分析方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于高半胱氨酸的基于盒的自動化分析。本發(fā)明涉及分析血液中高半胱氨酸的方法和用于這種方法的分析試劑盒。
【專利說明】分析方法
[0001]本申請是申請日為2006年2月23日、申請?zhí)枮?00680006015.2、發(fā)明名稱為“分
析方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002]本發(fā)明涉及分析血液中高半胱氨酸的方法和用于這種方法的分析試劑盒。
[0003]高半胱氨酸(HCy)是小的含硫α氨基酸，不用于蛋白質(zhì)合成，但以低濃度存在于細(xì)胞和細(xì)胞外液中，例如在成年人血漿中一般約10 μ Μ。提高的血漿HCy水平與葉酸或維生素B缺乏以及與心血管疾病相關(guān)。因而在分析血漿中的HCy中存在著重要臨床意義。
[0004]由Axis-Shield ASA開發(fā)了一種這樣的分析系統(tǒng)，可以從AbbottLaboratories商業(yè)地獲得。在銷售的前六年中，已經(jīng)使用這個系統(tǒng)進(jìn)行了超過2600萬這種HCy分析。Axis-Shield/Abbott HCy分析包括將血漿中的HCy酶轉(zhuǎn)化成S-腺苷基-高半胱氨酸(SAH)和對SAH的免疫分析檢測。然而Axis-Shield/Abbott HCy分析被設(shè)計(jì)在臨床實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，仍然需要一種HCy分析，其是即時(shí)(point-of-care)可進(jìn)行的形式，例如，在醫(yī)師的辦公室中進(jìn)行，使得患者不必重新訪問來獲知分析的結(jié)果。
[0005]能夠在即時(shí)使用的分析執(zhí)行設(shè)備近來已經(jīng)由Axis-Shield ASA開發(fā)。這是可以商業(yè)上獲得的(商標(biāo)Afinion)，并在例如W002/090995中進(jìn)行了描述，在此引用其內(nèi)容作為參考。在Afinion系統(tǒng)中，樣品(例如，血液、血漿、尿，等等)被置于分析盒中，其含有預(yù)先加載了進(jìn)行分析所需的試劑的幾個孔，并帶有計(jì)算機(jī)可讀的信息，足以允許設(shè)備來確定對于特定的樣品類型和目標(biāo)被分析物如何進(jìn)行分析。
[0006]我們現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了即時(shí)能夠進(jìn)行的血漿HCy分析，例如，使用Afinion設(shè)備，使用全血，即，不需要從血液樣品分離細(xì)胞。
[0007]使用全血而不是血漿的能力大大地簡化了醫(yī)師所需的樣品操作。
[0008]然而使用全血產(chǎn)生了關(guān)于血漿HCy分析性能的嚴(yán)重難題，因?yàn)闃悠分械募?xì)胞內(nèi)HCy可能潛在地漏入血漿中。實(shí)際上，對于血漿HCy的當(dāng)前的臨床實(shí)驗(yàn)室分析，醫(yī)師被指示從全血中分離血漿，并在30分鐘內(nèi)冷凍保存血漿樣品，以避免被細(xì)胞內(nèi)HCy污染。細(xì)胞內(nèi)HCy造成的污染必需避免，因?yàn)檎?異常血液HCy的當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)是對于血漿HCy的，還不知道患者之間在細(xì)胞內(nèi)HCy中存在多少差異，以及根據(jù)患者的健康狀況這種差異有多少。
[0009]然而，我們現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，通過延遲細(xì)胞裂解直到發(fā)生結(jié)合，并通過校正血細(xì)胞比容，有可能在血漿HCy的酶免疫分析中使用未分離的全血樣品。
[0010]因而，從本發(fā)明的一個方面考慮，提供了分析采自人類或形成血管的非人動物受試者的血液樣品中血漿高半胱氨酸的方法，所述方法包括:用以下試劑接觸來自所述受試者的全血樣品一液體稀釋劑、還原劑、高半胱氨酸-轉(zhuǎn)化酶、任選的所述酶的高半胱氨酸轉(zhuǎn)化反應(yīng)的抑制劑、細(xì)胞裂解劑、能夠與所述高半胱氨酸轉(zhuǎn)化酶的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)合的顏色標(biāo)記的結(jié)合劑，和能夠與所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物競爭與所述結(jié)合劑的結(jié)合的顆粒；在用所述試劑接觸后，抽吸所述樣品通過具有孔隙的膜，所述孔隙足以使所述結(jié)合劑在其未結(jié)合狀態(tài)時(shí)和當(dāng)與所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)合時(shí)通過，但不足以容許與所述顆粒結(jié)合時(shí)的所述結(jié)合劑通過；檢測保持在所述膜上的所述結(jié)合劑的顏色標(biāo)記；通過應(yīng)用取決于所述全血樣品中紅細(xì)胞濃度的校正因子，由此確定血漿高半胱氨酸濃度的指標(biāo)；以及任選的但是優(yōu)選的，將所述血漿高半胱氨酸濃度表示為可視的或電子的信號；其中與所述試劑接觸在如下情況下是相繼的或同時(shí)的:
[0011]i)在與所述稀釋劑、酶和還原劑接觸后發(fā)生與所述裂解劑的接觸；
[0012]?)當(dāng)抑制劑存在時(shí)，與抑制劑的接觸發(fā)生在與所述稀釋劑、酶和還原劑接觸之后，但不晚于與所述裂解劑的接觸；以及
[0013]iii)與所述結(jié)合劑和所述顆粒的接觸不包括與含有所述結(jié)合劑和所述顆粒兩者的液體接觸。
[0014]在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選的是在細(xì)胞裂解開始前(或同時(shí))采取步驟來終止或至少減慢高半胱氨酸轉(zhuǎn)化酶的HCy轉(zhuǎn)化。這可以通過改變樣品溫度，例如，來減慢酶反應(yīng)或使酶變性，或通過稀釋，或通過改變pH值,或通過添加用來抑制反應(yīng)或使酶變性的試劑(例如，使用洗滌劑如SDS、離液鹽例如NaSCN，或其他已知的變性劑，例如尿素或氯化胍(guanidinium chloride),或金屬或輔助因子(co-factor)結(jié)合劑(其中所述酶反應(yīng)需要金屬或輔助因子))來實(shí)現(xiàn)。當(dāng)使用變性洗滌劑時(shí)，這也可以起到裂解劑的作用。為了方便起見，干擾酶的HCy轉(zhuǎn)化反應(yīng)的這種試劑在此是指抑制劑，在本發(fā)明方法的優(yōu)選的實(shí)施方式中，抑制劑被包含在一系列使用的試劑中。
[0015]在本發(fā)明的方法中，與試劑接觸優(yōu)選包括孵育預(yù)定時(shí)間，和優(yōu)選的在預(yù)定的溫度以兩個階段進(jìn)行，首先進(jìn)行與稀釋劑、還原劑和酶的接觸，其次和隨后，進(jìn)行與顆粒和結(jié)合劑接觸。
[0016]在第一優(yōu)選的實(shí)施方式中，接觸順序如下:
[0017]i)與稀釋劑接觸，
[0018]ii)與酶和還原劑接觸，
[0019]iii)孵育，
[0020]iv)與顆粒、抑制劑和裂解劑接觸，
[0021]V)與結(jié)合劑接觸，
[0022]vi)孵育，以及
[0023]vii)抽濾(draw)過膜。
[0024]在第二的、更優(yōu)選的實(shí)施方式中，接觸順序如下:
[0025]i)與稀釋劑接觸，
[0026]ii)與還原劑、酶和顆粒接觸，
[0027]iii)孵育，
[0028]iv)與裂解劑、抑制劑和結(jié)合劑接觸，
[0029]V)孵育，以及
[0030]vi)抽濾過膜。
[0031]在第三優(yōu)選的實(shí)施方式中，接觸順序如下:
[0032]i)與稀釋劑接觸，
[0033]i i )與還原劑、酶和顆粒接觸，
[0034]iii)孵育，
[0035]iv)與裂解劑和抑制劑接觸，
[0036]V)與結(jié)合劑接觸，[0037]vi)孵育，以及
[0038]vii)抽過膜。
[0039]一般地，優(yōu)選的是，試劑存在于單次使用(single-use)的、多孔的(mult1-walled)分析盒中。特別優(yōu)選的，這種盒應(yīng)含有試劑、頂端具有膜的移液管、和可移動的頂端為毛細(xì)管的移液管。在這種盒中，特別優(yōu)選的是至少結(jié)合劑和酶，優(yōu)選的顆粒還以干燥形式存在，結(jié)合劑和顆粒存在于獨(dú)立的孔中。
[0040]因而，從本發(fā)明的進(jìn)一步的方面考慮，提供了單次使用的盒，用于使用全血進(jìn)行血漿高半胱氨酸分析，所述盒具有多孔的底座、可移動的頂端為毛細(xì)管的移液管和蓋子，所述蓋子帶有頂端有膜的的移液管，以及所述底座的孔含有以下的分析試劑:液體稀釋劑；還原劑；高半胱氨酸轉(zhuǎn)化酶；任選的，所述酶的高半胱氨酸轉(zhuǎn)化反應(yīng)的抑制劑；細(xì)胞裂解劑；能與所述酶的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)合的、顏色標(biāo)記的結(jié)合劑；以及能與所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物競爭與所述結(jié)合劑結(jié)合的顆粒；所述結(jié)合劑和所述顆粒處在不同的所述孔中；當(dāng)抑制劑存在時(shí)，所述抑制劑和所述酶存在于不同的所述孔中，所述裂解劑存在于不同于含有所述酶和至少部分的所述還原劑和所述稀釋劑的一個或多個孔的孔中。
[0041]在第一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述盒包括至少四個孔，第一個含有稀釋劑，第二個含有酶和還原劑，第三個含有顆粒、裂解劑和抑制劑，第四個含有結(jié)合劑。在第二優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述盒包括至少四個孔，第一個含有稀釋劑，第二個含有稀釋劑、抑制劑和裂解劑，第三個含有酶、還原劑和顆粒，第四個含有結(jié)合劑。在第三優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述盒包括至少四個孔，第一個含有稀釋劑，第二個含有酶、還原劑和顆粒，第三個含有稀釋劑、抑制劑和裂解劑，第四個含有結(jié)合劑。這三種盒形式特別適合于進(jìn)行以上列出的優(yōu)選的接觸順序。
[0042]本發(fā)明的盒的孔，當(dāng)它們含有液體時(shí)，優(yōu)選的具有可移動的或可打孔的封閉物(closure)，例如，箔封蓋。蓋子優(yōu)選的包括鉆孔器(piercer)用于刺穿這種封蓋，優(yōu)選的形成可容納可移動的移液管的形狀，移液管本身可用于采集全血樣品用于導(dǎo)入盒中。
[0043]在使用前，所述盒優(yōu)選的裝在密封容器中，例如箔包裝，其優(yōu)選的還含有干燥劑，例如娃膠或分子篩。
[0044]因而，使用第一優(yōu)選的盒的實(shí)施方式的分析操作適當(dāng)?shù)匕ㄒ韵虏襟E:
[0045]I)將毛細(xì)管浸入血中，并將頂端為毛細(xì)管的移液管置于盒中；
[0046]2 )將所述盒置于分析設(shè)備中，并啟動自動化分析操作(即，以下列出的步驟自動地進(jìn)行)；
[0047]3)從底座除下蓋子并開啟任何密封的孔；
[0048]4)將稀釋劑從第一孔中引入頂端為毛細(xì)管的移液管；
[0049]5)將血液和稀釋劑從頂端為毛細(xì)管的移液管中引入第二孔中；
[0050]6 )使第二孔的內(nèi)容物孵育預(yù)設(shè)的時(shí)間；
[0051]7)在孵育期間，使用頂端為毛細(xì)管的移液管將稀釋劑從第一孔引入第三孔；
[0052]8)使用頂端為毛細(xì)管的移液管將孵育的液體從第二孔引入第三孔；
[0053]9)使用頂端為毛細(xì)管的移液管將結(jié)合劑和稀釋劑從第四孔引入第三孔；
[0054]10)使第三孔的內(nèi)容物孵育預(yù)設(shè)的時(shí)間；
[0055]11)將孵育的液體從第三孔通過穿過所述膜引入頂端有膜的的移液管；
[0056]12)檢測保持在膜的外表面上的結(jié)合劑；以及[0057]13)確定血漿HCy含量并顯示和/或輸出結(jié)果。
[0058]第二優(yōu)選的盒的實(shí)施方案的分析操作順序如下:
[0059]I)將毛細(xì)管浸入血中，并將頂端為毛細(xì)管的移液管置于盒中；
[0060]2 )將所述盒置于分析設(shè)備中，并啟動自動化分析操作(即，以下列出的步驟自動地進(jìn)行)；
[0061]3)從底座除下蓋子并開啟任何密封的孔；
[0062]4)將稀釋劑從第一孔中引入頂端為毛細(xì)管的移液管；
[0063]5)將血液和稀釋劑從頂端為毛細(xì)管的移液管中引入第三孔中；
[0064]6)使第三孔的內(nèi)容物孵育預(yù)設(shè)的時(shí)間；
[0065]7)在孵育期間，使用頂端為毛細(xì)管的移液管將稀釋劑從第一孔和/或第二孔引入第四孔；
[0066]8)使用頂端為毛細(xì)管的移液管將稀釋劑、裂解劑和抑制劑從第二孔引入第三孔；
[0067]9)使用頂端為毛細(xì)管的移液管將結(jié)合劑和稀釋劑從第四孔引入第三孔；
[0068]10)使第三孔的內(nèi)容物孵育預(yù)設(shè)的時(shí)間；
[0069]11)將孵育的液體從第三孔穿過所述膜引入頂端有膜的的移液管；
[0070]12)檢測保持在膜的外表面上的結(jié)合劑；以及
[0071]13)確定血衆(zhòng)HCy含量并顯不和/或輸出結(jié)果。
[0072]第三個優(yōu)選的盒的實(shí)施方案的分析操作順序如下:
[0073]I)將毛細(xì)管浸入血中，并將頂端為毛細(xì)管的移液管置于盒中；
[0074]2 )將所述盒置于分析設(shè)備中，并啟動自動化分析操作(即，以下列出的步驟自動地進(jìn)行)；
[0075]3)從底座除下蓋子并開啟任何密封的孔；
[0076]4)將稀釋劑從第一孔中引入頂端為毛細(xì)管的移液管；
[0077]5)將血液和稀釋劑從頂端為毛細(xì)管的移液管中引入第二孔中；
[0078]6 )使第二孔的內(nèi)容物孵育預(yù)設(shè)的時(shí)間；
[0079]7)在孵育期間，使用頂端為毛細(xì)管的移液管將稀釋劑從第三孔引入第四個孔；
[0080]8)使用頂端為毛細(xì)管的移液管將孵育的液體從第二孔引入第三孔；
[0081]9)使用頂端為毛細(xì)管的移液管將結(jié)合劑和稀釋劑從第四孔引入第三孔；
[0082]10)使第三孔的內(nèi)容物孵育預(yù)設(shè)的時(shí)間；
[0083]11)將孵育的液體從第三孔穿過所述膜引入頂端有膜的的移液管；
[0084]12)檢測保持在膜的外表面上的結(jié)合劑；以及
[0085]13)確定血衆(zhòng)HCy含量并顯不和/或輸出結(jié)果。
[0086]用于本發(fā)明的分析方法的一種或多種試劑可以以固體或半固體形式存在，例如，作為薄膜、粉未或珠子。當(dāng)使用在此描述的加載了試劑的盒進(jìn)行分析時(shí)，使用珠子形式的試劑是特別有益的，因?yàn)樗岣吡撕屑虞d和分析操作設(shè)計(jì)的靈活性，重要是因?yàn)樵诤袃Υ嫫陂g可能相互作用的試劑可以在相同的盒的孔中以珠子形式存在而在儲存期間不發(fā)生相互作用的問題。此外，單獨(dú)的試劑的儲存穩(wěn)定性在呈珠子形式時(shí)大于溶液形式。
[0087]結(jié)果，在本發(fā)明的三個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，分析盒含有珠子形式的選定試齊U。因而，在第四優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述盒包含至少五個孔:第一個含有稀釋劑和細(xì)胞裂解劑；第二個含有稀釋劑；第三個含有含結(jié)合劑的第一珠子和含顆粒的第二珠子；第四個含有含抑制劑的第三珠子；第五個含有含酶和還原劑的第四珠子，任選的但是優(yōu)選的，第五珠子含有核酸酶。在第五優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述盒包含至少五個孔:第一個含有稀釋劑和細(xì)胞裂解劑；第二個含有稀釋劑和任選的但優(yōu)選的核酸酶；第三個含有含結(jié)合劑的第一珠子和含顆粒的第二珠子；第四個含有含抑制劑的第三珠子；第五個含有含酶和還原劑的第四珠子。在第六優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述盒包含至少五個孔:第一個含有稀釋劑和細(xì)胞裂解劑；第二個含有稀釋劑和任選的但優(yōu)選的核酸酶；第三個含有含結(jié)合劑的第一珠子和含顆粒的第二珠子；第四個不含試劑；第五個含有抑制劑，和單獨(dú)地，含酶和還原劑的第三珠子。
[0088]在這些實(shí)施方式中，在第五和第四孔中的任何珠子理想地分別處于頂端為毛細(xì)管的移液管或頂端有膜的的移液管內(nèi)部。當(dāng)?shù)谖蹇缀兄樽訒r(shí)，它優(yōu)選的位于頂端為毛細(xì)管的移液管的儲存器(reservoir)中。在剛剛描述的實(shí)施方式中，這些珠子含有酶和還原劑。在第六實(shí)施方式中，第五孔還含有抑制劑，例如，以干燥的形式，在孔底部的倒轉(zhuǎn)的圓錐形塑料杯中，即，與所述珠子分隔開。
[0089]因而，使用第四和第五優(yōu)選的盒實(shí)施方式的分析操作適當(dāng)?shù)匕ㄒ韵虏襟E:
[0090]I)將毛細(xì)管浸入血中，并將頂端為毛細(xì)管的移液管置于盒中；
[0091]2)將所述盒置于分析設(shè)備中，并啟動自動化分析操作(S卩，以下列出的步驟自動地進(jìn)行)；
[0092]3)從底座除下蓋子并開啟任何密封的孔；
[0093]4)將稀釋劑從第二孔中引入頂端為毛細(xì)管的移液管；
[0094]5)將血液、稀釋劑和酶從頂端為毛細(xì)管的移液管沖洗到第二孔中；
[0095]6)使第二孔的內(nèi)容物孵育；
[0096]7)將稀釋劑和細(xì)胞裂解劑從第一孔引入頂端有膜的的移液管中，并沖洗回第一孔；
[0097]8)使用頂端為毛細(xì)管的移液管，將稀釋劑、細(xì)胞裂解劑和抑制劑從第一孔引入第二孔中；
[0098]9)使用頂端為毛細(xì)管的移液管，將裂解的樣品從第二孔引入第三孔中；
[0099]10)使第三個孔的內(nèi)容物孵育；
[0100]11)將孵育的液體從第三孔穿過所述膜引入頂端有膜的移液管；
[0101]12)檢測保持在膜的外表面上的結(jié)合劑；以及
[0102]13)確定血衆(zhòng)HCy含量并顯不和/或輸出結(jié)果。
[0103]使用第六優(yōu)選的盒的實(shí)施方式的分析操作適當(dāng)?shù)匕ㄒ韵虏襟E:
[0104]I)將毛細(xì)管浸入血中，并將頂端為毛細(xì)管的移液管置于盒中；
[0105]2 )將所述盒置于分析設(shè)備中，并啟動自動化分析操作(即，以下列出的步驟自動地進(jìn)行)；
[0106]3)從底座除下蓋子并開啟任何密封的孔；
[0107]4)將稀釋劑從第二孔中引入頂端為毛細(xì)管的移液管；
[0108]5)將血液、稀釋劑和酶從頂端為毛細(xì)管的移液管沖洗到第二孔中；
[0109]6)使第二孔的內(nèi)容物孵育；[0110]7)使用頂端為毛細(xì)管的移液管，將稀釋劑、細(xì)胞裂解劑從第一孔引入第五孔來溶解抑制劑；
[0111]8)使用頂端為毛細(xì)管的移液管，將稀釋劑、細(xì)胞裂解劑和抑制劑從第五孔轉(zhuǎn)移到第一孔中；
[0112]9)使用頂端為毛細(xì)管的移液管，將稀釋劑、細(xì)胞裂解劑和抑制劑從第一孔轉(zhuǎn)移到第二孔中；
[0113]10)使用頂端為毛細(xì)管的移液管，將裂解的樣品從第二孔引入第三孔中；
[0114]11)使第三孔的內(nèi)容物孵育；
[0115]12)將孵育的液體從第三孔穿過所述膜引入頂端有膜的的移液管；
[0116]13)檢測保持在膜的外表面上的結(jié)合劑；以及
[0117]14)確定血衆(zhòng)HCy含量并顯不和/或輸出結(jié)果。
[0118]在每種情況下，樣品的血紅蛋白含量優(yōu)選的在攝取樣品穿過膜之前以分光光度測定。理想地，在樣品已經(jīng)與細(xì)胞裂解劑接觸后進(jìn)行該測定。
[0119]當(dāng)液體從一個孔轉(zhuǎn)移到另一個時(shí)，這一般地不是供體孔的全部液體內(nèi)容物，而是預(yù)定的體積。
[0120]本發(fā)明的方法中使用的高半胱氨酸轉(zhuǎn)化酶可以是產(chǎn)生能夠直接地、間接地與結(jié)合劑結(jié)合的高半胱氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的任何一種。就此來說間接結(jié)合是指初始的酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可以用作進(jìn)一步反應(yīng)中的反應(yīng)物，所述進(jìn)一步反應(yīng)的產(chǎn)物可以與結(jié)合劑結(jié)合。幾種高半胱氨酸轉(zhuǎn)化酶是已知的并且可以使用，例如，胱硫醚β合成酶、高半胱氨酸酶、高半胱氨酸脫硫酶、甲硫氨酸合成酶、二甲基噻亭高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、甜菜堿-高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、5-甲基四氫葉酸-高半胱氨酸-S-甲基轉(zhuǎn)移酶、5-甲基四氫蝶?；劝彼?高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶、O-琥珀?；呓z氨酸-β -裂解酶和S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAH-水解酶)。使用SAH-水解酶，特別是重組的SAH-水解酶是優(yōu)選的。使用這些酶的高半胱氨酸的酶轉(zhuǎn)化可能需要進(jìn)一步的反應(yīng)物，“共同-底物(co-substrate) ”,例如對于SAH-水解酶來說為腺苷或腺苷類似物，或?qū)τ诟甙腚装彼崦竵碚f為水。當(dāng)需要共同底物時(shí)，這一般需要在本發(fā)明的分析方法和盒中以試劑提供它們。這種共同底物應(yīng)當(dāng)在第一次孵育時(shí)與血液樣品接觸，一般可以存在于稀釋劑中或與酶一同存在。
[0121]當(dāng)酶是SAH-水解酶時(shí)，被分析物一般是腺苷或SAH，或其中之一的酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。然而SAH是優(yōu)選的被分析物。當(dāng)酶是高半胱氨酸脫硫酶時(shí)，被分析物一般是α-酮丁酸酯(alpha-keto butyrate)的酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
[0122]根據(jù)本發(fā)明使用的稀釋劑優(yōu)選的是含水的，例如，水或含水緩沖液，例如磷酸鹽、碳酸鹽、硼酸鹽、MOBS、HEPES, Tris或雙甘氨肽緩沖液，一般具有6到10、更優(yōu)選的7到9、特別是7.2到8.5的pH值。當(dāng)然可以使用具有這種pH值的其他緩沖液。
[0123]根據(jù)本發(fā)明使用的還原劑用來將HCy可能在血漿中出現(xiàn)的各種形式轉(zhuǎn)化成游離高半胱氨酸。還原劑的使用是血漿HCy分析中常規(guī)的?？梢允褂玫倪m合的還原劑的實(shí)例包括二巰基化物(特別是二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)和雙-(2-巰基乙基)砜)、膦(例如三(2-羧乙基)膦(TCEP)、三苯基膦和三-正丁基-膦)、硼烷(例如，硼烷-四氫呋喃復(fù)合物、二甲硫-甲硼燒(dimethylsulphide-borane)和癸硼燒)硼氫化物(例如,NaCNBH3、NaBH4和三乙酰氧基硼氫化物)、氫化物(例如，LiAlH4)和硅烷(例如烷基硅烷如Et3SiH、苯基硅烷和三(三甲基甲硅烷基)硅烷)。使用三(2-羧乙基)膦:HCl (TCEP)是特別優(yōu)選的。
[0124]根據(jù)本發(fā)明使用的抑制劑用來在樣品中的細(xì)胞被裂解之前終止高半胱氨酸轉(zhuǎn)化以防止分析所測定的血漿HCy值被來自細(xì)胞內(nèi)HCy的任何顯著貢獻(xiàn)而污染。酶抑制劑是公知的。這些抑制劑一般直接與酶組合來抑制它的性能，例如，通過模擬天然底物的性質(zhì)，從而例如引起酶的阻斷或另一種產(chǎn)物的產(chǎn)生。然而，其他的可以作用于底物或輔助因子或作用于酶加工期間形成的分子或中間物(從而阻止正常終產(chǎn)物的形成)。例如對于SAH-水解酶來說，與硫醇基團(tuán)反應(yīng)或干擾硫醇基團(tuán)的試劑將作為抑制劑起作用，因?yàn)橛坞x硫醇基團(tuán)是這種酶的生物作用所需的。實(shí)例包括硫柳萊和馬來酰亞胺(maleimido)化合物(例如,N-乙基-馬來酰亞胺(N-ethylmaleimide))。其他抑制劑的實(shí)例包括腺嘌呤類似物和腺苷。進(jìn)一步的抑制劑包括:D-香燕嘌呤(eritadenine)、9_β -D-xylofuranosyladenine、腺嘌呤9-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(arabino furanoside)、赤蘚-9- (2-輕基-3-壬基)-腺嘌呤、全碘(periodo)-氧化的腺苷、2’ -脫氧腺苷、3’ -脫氧腺苷、2’，3’ -雙脫氧腺苷、碳環(huán)的腺苷、2-氯-腺苷、2-氯脫氧腺苷、腺苷二醛、N6-甲基腺苷、助間型霉素(c0f0rmycin)、2’-脫氧柯福霉素、間型霉素(formycin)、2-氨基-6-氯-嘌呤核苷、水粉蕈素(nebularin)、卩比唑霉素、3-脫氮(deaza) (+/_)_隱陸頭霉素、隱陸頭霉素(aristeromycin)(和它的鹵乙烯基(halovinyl)衍生物)、tubericin和阿糖腺苷(ara-Α)和其衍生物(例如,2-氯-阿糖腺苷)。使用硫柳汞是優(yōu)選的，然而，使用N-乙基馬來酰亞胺是特別優(yōu)選的，例如，在300 μ g/mL的使用濃度。涉及重組SAH-水解酶以及抑制它的功能的各種材料的公開物的鏈接可以在 http://www.pdg.cnb.uam.es/UniPub/iHOP/gs/95822.html 中找到。
[0125]根據(jù)本發(fā)明使用的細(xì)胞裂解劑用來破壞血細(xì)胞使得它們不在膜的外表面上維持。細(xì)胞裂解劑是公知的，根據(jù)本發(fā)明使用的適合的細(xì)胞裂解劑包括洗滌劑，例如，尿素、脫氧膽酸鹽、empigen、ammonyx、SDS、thesit (例如 Lubrol PX 和 C12E9)和 Triton XlOO (例如Nonidet P40)。優(yōu)選使用0.4%wt.的工作濃度的SDS。
[0126]在例如本發(fā)明的分析方法中，其中樣品中的細(xì)胞在樣品抽吸通過多孔膜之前被裂解，檢測由膜保留的物質(zhì)，細(xì)胞裂解釋放的DNA可以至少部分地阻塞所述膜的孔洞。特別的情況是當(dāng)樣品含有高濃度的白細(xì)胞時(shí)。因而膜孔洞阻塞可以通過使用DNAse，S卩，核酸酶來消化細(xì)胞裂解釋放的DNA來降低。核酸酶可以在樣品被抽吸通過所述膜之前的任何時(shí)間與樣品接觸。
[0127]核酸酶可能需要活化劑，例如2族金屬離子，例如Mg2+，在這種情況下與活化劑的接觸可以在與核酸酶接觸之前、期間或之后發(fā)生，只要它在樣品被抽吸通過膜之前發(fā)生。然而優(yōu)選與活化劑的接觸在與核酸酶接觸的同時(shí)發(fā)生。核酸酶和它們需要的活化劑是公知的和商業(yè)上可獲得的,例如,來自Merck的Benzonase。
[0128]根據(jù)本發(fā)明使用的結(jié)合劑可以是任何物質(zhì)(material)，其相對于樣品中存在的其他物質(zhì)優(yōu)先地結(jié)合酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和它的競爭劑(所述顆粒)。它由共價(jià)地或其它結(jié)合或保持在一起的兩個功能部分組成，即，顏色標(biāo)記和結(jié)合部分。顏色標(biāo)記理想地是在可見范圍內(nèi)吸收、發(fā)射、散射或產(chǎn)生光的物質(zhì)，例如發(fā)色團(tuán)或熒光基團(tuán)。然而，可以使用在紅外或UV范圍中吸收、發(fā)射、散射或產(chǎn)生光的顏色標(biāo)記。因而，顏色標(biāo)記可以是任何可以分光光度檢測的部分，實(shí)例例如發(fā)色團(tuán)或熒光基團(tuán)，或酶標(biāo)記(例如，堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒火蟲熒光素酶)，其可以產(chǎn)生可被分光光度地讀取的顏色、熒光、光發(fā)射或散射信號。特別優(yōu)選的，使用聚簇的膠態(tài)金或其他金屬，例如，具有約100到200nm的聚簇(cluster)的模式顆粒大小。結(jié)合部分可以是抗體或其片段或構(gòu)建物，或小的有機(jī)分子，等等。使用抗體和抗體片段或構(gòu)建物是優(yōu)選的。當(dāng)使用的酶是SAH-水解酶時(shí)，優(yōu)選的是使用抗-SAH抗體，特別是重組的這種抗體。這種類型的抗體例如在Axis-Shield ASA的專利公開中，如W000/40973中描述了，其公開內(nèi)容在此引用作為參考。更特別地，單克隆抗-SAH抗體可以如W000/40973的實(shí)施例1中描述的來產(chǎn)生。將膠體金偶聯(lián)到這種抗體可以如US-A-5691207和US-A-5650333中描述的進(jìn)行。
[0129]根據(jù)本發(fā)明使用的顆?？梢允侨魏挝镔|(zhì)，其可以懸浮在稀釋劑中并被所述膜保留。它也具有兩個功能組分，引起膜保留的大體積實(shí)體(bulky entity)和與結(jié)合劑結(jié)合的競爭劑，這兩者通過共價(jià)鍵或其他相互作用偶聯(lián)。大體積試劑優(yōu)選的是白色或無色的，例如，聚合物顆粒，例如膠乳顆粒。競爭劑部分一般是酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物或其類似物或片段。當(dāng)酶是SAH-水解酶時(shí)，競爭劑優(yōu)選的是S-腺苷基-半胱氨酸。用于將競爭劑偶聯(lián)到大體積部分的化學(xué)技術(shù)明顯取決于后者上可用于反應(yīng)的功能基團(tuán)的性質(zhì)。如果大體積部分帶有反應(yīng)性或預(yù)活化(preactivated)基團(tuán)例如氯甲基或醒,一般地連接試劑例如水溶性的碳二亞胺，例如1-乙基-3- (二甲基氨丙基)-碳二亞胺、EDC/EDAC、同雙功能的(homobifunctional)連接試劑例如雙(磺基-琥珀酰亞胺基)辛二酸鹽(suberate)、BS3，可以被使用或可以進(jìn)行偶聯(lián)。優(yōu)選的，競爭劑首先與蛋白質(zhì)(例如，白蛋白或更優(yōu)選的甲狀腺球蛋白)偶聯(lián)，之后蛋白質(zhì)-競爭劑綴合物與大體積部分偶聯(lián)。本領(lǐng)域很好地建立了這種偶聯(lián)化學(xué)作用。
[0130]根據(jù)本發(fā)明使用的膜可以是具有孔洞的任何材料，使得保留顆粒但使結(jié)合劑和它與轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的綴合物通過。在選擇膜材料時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮的因素包括孔徑尺寸、強(qiáng)度和可連接性?？讖匠叽鐟?yīng)當(dāng)足夠小以阻止期望的綴合物，而又足夠大以使非綴合的物質(zhì)和非希望的綴合物通過。使用小的顆粒(例如，0.1到1.0 μ m)比用大的顆粒(例如，I到10 μ m)得到更好的信號，但也引起更高的膜阻塞。因而，優(yōu)選的顆粒大小是I到2 μ m,因而優(yōu)選地選擇膜孔徑大小。使用親水性的聚醚砜(polyethersulphone)和丙烯基共聚物(aeryIcopolymer)膜，例如具有高于0.8 μ m孔徑大小,是優(yōu)選的。這種膜可以作為Supor和Versapor從Pall獲得。膜可以粘附或熔接到它的移液管上；優(yōu)選的它是平面的，傾斜于移液管的軸放置(即，在垂直和平行之間)。這種方案在W002/090995中描述了，在Axis-Shield ASA銷售的Afinion盒中出現(xiàn)了。
[0131]理想的，至少根據(jù)本發(fā)明使用的盒中無移液管的孔在橫截面上是矩形的，平面的透明底座與垂直于孔軸的平面成一定角度傾斜。
[0132]為了充分完全地發(fā)生酶反應(yīng)來產(chǎn)生足夠的被分析物，如上所述，期望的是孵育樣品。同樣地，為了發(fā)生足夠的結(jié)合劑綴合(conjugation)以產(chǎn)生足夠的信號，期望的是進(jìn)行樣品的第二次孵育。換句話說，兩種反應(yīng)都不需要進(jìn)行到平衡，孵育時(shí)間應(yīng)當(dāng)理想地保持短到與期望的分析精確性相兼容，以便優(yōu)化對于用戶的分析可接受性。一般地，這種孵育將在20到45°C、優(yōu)選的30到45°C以及最優(yōu)選的36到42°C下進(jìn)行。適合的孵育時(shí)間一般在0.5到10分鐘、0.75到5分鐘、更優(yōu)選的I到3分鐘的范圍內(nèi)。對于酶孵育，最優(yōu)選的范圍是I到2分鐘。
[0133]為了血漿HCy的測定值可以用血液樣品的相對血漿含量(plasma content)來修正(因?yàn)榛颊吆突颊叩难?xì)胞比容可能不相同)，醫(yī)師必需輸入血細(xì)胞比容的值(或指標(biāo))，或者，更優(yōu)選的，血細(xì)胞比容的值(或指標(biāo))必需在分析過程中被測定。為此，可以在細(xì)胞裂解之前，更優(yōu)選的在細(xì)胞裂解之后，分光光度法測量樣品的血紅蛋白含量。當(dāng)測量在細(xì)胞裂解之前進(jìn)行時(shí)，優(yōu)選的進(jìn)行背景修正，例如，使用紅外線范圍中進(jìn)行的分光光度法測量。當(dāng)測定的血細(xì)胞比容值異常的低時(shí)，例如，低于0.3，更特別地低于0.25，本發(fā)明的方法優(yōu)選的還(可視地或電子地)呈現(xiàn)血細(xì)胞比容值或者警告該值是低的。如果需要，可以在任何情況下呈現(xiàn)血細(xì)胞比容值。
[0134]血紅蛋白含量的測定可以通過光散射、透射或反射。優(yōu)選的，它是吸收的，例如使用綠色或藍(lán)色二極管作為光源。保留在膜上的結(jié)合劑濃度的測定一般通過反射光，例如，使用綠色或藍(lán)色二極管作為光源。
[0135]與大多數(shù)分析一樣，優(yōu)選的是校準(zhǔn)分析，例如使用具有已知HCy含量的標(biāo)準(zhǔn)物。使用的試劑的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)優(yōu)選的將與盒一起提供，例如，在標(biāo)簽(bar)中編碼，或在盒或它的包裝上標(biāo)注其它機(jī)器可讀的代碼。
[0136]本發(fā)明的方法在定量高達(dá)30 μ M的血漿HCy水平中特別有效。當(dāng)血漿HCy高于30 μ M時(shí)，分析輸出可以僅僅表明血漿HCy含量異常地高。正常水平一般是10-15 μ M或更低，醫(yī)師介入是更高水平所需的，例如維生素B或葉酸補(bǔ)充或者心血管問題的研究，等等。低于正常血漿HCy值一般不看作是有問題，在嬰兒和采取了多種維生素補(bǔ)充的患者中，數(shù)值可以低至約5 μ Μ。
[0137]對全血進(jìn)行診斷分析來確定細(xì)胞外被分析物的血衆(zhòng)含量(plasma content)的操作是新穎的，所述的細(xì)胞外被分析物還存在于血細(xì)胞中，并形成了本發(fā)明的進(jìn)一步的方面。從本發(fā)明的這個方面考慮，提供了分析在血漿中和在血細(xì)胞中存在的被分析物的方法，所述方法包括(a)測定所述被分析物在全血樣品的血漿中的含量，(b)測定(優(yōu)選的分光光度法)所述樣品的血細(xì)胞比容或血紅蛋白含量，以及(C)由此測定所述被分析物的血漿濃度。
[0138]因而，步驟(a)可以包括使全血樣品的血漿中的被分析物反應(yīng)來產(chǎn)生可檢測的物質(zhì)，而所述樣品中的細(xì)胞是完整的，在細(xì)胞內(nèi)被分析物不會反應(yīng)來形成所述產(chǎn)物的條件下裂解所述細(xì)胞并檢測所述產(chǎn)物。
[0139]當(dāng)試劑以珠子形式存在時(shí)，這些可以是包被或灌注了干燥的試劑和任選的惰性的和優(yōu)選的不吸濕的粘合劑(例如，糖類例如海藻糖，或PEG)的水不溶性的珠子；然而，優(yōu)選包含試劑和惰性粘合劑水溶性的珠子，。例如，通過冷凍5到100 μ L (優(yōu)選的10-50 μ L)的緩沖的試劑溶液的液滴，然后冷凍干燥所述冷凍的液滴，可以制備這種珠子。
[0140]在診斷分析中，特別是基于盒的分析中使用這種試劑珠子是新穎的，并形成本發(fā)明的進(jìn)一步的方面。因而，考慮本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了單次使用的盒用于診斷分析，例如體液、胞塊(mass)或組織樣品中的被分析物的分析的，所述盒包括具有多個孔的盒體，孔的至少一個、優(yōu)選的至少2個含有用于進(jìn)行所述分析的試劑，特征在于至少一個孔含有珠子，所述珠子在溶劑(例如水)中釋放至少一種所述試劑。以珠子形式呈現(xiàn)的試劑包括例如被分析物結(jié)合劑、競爭性結(jié)合顆粒、酶(例如，核酸酶、被分析物(例如，高半胱氨酸)轉(zhuǎn)化酶，等等)等等。雖然使用這種盒分析的被分析物優(yōu)選的是高半胱氨酸，它可以是任何其他適合的被分析物，例如，C-反應(yīng)蛋白、凝結(jié)因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白、鐵蛋白等等。
[0141]現(xiàn)在參考以下非限制性實(shí)施例和附圖將進(jìn)一步描述本發(fā)明的方法和盒，在附圖中:[0142]圖1到7是根據(jù)本發(fā)明的盒的示意圖，顯示了在根據(jù)本發(fā)明的分析方法的操作中的物質(zhì)轉(zhuǎn)移平臺；和
[0143]圖8包括示意圖，顯示了在附圖1所示的平臺中盒組件的相對位置。
[0144]參考附圖1，顯示了五孔分析盒，包括透明塑料底座1，其中具有五個孔2、3、4、5、6(在實(shí)施例中分別稱為E、D、C、B和A孔)和支柱7?？?、3和4用箔8密封。盒蓋9 (僅部分地顯示)包含可移動的頂端為毛細(xì)管的移液管10和頂端有膜12的固定的移液管11?？?到4的內(nèi)容物在實(shí)施例1中描述。
[0145]箭頭顯示表示了實(shí)施例2中闡述的連續(xù)物質(zhì)轉(zhuǎn)移。
[0146]圖2類似于附圖1，只是孔2到4的內(nèi)容物在實(shí)施例3中描述，箭頭表示實(shí)施例4中闡述的連續(xù)物質(zhì)轉(zhuǎn)移。
[0147]圖3類似于附圖1，只是孔2到4的內(nèi)容物在實(shí)施例5中描述，箭頭表示實(shí)施例6中闡述的連續(xù)物質(zhì)轉(zhuǎn)移。
[0148]圖4類似于附圖1，只是孔2到4的內(nèi)容物在實(shí)施例7中描述，箭頭表示實(shí)施例8中闡述的連續(xù)物質(zhì)轉(zhuǎn)移。
[0149]圖5類似于附圖1，只是孔I到5的內(nèi)容物在實(shí)施例9中描述，箭頭表示實(shí)施例10中闡述的連續(xù)物質(zhì)轉(zhuǎn)移。
[0150]圖6類似于附圖1，只是孔I到5的內(nèi)容物在實(shí)施例11中描述，箭頭表示實(shí)施例12中闡述的連續(xù)物質(zhì)轉(zhuǎn)移。
[0151]圖7類似于附圖1，只是孔I到5的內(nèi)容物在實(shí)施例13中描述，箭頭表示實(shí)施例14中闡述的連續(xù)物質(zhì)轉(zhuǎn)移。
[0152]參考圖8，實(shí)施例2中闡述的物質(zhì)轉(zhuǎn)移的順序在附圖8A到8X中顯示。
[0153]在實(shí)施例中，除非另有說明，百分比是重量百分比。
[0154]實(shí)施例1
[0155]附圖1的分析盒
[0156]A 子L
[0157]這個孔含有大約22 μ g的膠體金(約IOOnm顆粒大小)和抗-SAH抗體的綴合物，所述抗體如W000/40973的實(shí)施例1中描述制備，并如US-A-5691207和US-A-5650333中的描述進(jìn)行綴合，置于倒圓錐的塑料杯上真空干燥。
[0158]B 孔
[0159]這個孔含有頂端具有大約4mm x8mm的Supor800膜(Pall-孔徑大小0.8 μ m)的移液管。
[0160]C 孑L
[0161]這個孔含有185 μ L 的緩沖液(IOmM 磷酸鹽、150mM NaCl、pH7.4 或 25mM tris,150mM NaCl, pH8.1)，含有酶抑制劑(0.2%硫柳汞)和裂解劑(l%Triton X-100)。
[0162]D 孑L
[0163]這個孔含有0.27 μ g腺苷、50 μ g顆粒(與S-腺苷基_半胱氨酸綴合的I μ m膠乳顆粒)或300 μ g顆粒(與S-腺苷基-半胱氨酸綴合的2 μ m膠乳顆粒)，約5單位重組SAH-水解酶，和還原劑(23yg TCEP (三(2-羧乙基)膦:HC1))。將這些內(nèi)容物的濃縮水溶液填充到孔中，然后真空干燥。[0164]E 孔
[0165]這個孔含有300到350μ L的緩沖液(IOmM磷酸鹽、150mM NaCl、pH7.4或25mMtrisU50mM NaCl、pH8.1)。
[0166]實(shí)施例2
[0167]附圖1/實(shí)施例1的分析操作
[0168]A孔中所示的毛細(xì)管中的血液樣品(5到10 μ L)通過從E孔吸取200 μ L緩沖液來稀釋，然后注入到D孔中。使用毛細(xì)移液管來將C孔的內(nèi)容物的85 μ L轉(zhuǎn)移到A孔中來溶解金綴合物。然后將盒在37°C孵育3分鐘，之后使用毛細(xì)移液管來將D孔的100 μ L內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到C孔中。然后通過檢測C孔的內(nèi)容物對來自綠色或藍(lán)色二極管的光線的吸收，來測量血細(xì)胞比容水平。然后使用毛細(xì)移液管將A孔的60 μ L內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到C孔。然后將盒在37°C孵育I分鐘。然后將C孔的總內(nèi)容物吸入到頂端有膜(membrane-tipped)的移液管中(任選的繼之以E孔中的剩余緩沖液)來降低背景。然后使用綠色或藍(lán)色二極管照明以反射方式檢測保留在膜外側(cè)的金膠體(相應(yīng)于在第二次孵育形成的金/膠乳綴合物)。
[0169]使用已知的HCy含量的標(biāo)準(zhǔn)物校準(zhǔn)該分析，同樣地相對標(biāo)準(zhǔn)物例如，離心的、對一系列血液樣品的血細(xì)胞比容測定來校準(zhǔn)血細(xì)胞比容測定。
[0170]實(shí)施例3
[0171]附圖2的分析盒
[0172]A 孔
[0173]與實(shí)施例1中一樣，但是為大約22 μ g綴合物。
[0174]B 孔
[0175]與實(shí)施例1 一樣。
[0176]C 孔
[0177]這個孔含有0.27g腺苷、20 μ g顆粒(與S-腺苷基-半胱氨酸綴合的I μ m膠乳顆粒)或160 μ g顆粒(與S-腺苷基-半胱氨酸綴合的2 μ m膠乳顆粒)，約5單位重組SAH-水解酶，和還原劑(23yg三(2-羧乙基)膦:HC1)。將這些內(nèi)容物的濃縮水溶液充填到該孔中，然后真空干燥。
[0178]D 孔
[0179]這個孔含有225 μ L 的緩沖液(IOmM 磷酸鹽、150mM NaCl、pH7.4 或 25mM tris,150mM NaCl, pH8.1)，含有酶抑制劑(0.4%硫柳汞)和裂解劑(2%Triton X-100)。
[0180]E 孔
[0181]這個孔含有350 μ L 的緩沖液(IOmM 磷酸鹽、150mM NaCl、ρΗ7.4 或 25mM tris、150mM NaCl、pH8.1)。
[0182]實(shí)施例4
[0183]附圖2/實(shí)施例3的分析操作
[0184]將吸入到毛細(xì)移液管的血液樣品(5-10 μ L)通過從E孔吸取160 μ L緩沖液到毛細(xì)移液管中來稀釋。然后將毛細(xì)移液管內(nèi)容物排出到C孔中。將E孔(或作為選擇，D孔)的85 μ L緩沖液使用毛細(xì)移液管轉(zhuǎn)移到A孔中。然后將盒在37°C孵育3分鐘。然后使用毛細(xì)移液管將D孔的40 μ L內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到C孔中。然后如實(shí)施例2中使用C孔的內(nèi)容物測定血細(xì)胞比容值。A孔的60 μ L內(nèi)容物使用毛細(xì)移液管轉(zhuǎn)移到C孔中，并將盒在37°C孵育I分鐘。將C孔的內(nèi)容物(任選的繼之以D和/或E孔的剩余內(nèi)容物)吸取到頂端有膜的的移液管中，如實(shí)施例2測量保留在膜外側(cè)的金膠體。如實(shí)施例2中的進(jìn)行校準(zhǔn)。
[0185]實(shí)施例5
[0186]附圖3的分析盒
[0187]A 孔
[0188]如實(shí)施例1。
[0189]B 孔
[0190]如實(shí)施例1。
[0191]C 孑L
[0192]這個孔含有20 μ g顆粒(與S-腺苷基-半胱氨酸綴合的I μ m膠乳顆粒)或160 μ g顆粒(與S-腺苷基-半胱氨酸綴合的2 μ m膠乳顆粒)，75 Ug硫柳汞，和750 μ g的TritonX-100。將這些組分的濃縮水溶液充填到該孔中，然后真空干燥。
[0193]D 孔
[0194]這個孔含有0.27 μ g腺苷、5單位重組SAH-水解酶和23 μ gTCEP:HCl。將這些組分的濃縮水溶液充填到該孔中，然后真空干燥。
[0195]E 孔
[0196]這個孔含有350 μ L 緩沖液(IOmM 磷酸鹽、150mM NaCl、pH7.4 或 25mM tris、150mMNaCl、pH8.1)。
[0197]實(shí)施例6
[0198]附圖3/實(shí)施例5的分析操作
[0199]將毛細(xì)移液管中的血液樣品(5到10 μ L)通過從E孔吸取175 μ L的緩沖液來稀釋，并排出到D孔中。然后使用毛細(xì)移液管將E孔的SOyL緩沖液轉(zhuǎn)移到A孔中。然后將盒在37°C孵育3分鐘。然后使用毛細(xì)移液管將D孔的75 μ L內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到C孔中。然后如實(shí)施例2使用C孔的內(nèi)容物測定血細(xì)胞比容值。然后用毛細(xì)移液管將A孔的50 μ L內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到C孔中。然后將盒在37°C孵育I分鐘。然后將C孔的內(nèi)容物(任選的繼之以E孔的內(nèi)容物)吸取到頂端有膜的的移液管中，然后如實(shí)施例2測量保留在膜外側(cè)的金膠體。如實(shí)施例2進(jìn)行校準(zhǔn)。
[0200]實(shí)施例7
[0201]附圖4的分析盒
[0202]A 孔
[0203]如實(shí)施例3。
[0204]B 孑L
[0205]如實(shí)施例1。
[0206]C 孔
[0207]這個孔的內(nèi)容物是60 μ L的水性組合物，含有4.5 μ g/ml腺苷、330 μ g/mL顆粒(與S-腺苷基-半胱氨酸綴合的Iym膠乳顆粒)或2.7mg/mL (與S-腺苷基-半胱氨酸綴合的2 μ m 膠乳顆粒)、80U/mL 重組 SAH-水解酶和 380 μ g/mL TCEP: HCl。
[0208]D 孑L
[0209]這個孔含有225 μ L 緩沖液(IOmM 磷酸鹽、150mM NaCl、pH7.4 或 25mM tris、150mMNaCl、pH8.1)，含有 0.4% 硫柳汞和 2%Triton X-1OO0
[0210]E 孔
[0211]這個孔含有285 μ L 緩沖液(IOmM 磷酸鹽、150mM NaCl、pH7.4 或者 25mM tris、150mM NaCl、pH8.1)。
[0212]實(shí)施例8
[0213]附圖4/實(shí)施例7的分析操作
[0214]將毛細(xì)移液管中的血液樣品(5到10 μ L)通過從E孔吸取100 μ L緩沖液來稀釋，并排出到C孔中。然后使用毛細(xì)移液管將E孔(或D孔)的85yL緩沖液轉(zhuǎn)移到A孔中。然后將盒在37°C孵育3分鐘。然后將D孔的40 μ L內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到C孔中，隨后如實(shí)施例2測量血細(xì)胞比容。然后使用毛細(xì)移液管將A孔的60 μ L內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到C孔中，并將盒在37°C孵育I分鐘。將C孔的內(nèi)容物(任選的繼之以D和/或E孔的內(nèi)容物)吸取到頂端有膜的的移液管中，然后如實(shí)施例2測量保留在膜外側(cè)的金膠體。如實(shí)施例2進(jìn)行校準(zhǔn)。
[0215]實(shí)施例9
[0216]附圖5的分析盒
[0217]A 孔
[0218]這個孔含有吸收性擦拭器(absorbent wiper) 15,當(dāng)它置于盒I中時(shí)用來從頂端為毛細(xì)管的移液管10的頂端除去任何過量的樣品。在移液管10的體內(nèi)裝有含珠子16和17的試劑。珠子16含有約5單位的rSAHase和65 μ gTCEP。珠子17含有約0.1單位的核酸酶(例如，來自Merck的Benzonase)和40 μ g MgCl2。兩種珠子還含有海藻糖作為粘合劑。
[0219]B 孔
[0220]這個孔如實(shí)施例1中描述的，但在移液管的體內(nèi)含有含珠子18的試劑，所述珠子18含有120 μ g N-乙基-馬來酰亞胺。
[0221]C 孔
[0222]這個孔含有兩種含試劑的珠子，19和20。珠子19含有大約100 μ g如實(shí)施例1中對A孔描述的金綴合物。珠子20含有0.12 μ g顆粒(如實(shí)施例1中對D孔描述的1-2 μ m的，優(yōu)選1.6 μ m的，與S-腺苷基-半胱氨酸綴合的膠乳顆粒)。
[0223]D 孔
[0224]這個孔含有含0.27μ g腺苷的200 μ L緩沖液(IOmM磷酸鹽、150mMNaCl、ρΗ7.4或者 25mM trisU50mM NaCl、pH8.1)。
[0225]E 孔
[0226]這個孔含有300 μ L的含0.4%wt.的SDS的D孔的緩沖液。
[0227]實(shí)施例10
[0228]附圖5/實(shí)施例9的分析操作
[0229]將A孔中所示毛細(xì)管中的4.5 μ L血液樣品(3到10 μ L)與D孔中的200 μ L緩沖液(125-300 μ L)吸入到頂端為毛細(xì)管的移液管中來溶解珠子16和17。內(nèi)容物沖洗回D孔中，在37°C孵育I分鐘(多至3分鐘)。
[0230]在孵育期間，E孔的200 μ L洗滌劑溶液(125-300 μ L)吸入到頂端有膜的的移液管中來溶解珠子18。然后將內(nèi)容物沖洗回E孔。
[0231]然后使用頂端為毛細(xì)管的移液管將100 μ L的洗滌劑和抑制劑溶液(25-200 μ L)從E孔轉(zhuǎn)移到D孔中。在紅細(xì)胞裂解之后，如實(shí)施例2測定D孔中的血細(xì)胞比容。
[0232]然后使用頂端為毛細(xì)管的移液管將D孔中的200 μ L混合物(150-275 μ L)從D孔轉(zhuǎn)移到C孔中，使珠子19和20溶解，并將混合物孵育I分鐘(多至3分鐘)。
[0233]然后將C孔的總內(nèi)容物吸到頂端有膜的的移液管中，任選的繼之以E孔中的剩余緩沖液。然后使用綠色或藍(lán)色二極管光照以反射方式檢測保留在膜外側(cè)的金膠體(相應(yīng)于在第二次孵育形成的金/膠乳綴合物)。
[0234]使用已知的HCy含量的標(biāo)準(zhǔn)物校準(zhǔn)分析，同樣地相對標(biāo)準(zhǔn)物例如，離心的、對一系列血液樣品測定的血細(xì)胞比容來校準(zhǔn)血細(xì)胞比容測定。
[0235]括號中的體積或數(shù)量范圍是轉(zhuǎn)移的數(shù)量的任選的限制。然而對于精確的分析操作和校準(zhǔn)，應(yīng)使用這些范圍內(nèi)的預(yù)定的值。
[0236]實(shí)施例11
[0237]附圖6的分析盒
[0238]A 孑L
[0239]這與實(shí)施例9中描述的一樣但省略了珠子17。
[0240]B 孑L
[0241]這與實(shí)施例9中描述的一樣。
[0242]C 孔
[0243]這與實(shí)施例9中描述的一樣。
[0244]D 孑L
[0245]這與實(shí)施例9中描述的一樣，但含有0.1單位的核酸酶(如實(shí)施例9中對A孔描述的)和 40 μ g MgCl2。
[0246]E 孔
[0247]這與實(shí)施例9中描述的一樣。
[0248]實(shí)施例12
[0249]附圖6/實(shí)施例11的分析操作
[0250]該分析的步驟如實(shí)施例10中描述進(jìn)行。
[0251]實(shí)施例13
[0252]附圖7的分析盒
[0253]A 孔
[0254]其中的頂端為毛細(xì)管的移液管和珠子(16)與實(shí)施例11中描述的一樣。這個孔的底部含有插入物(如實(shí)施例1中描述的)，所述插入物含有干燥的抑制劑組合物，所述組合物含80-200 μ g，例如120 μ g的N-乙基-馬來酰亞胺。
[0255]B 孔
[0256]這與實(shí)施例1中描述的一樣。
[0257]C 孔
[0258]這與實(shí)施例9中描述的一樣。
[0259]D 孔
[0260]這與實(shí)施例11中描述的一樣。
[0261]E 孔[0262]這與實(shí)施例9中描述的一樣。
[0263]實(shí)施例14
[0264]附圖7/實(shí)施例13的分析操作
[0265]將樣品和酶和還原劑轉(zhuǎn)移到D孔，并如實(shí)施例10在其中孵育。
[0266]在該孵育期間，使用頂端為毛細(xì)管的移液管將50μ L洗滌劑溶液(40_100μ L)從E孔轉(zhuǎn)移到A孔中。然后將該混合物轉(zhuǎn)移回E孔。
[0267]然后如實(shí)施例10中將洗滌劑和抑制劑轉(zhuǎn)移到D孔中，如實(shí)施例10繼續(xù)進(jìn)行分析。
[0268]實(shí)施例15
[0269]試劑珠子
[0270]實(shí)施例9到14中使用的珠子如下制備:
[0271]將25mM Tris緩沖液和150mM NaCl (pH7.5)中的試劑、海藻糖、聚乙二醇(PEG)、牛血清白蛋白(BSA)的水溶液使用移液管滴加到冷的(〈_50°C)金屬板上。冷凍的液滴被冷凍干燥來產(chǎn)生含有15%wt.海藻糖、0.5%wt.PEG和0.l%wt.BSA的珠子。液滴大小方便地是5到100 μ L，優(yōu)選10-50 μ L0做為選擇，溶液可以滴加到液氮中，此后收集冷凍的液滴并凍干。
【權(quán)利要求】
1.高半胱氨酸-轉(zhuǎn)化酶在制備用于分析采自人類或形成血管的非人動物受試者的全血樣品中血漿高半胱氨酸的試劑盒中的用途，所述分析包括:用以下試劑接觸來自所述受試者的全血樣品一液體稀釋劑、還原劑、高半胱氨酸-轉(zhuǎn)化酶、所述酶的高半胱氨酸轉(zhuǎn)化反應(yīng)的抑制劑、細(xì)胞裂解劑、能夠與所述高半胱氨酸轉(zhuǎn)化酶的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)合的顏色標(biāo)記的結(jié)合劑，和能夠與所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物競爭與所述結(jié)合劑結(jié)合的顆粒；在用所述試劑接觸后，抽吸所述樣品通過具有多孔性的膜，所述多孔性足以使所述結(jié)合劑在其未結(jié)合狀態(tài)時(shí)和當(dāng)與所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)合時(shí)通過，但不足以使與所述顆粒結(jié)合時(shí)的所述結(jié)合劑從此通過；檢測保持在所述膜上的所述結(jié)合劑的顏色標(biāo)記；通過應(yīng)用取決于所述全血樣品中紅細(xì)胞濃度的校正因子，由此確定血漿高半胱氨酸濃度的指標(biāo)；其中與所述試劑接觸在如下情況下是相繼的或同時(shí)的: i)在與所述稀釋劑、酶和還原劑接觸后發(fā)生與所述裂解劑的接觸； ii)當(dāng)抑制劑存在時(shí)，與抑制劑的接觸發(fā)生在與所述稀釋劑、酶和還原劑接觸之后，但不晚于與所述裂解劑的接觸；以及 iii)與所述結(jié)合劑和所述顆粒的接觸不包括與含有所述結(jié)合劑和所述顆粒的液體接觸。
2.如權(quán)利要求1所要求的用途，其中，所述血漿高半胱氨酸濃度表示為可視的或電子的信號。
3.如權(quán)利要求1或2 所要求的用途，其中，在抽吸所述樣品通過所述膜之前，將所述樣品中的DNA片斷化。
4.如權(quán)利要求1至3的任一項(xiàng)所要求的用途，其中所述試劑的至少一種以珠子形式提供。
5.權(quán)利要求1到4的任一項(xiàng)所要求的用途，其中所述顏色標(biāo)記的結(jié)合劑是金屬-珠子-標(biāo)記的結(jié)合劑。
6.用于使用全血進(jìn)行血漿高半胱氨酸分析的單次使用的盒，所述盒具有多孔的底座、可移動的頂端為毛細(xì)管的移液管和蓋子，所述蓋子帶有頂端有膜的移液管，以及所述底座的孔含有以下的分析試劑:液體稀釋劑；還原劑；高半胱氨酸轉(zhuǎn)化酶；所述酶的高半胱氨酸轉(zhuǎn)化反應(yīng)的抑制劑；細(xì)胞裂解劑；能與所述酶的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)合的、顏色標(biāo)記的結(jié)合劑；以及能與所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物競爭與所述結(jié)合劑結(jié)合的顆粒；所述結(jié)合劑和所述顆粒處在不同的所述孔中；當(dāng)抑制劑存在時(shí)，所述抑制劑和所述酶存在于不同的所述孔中；所述裂解劑存在于孔中，該孔不同于含有所述酶和至少部分的所述還原劑和所述稀釋劑的一個孔或多個孔。
7.如權(quán)利要求6所要求的盒，在所述底座中具有以線性排列的至少五個孔。
8.如權(quán)利要求6和7的任一項(xiàng)所要求的盒，在所述底座中的至少一個孔中具有至少一種含試劑的珠子。
9.如權(quán)利要求8所要求的盒，在至少一個所述移液管內(nèi)具有至少一種所述珠子。
10.如權(quán)利要求6到9的任一項(xiàng)所要求的盒，在所述底座的至少一個所述孔中含有核酸酶。
11.一種分析在血漿中和在血細(xì)胞中存在的被分析物的方法，所述方法包括(a)測定所述被分析物在全血樣品的血漿中的含量，(b)分光光度測定所述樣品的血細(xì)胞比容或血紅蛋白含量，以及(C)由此測定所述被分析物的血漿濃度。
12.如權(quán)利要求11所要求的方法，其中測定所述被分析物的含量包括使全血樣品的血漿中的被分析物反應(yīng)來產(chǎn)生可檢測的物質(zhì)，而所述樣品中的細(xì)胞是完整的，在細(xì)胞內(nèi)被分析物不會反應(yīng)來形成所述可檢測的物質(zhì)的條件下裂解所述細(xì)胞并檢測所述可檢測的物質(zhì)。
13.一種用于診斷分析的單次使用的盒，包含具有多個孔的盒體，所述孔的至少一個含有用于所述分析的操作的試劑，其特征在于至少一個孔含有珠子，所述珠子在溶劑中釋放至少一種所述試劑。
14.如權(quán)利要求13所要求的盒，其中所述珠子是包被或灌注了干燥的試劑的水不溶性珠子或者包含試劑和惰性粘合劑的水溶性珠子。
15.一種顏色標(biāo)記的方法，其中使用聚簇的膠態(tài)金來標(biāo)記顏色，上述膠態(tài)金具有約100到200nm的聚簇的模式顆 粒大小。
【文檔編號】B01L3/02GK103675259SQ201310475731
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2006年2月23日 優(yōu)先權(quán)日:2005年2月24日
【發(fā)明者】弗蘭克.弗朗策恩, 阿恩.L.法倫, 阿恩.K.諾德海 申請人:阿克西斯-希爾德公司