體的轉(zhuǎn)運(yùn)，但是小鼠全腦僅～200μm厚的外層被標(biāo)記并且具有高背景水平，而腦核心表現(xiàn)為幾乎不存在信號(hào)。接著，應(yīng)用eTANGO方法。為了使活性抑制的組蛋白抗體均勻分散在組織內(nèi)部，將腦與含有染料綴合的α-組蛋白抗體的具有SDS的pH 11 LB緩沖液(非標(biāo)記緩沖液)一起裝載到室中，然后在相同非結(jié)合緩沖液循環(huán)的同時(shí)施加電場(chǎng)6小時(shí)。在該6小時(shí)長(zhǎng)的非結(jié)合步驟之后，將循環(huán)緩沖液更換成結(jié)合緩沖液(pH 9 LB)以全面誘導(dǎo)抗體抗原結(jié)合反應(yīng)。使用pH 9結(jié)合緩沖液而不是中性pH以確保抗體在結(jié)合步驟期間依然保持一些電遷移率。不同于單獨(dú)隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)照，這種整合的eTANGO方法導(dǎo)致完全且均勻的標(biāo)記?？傊?，這些結(jié)果證明，隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)和動(dòng)態(tài)活性變化的整合eTANGO允許迅速且均勻地在數(shù)小時(shí)時(shí)間框架中對(duì)小鼠全腦進(jìn)行迅速且均勻的免疫染色。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證eTANGO使用免疫組織化學(xué)方法的能力，在完整經(jīng)清理水凝膠Thy1-eGFP成年小鼠腦上進(jìn)行α-GFP染色。經(jīng)eTANGO處理的腦表現(xiàn)出在整個(gè)全腦中所有表達(dá)eGFP的神經(jīng)元顯著均勻且完全的α-GFP標(biāo)記。為了比較，對(duì)另一個(gè)腦被動(dòng)免疫染色相同持續(xù)時(shí)間并且觀察到僅限于表面的標(biāo)記。含有不同量eGFP(+)神經(jīng)元的經(jīng)eTANGO染色的海馬、皮質(zhì)和丘腦的詳細(xì)檢查表明，eTANGO能夠?qū)哂胁痪鶆蚍植嫉目乖臉悠肪鶆虻孛庖呷旧?。在遺傳性eGFP表達(dá)弱的丘腦中觀察到了顯著放大的信號(hào)強(qiáng)度，這可用于使弱表達(dá)的蛋白質(zhì)可視化。還觀察到在eTANGO后可以可靠地檢測(cè)不同深度的不同腦結(jié)構(gòu)?？傊?，結(jié)果證明隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)和動(dòng)態(tài)活性變化的整合允許在數(shù)小時(shí)時(shí)間框架中對(duì)小鼠全腦進(jìn)行迅速且均勻的免疫染色。

最廣泛使用的免疫組織化學(xué)方法是通過(guò)首先使用靶標(biāo)特異性的一抗染色然后添加與所述一抗結(jié)合的宿主物種特異性二抗的間接免疫染色，因?yàn)槠湓试S信號(hào)放大和避免使熒光團(tuán)與所有抗原特異性抗體綴合的需要。因此，eTANGO用于使用兩個(gè)連續(xù)的非結(jié)合和結(jié)合循環(huán)對(duì)多種細(xì)胞標(biāo)志物間接免疫染色，如圖13A中所示。在使用無(wú)熒光團(tuán)綴合的α-H3抗體的利用H3作為核復(fù)染劑綴合中，用酪氨酸羥化酶(TH)(對(duì)于兒茶酚的生物合成很重要的一種酶，其常用于中腦區(qū)域中多巴胺能神經(jīng)元的可視化)對(duì)小鼠全腦進(jìn)行eTANGO標(biāo)記。如所預(yù)期的，α-H3抗體標(biāo)記了所有核，而強(qiáng)的α-TH抗體信號(hào)限于公知的中腦多巴胺中心，例如腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area，VTA)和黑質(zhì)(substantia nigra，SN)，如圖13B中所示。再一次，簡(jiǎn)單的強(qiáng)度閾值處理算法(intensity thresholdingalgorithm)精確鑒定了H3-免疫反應(yīng)性細(xì)胞和TH-免疫反應(yīng)性細(xì)胞，并且對(duì)中間VTA中的細(xì)胞總數(shù)和表達(dá)TH的神經(jīng)元的計(jì)數(shù)，其可能歸因于大體積中的均勻標(biāo)記。

另外，對(duì)經(jīng)清理水凝膠腦組織的小清蛋白(parvalbumin，PV)染色，這是一種廣泛用作GABA能非錐體中間神經(jīng)元亞群的標(biāo)志物的鈣結(jié)合蛋白。皮質(zhì)層中PV(+)神經(jīng)元的分布與先前的描述相匹配。出人意料地，發(fā)現(xiàn)Thy1-eGFP小鼠的腹后皮質(zhì)區(qū)域中的許多PV(+)神經(jīng)元也是eGFP(+)，其在包括錐體神經(jīng)元的神經(jīng)元亞組中表達(dá)eGFP，表明一些錐體投射神經(jīng)元也表達(dá)PV。還確認(rèn)了這些神經(jīng)元向下發(fā)出軸突纖維到外囊并且表現(xiàn)出典型錐體細(xì)胞的特性，例如錐體體細(xì)胞(pyramidal soma)、大尖端樹(shù)突(large apical dendrite)、單軸突、多基部樹(shù)突(multiple basal dendrite)和密集樹(shù)突刺(dense dendritic spine)。盡管先前在小鼠或小鼠以外物種的壓后(retrosplenial)皮質(zhì)和軀體感覺(jué)皮質(zhì)中描述了表達(dá)PV的投射神經(jīng)元，但是這種PV(+)錐體神經(jīng)元在其他皮質(zhì)區(qū)域中的發(fā)現(xiàn)表明這種神經(jīng)元亞型可代表可存在于不同皮質(zhì)區(qū)域的不同類(lèi)型的錐體神經(jīng)元。這示出了eTANGO如何允許以無(wú)偏(non-biased)的方式整合多維信息(形態(tài)、連接和分子信息)的實(shí)例，其可允許鑒定被同時(shí)檢查小的腦區(qū)域的常規(guī)方法低估的神經(jīng)基底(neural substrate)。

圖13A-B示出了：(13A)用于間接免疫組織化學(xué)的eTANGO實(shí)驗(yàn)方案和(13B)在利用eTANGO對(duì)TH和H3進(jìn)行全腦免疫染色后3月齡Thy1-eGFP M系小鼠腦的腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)的3D渲染(SN是黑質(zhì)，cp是大腦腳(大腦腳))，比例尺條等于300μm。

實(shí)施例4

本實(shí)施例描述了實(shí)施例2和3中所使用的方法。

實(shí)驗(yàn)對(duì)象：將實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)6-8周齡的雄性C57BL/6小鼠飼養(yǎng)在顛倒的12小時(shí)光/暗周期中。隨意取用水和食物。

切片的經(jīng)清理水凝膠組織夠組織化學(xué)：為了對(duì)1mm厚腦組織切片進(jìn)行染色，在水凝膠組織包埋步驟之后使用小鼠腦基質(zhì)(RBM-2000C；ASIInstruments，Warren，MI)對(duì)組織進(jìn)行切片。利用振動(dòng)切片機(jī)(VT1200S；Leica，Buffalo Grove，IL)獲得100μm厚切片。通過(guò)輕輕搖動(dòng)著在37℃的50mL清理溶液中孵育對(duì)組織塊進(jìn)行被動(dòng)清理。然后將經(jīng)清理組織塊放到24孔板中并且用染色緩沖溶液洗滌(在每幅圖中指出)三次，每次兩小時(shí)。然后在成像前將組織塊孵育在相同的染色緩沖溶液中并且洗滌三次。對(duì)于間接免疫染色，在一抗之后對(duì)于二抗重復(fù)先前的步驟。所有洗滌和染色步驟在室溫下輕輕搖動(dòng)進(jìn)行。然后將經(jīng)染色切片光學(xué)清理并成像或直接成像。

eTANGO溶液制備：制備所選的非結(jié)合和結(jié)合緩沖液。使用以下緩沖液：(1)pH 11 LB緩沖液+SDS，其含有50mM氫氧化鋰、10mM SDS、1％Triton-X 100和0.02％疊氮化鈉并且用硼酸滴定至pH 11；(2)pH 11 LB緩沖液，其含有50mM氫氧化鋰、1％Triton-X 100和0.02％疊氮化鈉并且用硼酸滴定至pH 11；(3)pH 9 LB緩沖液，其含有50mM氫氧化鋰、1％Triton-X 100和0.02％疊氮化鈉并且用硼酸滴定至pH 9；(4)pH 7.5 TB緩沖液，其含有50mM Trizma堿(Sigma T6066)和0.02％疊氮化鈉并且用硼酸滴定至pH 7.5。

eTANGO系統(tǒng)構(gòu)建：定制eTANGO裝置、樣品室和相關(guān)附件(室蓋、電機(jī)和電機(jī)控制器)并且裝配。如下構(gòu)建裝置：(1)通過(guò)將2米的1/4″剛性、薄壁管(McMaster-Carr)浸漬在設(shè)置為1℃的冷卻浴循環(huán)器(WiseCircu WCR-P8，1.6kW；Wisd Laboratory Instruments；Germany)中來(lái)制作熱交換器；(2)使用電阻環(huán)氧樹(shù)脂膠(Hysol ES1901；Henkel)將納米多孔膜安裝在樣品室上。膜的孔徑(截留分子量，即MWCO)小于期望探針的分子量。使用來(lái)自Spectrum Laboratories(Compton，CA)的以下膜：1kDa MWCO用于抗體；MWCO 6-8kDa用于抗體和凝集素；MWCO 100-500Da用于PO-PRO-1。(3)按如下順序(流動(dòng)方向)連接系統(tǒng)：泵(40PX，PanWorld，Japan)、熱交換器、TANGO室和容器。熱交換器直接設(shè)置在eTANGO室之前用于高效冷卻。所有組件與合適尺寸的管(1/8”、3/8”)連接。(4)eTANGO裝置放在在磁攪拌板(HI 190M，Hanna Instruments，RI)上并且添加小攪拌棒(30620-416；VWR)。在一些情況下，尼龍網(wǎng)(CMN-0074-D，Small Parts)用于構(gòu)建圍繞組織固定器的壁以將組織固定在適當(dāng)位置。所測(cè)量的外溶液的溫度為10-13℃。

eTANGO過(guò)程：使用以下步驟進(jìn)行eTANGO過(guò)程。(1)室溫下在非結(jié)合緩沖液中輕輕搖動(dòng)著洗滌經(jīng)清理凝膠組織2-3次一天，以利用非結(jié)合緩沖液平衡組織?；蛘撸梢杂胑TANGO裝置電泳洗滌組織以縮短洗滌時(shí)間。(2)向容器中填充非結(jié)合緩沖溶液、封閉裝置并且開(kāi)始循環(huán)。等到溶液冷卻至10-13℃。(3)將組織放在室中并且向室裝載具有3％牛血清白蛋白的非結(jié)合緩沖液。正好的緩沖溶液(3-5ml緩沖溶液)用于將組織浸漬在溶液中。(4)施加電場(chǎng)10分鐘以使BSA分散在室中。(5)向組織室添加分子探針。(6)將組織室插入eTANGO裝置并且向室施加50V 6小時(shí)。在該步驟中，探針?lè)肿娱_(kāi)始均勻分布到整個(gè)經(jīng)多孔CLARITY處理的組織中。運(yùn)行時(shí)間可根據(jù)上述參數(shù)以及樣品的尺寸、形狀和密度以及探針?lè)肿拥臐舛取щ姞顟B(tài)/電遷移率變化。(6)在非結(jié)合條件下的探針?lè)植疾襟E之后，將緩沖溶液切換成結(jié)合緩沖液并且繼續(xù)施加電壓額外6小時(shí)或過(guò)夜。使室中的緩沖液組合物與室外的結(jié)合緩沖液平衡。在該步驟期間，分散的探針?lè)肿訉⑴c靶標(biāo)結(jié)合。這種非結(jié)合/結(jié)合循環(huán)可重復(fù)數(shù)次以提高染色的均勻性。(7)對(duì)于洗滌，再次將緩沖液切換成非結(jié)合緩沖液，將室中的溶液替換成沒(méi)有抗體的新鮮非結(jié)合緩沖液，并且施加電場(chǎng)。每小時(shí)更換溶液以增強(qiáng)未結(jié)合抗體的洗滌。(8)對(duì)于間接免疫染色(或相關(guān)多步驟染色程序)，用二抗從步驟(3)開(kāi)始重復(fù)。(9)在免疫染色之后，室溫下將組織樣品在～50ml的10mM LB，200mM SDS(pH 8-9)中于搖床上孵育過(guò)夜。

利用PROTOS光學(xué)清理：通過(guò)每100mL超純水溶解75g泛影酸(D9268l Sigma-Aldrich)、70g d-山梨醇(S1876；Sigma-Aldrich)和23gn-甲基-d-葡糖胺(M2004；Sigma-Aldrich)來(lái)制備PROTOS(pH/折射率/滲量可調(diào)的光學(xué)清理溶液)。室溫下輕輕搖動(dòng)著將經(jīng)處理樣品在10mLPROTOS中孵育2-3天(每天更換溶液)，用于折射率匹配和成像。選擇所列比例以獲得接近中性的pH，1.46左右的折射率和逆轉(zhuǎn)清理期間觀察到的組織膨脹的滲量。通過(guò)添加更大量n-甲基-d-葡糖胺可獲得堿性更高的溶液，通過(guò)用額外的d-山梨醇代替泛影酸可降低滲量。使用AbbematWR/MW自動(dòng)多波長(zhǎng)折射計(jì)(Anton Paar，VA)測(cè)量折射率。

組織變形實(shí)驗(yàn)：為了評(píng)估隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)使組織樣品變形的程度，將經(jīng)清理腦組織在pH 11 LB緩沖液中放在eTANGO裝置中并且旋轉(zhuǎn)著經(jīng)受50V。對(duì)于僅1D電泳，將另一個(gè)組織以這樣的方式放置在eTANGO裝置中：側(cè)面(但不是背側(cè)和腹側(cè))靠近電極并且不旋轉(zhuǎn)。

Gel/BSA-FITC實(shí)驗(yàn)：為了在實(shí)驗(yàn)上測(cè)試通過(guò)水凝膠的隨機(jī)電轉(zhuǎn)運(yùn)，由超純水中4％丙烯酰胺、0.07％雙丙烯酰胺、0.25％偶氮引發(fā)劑和1×PBS的溶液(全部為重量/體積)制備盤(pán)形聚丙烯酰胺凝膠(半徑9mm；高8mm)。如上文對(duì)于CLARITY程序描述的那樣將溶液在15ml圓錐管中脫氣并且聚合，并且將所得圓柱形凝膠用剃刀刀片切成～8mm厚的圓盤(pán)。向eTANGO樣品室裝載BSA-FITC溶液(1mg/ml于pH 7.5 TB中)，使盤(pán)形凝膠的圓形側(cè)接觸室的底部，平坦側(cè)直立。pH 7.5 TB通過(guò)設(shè)備循環(huán)。然后施加200V 1小時(shí)或3小時(shí)以將向凝膠中轉(zhuǎn)運(yùn)BSA-FITC。然后使用大鼠腦基質(zhì)從中部獲得3mm厚的橫截切片，并且利用熒光立體顯微鏡成像。

經(jīng)CLARITY或eTANGO處理的小鼠腦組織的安放和成像：在PROTOS中孵育之后，將樣品安放在載玻片與Willco皿(14032-120；Ted Pella)之間。將一塊Blu-Tack黏合劑(Blu-tack via Amazon)卷成厚度稍微大于樣品厚度的柱形并且以U形放在在載玻片上。然后將樣品仔細(xì)放在Blu-Tack內(nèi)側(cè)并且將Willco皿緊緊壓在黏合劑上(唇形側(cè)朝上)，直到其恰好與樣品接觸。然后將PROTOS注射到黏合劑之間的空隙空間中直到充滿(mǎn)成像室而不引入氣泡。然后使用環(huán)氧樹(shù)脂膠(epoxy glue)(Hysol ES1901；Henkel)填充Blu-Tack中的間隙以構(gòu)建壁并且密封在樣品中。使用兩個(gè)顯微鏡系統(tǒng)。盡管本文已經(jīng)描述和舉例說(shuō)明了本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易想到用于執(zhí)行本文中所述的功能和/或獲得本文中所述結(jié)果和/或一個(gè)或更多個(gè)優(yōu)點(diǎn)的多種其他裝置和/或結(jié)構(gòu)，并且每一種這樣的變化和/或修改被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。更一般地，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解，本文中描述的所有參數(shù)、尺寸、材料和/或構(gòu)造意在示例，并且真實(shí)參數(shù)、尺寸、材料和/或構(gòu)造將取決于本發(fā)明教導(dǎo)所使用的特定應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員將承認(rèn)或者僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)就能夠確定本文中所述本發(fā)明的一些特定實(shí)施方案的等效方案。因此，應(yīng)理解，前述一些實(shí)施方案僅以舉例的方式給出，并且在所附權(quán)利要求及其等效方案的范圍內(nèi)，可以以具體描述和要求保護(hù)的那些以外的方式實(shí)施本發(fā)明。本發(fā)明涉及本文中所述的每一個(gè)單獨(dú)特征、系統(tǒng)、制品、材料、試劑盒和/或方法。另外，兩個(gè)或更多個(gè)這樣的特征、系統(tǒng)、制品、材料、試劑盒和/或方法的組合(如果這樣的特征、系統(tǒng)、制品、材料、試劑盒和/或方法不互相矛盾的話(huà))也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本文在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中未用數(shù)量詞限定的名詞應(yīng)理解為意指“至少一個(gè)/種”，除非明確指出相反情況。

本文在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的短語(yǔ)“和/或”應(yīng)理解為所連接的要素中的“任一個(gè)或兩個(gè)”，即，在一些情況下要素聯(lián)合存在，而在另一些情況下分開(kāi)存在?？赡苋芜x地存在通過(guò)“和/或”項(xiàng)明確指出的要素以外的其他要素，而不論其與明確指出的那些要素相關(guān)還是不相關(guān)，除非明確指出相反情況。因此，作為非限制性實(shí)例，當(dāng)與開(kāi)放式語(yǔ)言如“包含”聯(lián)合使用時(shí)，提及“A和/或B”在一個(gè)實(shí)施方案中可指A而沒(méi)有B(任選地包含除了B以外的要素)；在另一個(gè)實(shí)施方案中可指B而沒(méi)有A(任選地包含除了A以外的要素)；在又一個(gè)實(shí)施方案中，可指A和B二者(任選地包含其他要素)；等。

本文在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的“或”應(yīng)理解為具有與上文中定義的“和/或”相同的含義。例如，當(dāng)分開(kāi)列表中的項(xiàng)時(shí)，“或”或“和/或”應(yīng)解釋為包含，即包含若干要素或要素列表中的至少一個(gè)，但是也包含超過(guò)一個(gè)，并且任選地包含額外未列出的項(xiàng)。僅明確指出相反情況的術(shù)語(yǔ)，例如“僅一個(gè)”或“恰好一個(gè)”或當(dāng)用于權(quán)利要求時(shí)“由......組成”將指包含若干要素或要素列表中的恰好一個(gè)要素。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)前面加上排外性術(shù)語(yǔ)如“任一個(gè)”或“中的一個(gè)”、“中的僅一個(gè)”或“中的恰好一個(gè)”時(shí)，本文中使用的術(shù)語(yǔ)“或”應(yīng)僅解釋為互斥選擇(即，“一個(gè)或另一個(gè)但不是兩個(gè)”)。當(dāng)用于權(quán)利要求時(shí)，“基本上由......組成”應(yīng)具有專(zhuān)利法領(lǐng)域中使用的普通含義。

本文在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中關(guān)于一個(gè)或更多個(gè)要素的列表使用的短語(yǔ)“至少一個(gè)”應(yīng)理解為意指選自要素列表中的任一個(gè)或更多個(gè)要素的至少一個(gè)要素，但是未必包含要素列表中明確列出的每個(gè)和每一個(gè)要素中的至少一個(gè)，并且不排除要素列表中要素的任意組合。該術(shù)語(yǔ)還允許可任選地存在短語(yǔ)“至少一個(gè)”所指的要素列表中明確指出的要素以外的要素，而不論所述要素與指出的要素相關(guān)或不相關(guān)。因此，作為非限制性實(shí)例，“A和B中的至少一個(gè)”(或等效地，“A或B中的至少一個(gè)”，或等效地，“A和/或B中的至少一個(gè)”)在一些實(shí)施方案中可指至少一個(gè)A，任選地包含超過(guò)一個(gè)A，但是不存在B(任選地包含除了B以外的要素)；在另一個(gè)實(shí)施方案中，指至少一個(gè)B，任選地包含超過(guò)一個(gè)B，但是不存在A(任選地包含除了A以外的要素)；在又一個(gè)實(shí)施方案中，指至少一個(gè)A，任選地包含超過(guò)一個(gè)A，和至少一個(gè)B，任選地包含超過(guò)一個(gè)B(并且任選地包含其他要素)；等。

在權(quán)利要求書(shū)和上述說(shuō)明書(shū)中，所有過(guò)渡短語(yǔ)如“包含”、“包括”、“攜帶”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”等應(yīng)理解為開(kāi)放式的，即意指包括但不限于。僅連接詞(transitional phrase)“由......組成”和“基本上由......組成”應(yīng)分別為封閉式或半封閉式連接詞，如美國(guó)專(zhuān)利局專(zhuān)利審查程序手冊(cè)2111.03部分中所示。