亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

熒光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體的方法

文檔序號(hào):4922035閱讀:874來源:國知局
熒光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】,公開一種熒光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體的方法,具體為:氨基修飾的熒光微球與活潑酯化的生物素偶聯(lián),將鏈霉親和素與上述偶聯(lián)物以1000:1的比例混合反應(yīng)后,得到熒光微球與生物素-鏈霉親和素的偶聯(lián)物,最后將生物素化的萊克多巴胺單克隆抗體加入到熒光微球-生物素-鏈霉親和素的偶聯(lián)物溶液中反應(yīng)即可得到目標(biāo)產(chǎn)物。本發(fā)明得到的熒光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體的新型偶聯(lián)物能有效應(yīng)用于萊克多巴胺熒光微球試紙條中,相應(yīng)地提高了試紙條的特異性、靈敏度,從而能快速準(zhǔn)確地定性且定量檢測動(dòng)物性食品中萊克多巴胺的殘留量。
【專利說明】熒光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品安全中β2-受體激動(dòng)劑殘留檢測領(lǐng)域,具體涉及一種用熒光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體的偶聯(lián)物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來,很多不法商家將萊克多巴胺作為鹽酸克倫特羅的替代品添加于動(dòng)物飼料中,當(dāng)長期用于飼喂動(dòng)物時(shí),萊克多巴胺和鹽酸克倫特羅一樣對(duì)動(dòng)物有營養(yǎng)再分配的作用,促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)沉積而抑制脂肪形成,從而顯著提高動(dòng)物胴體的瘦肉率。但萊克多巴胺在體內(nèi)代謝緩慢、易聚積、藥物殘留率高,當(dāng)人類食用殘留該類藥物的動(dòng)物性食品后會(huì)產(chǎn)生中毒從而對(duì)人體健康產(chǎn)生相當(dāng)?shù)奈:Γǔ1憩F(xiàn)為肌肉震顫、心悸、發(fā)燒、惡心嘔吐等,嚴(yán)重的會(huì)昏迷甚至死亡。因此,許多國家已經(jīng)禁止在動(dòng)物飼料中添加β2_興奮劑,但是關(guān)于β2_興奮劑的食品安全事件時(shí)有發(fā)生。我國國家農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告規(guī)定鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和西馬特羅的最低標(biāo)準(zhǔn)為3ng/mL。
[0003]免疫層析技術(shù)由于具有快速、準(zhǔn)確、方便的優(yōu)點(diǎn),在鹽酸克倫特羅及其替代物的檢測應(yīng)用上已得到很大的推廣,它是以抗原抗體間的特異性反應(yīng)為基礎(chǔ),通過標(biāo)記物對(duì)某種物質(zhì)進(jìn)行定性或定量檢測的研究手段。目前,常用于免疫層析技術(shù)檢測鹽酸萊克多巴胺的標(biāo)記物有膠體金、熒光微球等,這些標(biāo)記物保持了萊克多巴胺單克隆抗體的活性,而標(biāo)記物的活性不受影響,當(dāng)它與相應(yīng)抗原反應(yīng)后,可以直接測定復(fù)合物中的標(biāo)記物,直接對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定性甚至定量分析。
[0004]目前,標(biāo)記物與抗體之間大多是通過共價(jià)鍵或物理吸附的方式直接偶聯(lián),特別是β -受體激動(dòng)劑抗體的標(biāo)記。該種偶聯(lián)方式有偶聯(lián)時(shí)間短、操作簡單的優(yōu)點(diǎn),但這種偶聯(lián)方式,由于抗體任意與標(biāo)記物結(jié)合使一些抗原結(jié)合位點(diǎn)被屏蔽,即所謂的空間位阻,導(dǎo)致抗體標(biāo)記效率和標(biāo)記物的分散性降低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷,提供熒光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體的方法,該方法減少了抗體與熒光微球相連的空間位阻,提高了標(biāo)記效率高,制得的偶聯(lián)物能表現(xiàn)出良好的膠體穩(wěn)定性和結(jié)合性能。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
熒光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體的方法:(I)氨基修飾的熒光微球與活潑酯化的生物素在PBS溶液中偶聯(lián)反應(yīng)2 h得到熒光微球-生物素偶聯(lián)物,再離心、洗滌除去未結(jié)合的生物素;(2)將鏈霉親和素與熒光微球-生物素偶聯(lián)物混合輕搖反應(yīng)2 h后,離心、用PBS溶液洗滌移除未偶聯(lián)的鏈霉親和素,得到熒光微球-生物素-鏈霉親和素偶聯(lián)物;(3)將生物素化的萊克多巴胺單克隆抗體加入到熒光微球-生物素-鏈霉親和素的偶聯(lián)物溶液中輕搖反應(yīng)I h后,洗滌、離心以除去未偶聯(lián)上的生物素化萊克多巴胺單克隆抗體,即得到熒光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體即熒光微球-生物素-鏈霉親和素-生物素化萊克多巴胺單克隆抗體;所述活潑酯化的生物素為將生物素-PEG5_復(fù)合物溶于DMF溶液中,加入二環(huán)己基碳亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24 h,然后離心棄沉淀,得到活潑酯化的生物素;所述氨基修飾的突光微球的制備方法:10 mg突光微球洗凈后超聲溶解于I mL蒸餾水中,加入20 μ L冰乙酸和20 μ L(3-三甲氧基硅丙基)-二乙基乙二胺超聲溶解后,磁力攪拌3?4 h,用10 mM pH5.5的MES緩沖液洗滌并重懸;所述熒光微球粒徑為175 nm。
[0007]所述生物素化萊克多巴胺單克隆抗體的的制備方法:用I mL DMSO溶液溶解生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯NHSB配制成濃度為I mg/mL的溶液,取120 μ L加入到ImL萊克多巴胺單克隆抗體溶液中,在室溫下持續(xù)攪拌,保溫21 h;然后加入9.6 UL I mol/L的NH4Cl溶液在室溫下攪拌10 min,用PBS溶液在4°C下充分透析除去游離的生物素;將透析完后的樣品上I ml的分子篩柱,以PBS溶液緩慢洗脫,抗體在f 3 ml之間洗下,再在收集到的目標(biāo)產(chǎn)物中加入疊氮鈉及1.0 g/L的BSA溶液,在4 °C下避光保存?zhèn)溆谩?br> [0008]所述鏈霉親和素與熒光微球-生物素偶聯(lián)物混合反應(yīng)的投料摩爾比為1000:1。
[0009]所述熒光微球標(biāo)記生物素化萊克多巴胺單克隆抗體與熒光微球-生物素-鏈霉親和素的偶聯(lián)物的投料摩爾比為1:1000。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:
1、標(biāo)記效率高:與傳統(tǒng)的熒光微球直接偶聯(lián)抗體相比,生物素-鏈霉親和素作為偶聯(lián)臂使熒光微球與萊克多巴胺單克隆抗體之間結(jié)合的空間位阻效應(yīng)減小,而且一個(gè)熒光微球-PEG5_-生物素-鏈霉親和素能與生物素化抗體1:4的偶聯(lián),從而使標(biāo)記效率得到了相應(yīng)地提聞。
[0011]2、分散性和可溶性好:與熒光微球結(jié)合的生物素是用親水性的PEG5_修飾的復(fù)合物,親水性的peg5_的嵌入提高了熒光微球-抗體偶聯(lián)物的在復(fù)溶液中的可溶性,而且因?yàn)檩^長的偶聯(lián)臂,偶聯(lián)物能很好的分散在溶液中,基本不會(huì)發(fā)生絮凝沉淀,表現(xiàn)出良好的膠體穩(wěn)定性。
[0012]3、結(jié)合性強(qiáng):PEG5_-生物素-鏈霉親和素偶聯(lián)臂與萊克多巴胺單克隆抗體上的生物素結(jié)合后,保證了熒光微球表面的抗體結(jié)合位點(diǎn)定向分布,增強(qiáng)了熒光微球-萊克多巴胺單克隆抗體偶聯(lián)物與目標(biāo)被檢物質(zhì)的結(jié)合性能,這點(diǎn)主要體現(xiàn)在提高的熒光微球試紙條的靈敏度和穩(wěn)定性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解:
圖1本發(fā)明制得的熒光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體。
【具體實(shí)施方式】
[0014]本實(shí)施例給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程,但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0015]生物素-PEG5_復(fù)合物購于上海炎怡生物有限公司;
熒光微球購于德國Merck公司,粒徑為175 nm。
[0016]實(shí)施例1:本發(fā)明中熒光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體的新型偶聯(lián)物的制備方法
I)氨基修飾的熒光微球的制備方法
10 mg熒光微球洗凈后超聲溶解于I mL蒸餾水中,加入20 μ L冰乙酸和20 μ L (3-三甲氧基硅丙基)-二乙基乙二胺超聲溶解后,磁力攪拌3?4 h,用10 mM的MES緩沖液(pH5.5)洗漆并重懸。
[0017]2)活潑酯化的生物素的制備方法
準(zhǔn)確稱取4.5 mg生物素-PEG5qqq復(fù)合物溶于2 mL的DMF溶液中,加入20.5 mg 二環(huán)己基碳亞胺和10.5 mg N-輕基琥拍酰亞胺后,室溫磁力攪拌反應(yīng)24 h,然后以4000 rpm離心5 min,棄沉淀,得到活潑酯化的生物素,備用。
[0018]3)熒光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體的方法,其特征在于:所述生物素化萊克多巴胺單克隆抗體的的制備方法:用I mL DMSO溶液溶解生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHSB)配制成濃度為I mg/mL的溶液,取120 μ L加入到ImL濃度為1.9 mg/mL的萊克多巴胺單克隆抗體溶液中,在室溫下持續(xù)攬祥,保溫2 4h ;然后加入9.6 μ L的NH4Cl (I mol/L)溶液在室溫下攪拌10 min,用PBS溶液在4 °C下充分透析除去游離的生物素;將透析完后的樣品上I ml的分子篩柱,以PBS溶液緩慢洗脫,抗體在f 3 ml之間洗下,再在收集到的目標(biāo)產(chǎn)物中加入疊氮鈉及1.0 g/L的BSA溶液,在4 °C下避光保存?zhèn)溆谩?br> [0019]4)以5 mL體系標(biāo)記35 yg/mg (抗體/微球)的免疫微球,具體方法:2.0 mg氨基修飾的熒光微球與3.5 mg活潑酯化的生物素在5 mL的PBS溶液(pH 7.4左右)中偶聯(lián)反應(yīng)2 h,再離心、洗滌除去未結(jié)合的生物素,得到熒光微球-生物素偶聯(lián)物;將上述制得的熒光微球-生物素偶聯(lián)物加入到10 mg/mL鏈霉親和素溶液中,所述鏈霉親和素與熒光微球-生物素偶聯(lián)物混合反應(yīng)的投料摩爾比為1000:1,保證終體積為5 mL,輕搖反應(yīng)2 h后,離心、用PBS緩沖溶液洗滌移除未偶聯(lián)的鏈霉親和素,得到熒光微球-生物素-鏈霉親和素偶聯(lián)物;再將相應(yīng)標(biāo)記量的生物素化的萊克多巴胺單克隆抗體(稀釋10倍并緩慢加入)加入到上述偶聯(lián)物溶液至終濃度為35 yg/mg,輕搖反應(yīng)I h后,洗滌、離心以除去未偶聯(lián)上的生物素化抗體,即得到熒光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體的新型偶聯(lián)物,用500 μ L復(fù)溶液復(fù)溶。
[0020]上述制得的新型偶聯(lián)物與傳統(tǒng)的熒光微球-抗體偶聯(lián)物相比,在電鏡下觀察分散性明顯更好,在4 °C條件下放置6個(gè)月后,仍很透明,不會(huì)發(fā)生絮凝沉淀現(xiàn)象,表現(xiàn)出良好的膠體穩(wěn)定性。其較強(qiáng)的結(jié)合能力則通過下面實(shí)施例中的熒光微球試紙條靈敏度提高得到體現(xiàn)。
[0021]實(shí)施例2:熒光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體的新型偶聯(lián)物在熒光微球試紙條上的應(yīng)用
I)熒光微球免疫層析試紙條的制備
熒光微球墊的制備:用0.01 M的PNPB (其中包含5%蔗糖和0.05% Tween-20)復(fù)溶實(shí)施例I制得的偶聯(lián)物至起始體積后,用BIODOT Dispensing System,按照4 μ L/cm的量噴涂至玻璃纖維膜上,25 °C真空干燥I?2 h,放于干燥環(huán)境備用。
[0022]萊克多巴胺-BSA偶聯(lián)物和驢抗鼠二抗包被到NC膜上:分別用0.01 M的PBS緩沖液調(diào)節(jié)包被物濃度為0.4 mg/mL和0.4 mg/mL,噴膜量為0.74 μ L/cm,檢測線包被萊克多巴胺-BSA偶聯(lián)物,質(zhì)控線包被驢抗鼠二抗,兩區(qū)位置相隔6 mm,質(zhì)控線距NC膜頂端10 mm,檢測線距NC膜底端9 mm, 37°C烘干處理過夜后,于室溫干燥的環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?br> [0023]熒光微球免疫層析試紙條的制備:在底板上依次搭連地粘貼濾紙、樣本墊、熒光微球墊、NC膜和吸水紙,粘貼好的試紙條板用切割機(jī)裁切成試紙條,并組裝到準(zhǔn)備好的試紙條盒中,裝入鋁箔袋,加入干燥劑后,封口保存,于室溫干燥的環(huán)境下至少可保存一年。
[0024]2)熒光微球試紙條定量檢測豬肉中的萊克多巴胺
樣品前處理:取2.5 g豬肉樣品于50 mL離心管中,加入5 mL蒸餾水在沸水中加熱提取15 min,取出全部上清于新的10 mL離心管中,加入I mL正已烷輕搖后靜置I min,移除上面脂肪層,下層清液備用。
[0025]檢測步驟:(1)把陰性樣本和添加系列濃度(0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、15 ng/mL)的樣本提取液加入試紙條樣本孔中,反應(yīng)10 min后,將檢測試紙條放入熒光微球讀取儀檢測窗口 ;
(2)熒光微球在LED燈源激發(fā)下,發(fā)出強(qiáng)烈的熒光;
(3)發(fā)射的熒光經(jīng)C⑶掃描系統(tǒng)匯聚后,經(jīng)過光電聚集管,送入光電倍增管,光信號(hào)得到增強(qiáng),在經(jīng)過信號(hào)轉(zhuǎn)換元件,經(jīng)過軟件處理后,熒光的強(qiáng)弱以數(shù)值的高低輸入出來;
(4)實(shí)驗(yàn)過程中,以系列濃度測出其對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度的數(shù)值,從而根據(jù)這一系列數(shù)值和萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)濃度建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后根據(jù)檢測樣本的輸出數(shù)值,計(jì)算出檢測樣本中萊克多巴胺的含量;
(5)吸取100μ L提取液,進(jìn)行檢測,最后根據(jù)檢測樣本的數(shù)據(jù)輸出的數(shù)值分別為
1.95,查標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得出檢測樣本中萊克多巴胺的殘留量0.25 ng/mL。
[0026]實(shí)施例3:用熒光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體的新型偶聯(lián)物制備的熒光微球試紙條上檢測豬肝中的萊克多巴胺殘留量
樣品前處理方法、試紙條制作同實(shí)施例2。
[0027]定性、定量檢測方法同實(shí)施例2,以添加系列濃度(0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、15 ng/mL)和對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取100 μ L提取液加入樣本孔中,10 min后用讀取儀進(jìn)行檢測,根據(jù)檢測樣本的數(shù)據(jù)輸出的數(shù)值分別為2.80,查標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得出檢測樣本中萊克多巴胺的殘留量為O。
[0028]實(shí)施例4:用熒光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體的新型偶聯(lián)物制備的熒光微球試紙條上檢測飼料中的萊克多巴胺殘留量
樣品前處理:稱取0.5 g飼料樣品,加入I mL樣品提取液(pH7.0 50 mmol/LTris-HCl),在試管中攪拌I min,靜置10 min后,取上層清液作待測樣品。
[0029]試紙條制作同實(shí)施例2。
[0030]定性、定量檢測方法同實(shí)施例2,以添加系列濃度(0.1,0.5、1、2、2.5、3、5、7、10、15ng/mL)和對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取100 μ L提取液加入樣本孔中,10 min后用讀取儀進(jìn)行檢測,根據(jù)檢測樣本的數(shù)據(jù)輸出的數(shù)值分別為1.43,查標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得出檢測樣本中萊克多巴胺的殘留量0.8 ng /mL。
[0031]實(shí)施例5:用熒光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體的新型偶聯(lián)物制備的熒光微球試紙條上檢測豬尿中的萊克多巴胺殘留量
尿樣可直接進(jìn)行檢測,不需前處理。定性、定量檢測方法同實(shí)施例2,以添加系列濃度(0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、5、7、10 ng/mL)和對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取100μ L尿樣加入樣本孔中,10 min后用讀取儀進(jìn)行檢測,根據(jù)檢測樣本的數(shù)據(jù)輸出的數(shù)值分別為1.55,查標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得出檢測樣本中萊克多巴胺的殘留量為0.57 ng /mL。
【權(quán)利要求】
1.突光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體的方法,其特征在于:(I)氨基修飾的突光微球與活潑酯化的生物素在PBS溶液中偶聯(lián)反應(yīng)2 h得到熒光微球-生物素偶聯(lián)物,再離心、洗滌除去未結(jié)合的生物素;(2)將鏈霉親和素與熒光微球-生物素偶聯(lián)物混合輕搖反應(yīng)2 h后,離心、用PBS溶液洗滌移除未偶聯(lián)的鏈霉親和素,得到熒光微球-生物素-鏈霉親和素偶聯(lián)物;(3)將生物素化的萊克多巴胺單克隆抗體加入到熒光微球-生物素-鏈霉親和素的偶聯(lián)物溶液中輕搖反應(yīng)I h后,洗滌、離心以除去未偶聯(lián)上的生物素化萊克多巴胺單克隆抗體,即得到熒光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體即熒光微球-生物素-鏈霉親和素-生物素化萊克多巴胺單克隆抗體;所述活潑酯化的生物素為將生物素-peg5_復(fù)合物溶于DMF溶液中,加入二環(huán)己基碳亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24 h,然后離心棄沉淀,得到活潑酯化的生物素;所述氨基修飾的熒光微球的制備方法:10 mg熒光微球洗凈后超聲溶解于I mL蒸餾水中,加入20 yL冰乙酸和20 μ L(3_三甲氧基硅丙基)-二乙基乙二胺超聲溶解后,磁力攪拌3?4 h,用10 mM pH5.5的MES緩沖液洗滌并重懸;所述熒光微球粒徑為175 nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體的方法,其特征在于:所述生物素化萊克多巴胺單克隆抗體的的制備方法:用I mL DMSO溶液溶解生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯NHSB配制成濃度為I mg/mL的溶液,取120 μ L加入到ImL濃度為1.9 mg/mL的萊克多巴胺單克隆抗體溶液中,在室溫下持續(xù)攪拌,保溫2?4 h;然后加入9.6 UL Imo I/L的NH4Cl溶液在室溫下攪拌10 min,用PBS溶液在4°C下充分透析除去游離的生物素;將透析完后的樣品上I ml的分子篩柱,以PBS溶液緩慢洗脫,抗體在廣3 ml之間洗下,再在收集到的目標(biāo)產(chǎn)物中加入疊氮鈉及1.0 g/L的BSA溶液,在4 °C下避光保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體的方法,其特征在于:所述鏈霉親和素與熒光微球-生物素偶聯(lián)物混合反應(yīng)的投料摩爾比為1000:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光微球標(biāo)記萊克多巴胺單克隆抗體的方法,其特征在于:所述熒光微球標(biāo)記生物素化萊克多巴胺單克隆抗體與熒光微球-生物素-鏈霉親和素的偶聯(lián)物的投料摩爾比為1:1000。
【文檔編號(hào)】B01J13/02GK103439490SQ201310348847
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月12日
【發(fā)明者】賴衛(wèi)華, 彭濤 申請人:南昌大學(xué)
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1