專利名稱：一種無動(dòng)力源無閥型單分子檢測芯片及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域檢測裝置，涉及一種用于核酸擴(kuò)增的微流控芯片裝置及其應(yīng)用技術(shù)。
背景技術(shù)：
癌癥、心腦血管疾病、傳染病等重大疾病每年奪去我國數(shù)以百萬計(jì)人的性命。據(jù)衛(wèi)生部2010年公布，我國每年癌癥病人660萬，死亡人數(shù)達(dá)180萬。每年用于癌癥病人的醫(yī)療費(fèi)用高達(dá)上千億元人民幣。隨著人口的老齡化，預(yù)計(jì)到2020年，癌癥新發(fā)病例將達(dá)到300萬，死亡300萬。癌癥已成為我國沉重的疾病負(fù)擔(dān)，加強(qiáng)癌癥的預(yù)防和早診早治新方法和新技術(shù)的研究非常重要。目前，全球正面臨著從醫(yī)療醫(yī)學(xué)向預(yù)防醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)變的醫(yī)療模式的轉(zhuǎn)換，我國更要求醫(yī)療工作的重心要轉(zhuǎn)移到廣大基層群眾中去，同時(shí)要逐漸以健康管理替代昂貴的“診斷和治療系統(tǒng)”并使其成為疾病防控的主流。疾病的發(fā)生一般都要經(jīng)歷從分子變異、到細(xì)胞病變、再到組織壞死的過程，如果能夠早期在分子水平上發(fā)現(xiàn)已經(jīng)發(fā)生的病變，則大多數(shù)情況下都將可以找到救治辦法，使患者康復(fù)，或者延長其生存期。核酸分子準(zhǔn)確檢測十分重要。目前常規(guī)的分子診斷手段是將靶核酸直接擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。主要包括聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Ligase Chain Reaction, LCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermalamplification, LAMP)等。這些方法具有較高的靈敏度,而且應(yīng)用廣泛。業(yè)已證明，核酸擴(kuò)增技術(shù)可用于除外傷和營養(yǎng)缺乏癥外的所有疾病的診斷。常規(guī)核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)是使用小試管、孔板等進(jìn)行的，操作工作量很大，加樣環(huán)節(jié)多，易發(fā)生雜質(zhì)污染。此外，傳統(tǒng)PCR需要進(jìn)行開蓋檢測，產(chǎn)生的氣溶膠污染，使得假陽性率很高(3(Γ40%)。因此，常規(guī)核酸擴(kuò)增進(jìn)一步的發(fā)展方向是不開蓋的技術(shù)，即把樣品核酸進(jìn)樣、擴(kuò)增及檢測都在封閉的體系中進(jìn)行。微流控芯片技術(shù)為這一設(shè)想提供了可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種無需外接驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)、無需閥門、制作工藝簡便并且易于操作的用于核酸單分子擴(kuò)增的微流控芯片裝置。該裝置由反應(yīng)層、修飾層、封接層、主通道、反應(yīng)小室、進(jìn)樣口、出樣口和耐熱膠帶構(gòu)成，反應(yīng)層由主通道串聯(lián)反應(yīng)小室組成，反應(yīng)小室位于主通道上方或下方，進(jìn)樣口、出樣口位于主通道兩端，修飾層先與封接層連接，反應(yīng)層通過修飾層與封接層封接后組成微流控芯片組件，耐熱膠帶粘貼于反應(yīng)層的上表面。主通道及其上的反應(yīng)小室的大小可以根據(jù)需要來決定，主通道的寬度從100 nm至5 mm不等；主通道的深度范圍在100 nm至I mm之間；反應(yīng)小室的體積為微升(ml)到皮升(pi)級別。反應(yīng)小室的位置可以根據(jù)所采用的油相液體的性質(zhì)不同來制作位于主通道上方的反應(yīng)小室或位于主通道下方的反應(yīng)小室。反應(yīng)層的制作材料選用具有透氣性質(zhì)的聚合物材料，優(yōu)選的材料為聚二甲基硅氧烷(PD MS)。反應(yīng)層的制作方法根據(jù)不同的透氣性聚合物材料的性質(zhì)采用不同的方法，比如激光刻蝕、化學(xué)刻蝕、光刻、熱壓、澆鑄及注塑等方法。當(dāng)優(yōu)選材料為聚二甲基硅氧烷(PDMS)時(shí)，以采用多層軟光刻技術(shù)制作的具有微通道結(jié)構(gòu)的基板為模具，在模具上澆注固化形成。封接層的材料根據(jù)反應(yīng)小室相對主通道的位置的不同選用不同的材料。若反應(yīng)小室位于主通道上方，則選用導(dǎo)熱性好的薄質(zhì)材料作為基底，優(yōu)選薄質(zhì)玻璃和單晶硅片。若反應(yīng)小室位于主通道下方，則選用透明膠帶、PET膜或氟膜等。反應(yīng)小室位于主通道上方時(shí)，封接層與反應(yīng)層I封接前，預(yù)先在基底上鋪展與反應(yīng)層材料相同的具有透氣性質(zhì)的聚合物薄膜作為修飾層。預(yù)先在基底上鋪展的與反應(yīng)層相同材料的具有透氣性質(zhì)的聚合物薄膜修飾層可采用勻膠機(jī)旋轉(zhuǎn)涂覆形成。勻膠機(jī)甩膠的轉(zhuǎn)速、時(shí)間可根據(jù)所需要的不同的聚合物薄膜修飾層的厚度來選擇。獲得的具有透氣性質(zhì)的聚合物薄膜的修飾層厚度約為10-50 μπι。作為封接層的基底上鋪展與反應(yīng)層相同材料的具有透氣性質(zhì)的聚合物薄膜修飾層之前，基底預(yù)先采用空氣等離子體處理。反應(yīng)層與封接層進(jìn)行封接，封接方法可以利用具有透氣性質(zhì)的聚合物固有的化學(xué)性質(zhì)而以化學(xué)方法粘合在一起。反應(yīng)層和修飾層選用相同的聚合物材料，可采用均相粘合，其中，兩層具有相同的化學(xué)性質(zhì)，一層中相同的化學(xué)個(gè)體與另一層中相同的化學(xué)個(gè)體反應(yīng)，反應(yīng)層和修飾層的聚合物以將這兩層粘合在一起，各層的聚合物鏈之間的連接可以由交聯(lián)劑的活化產(chǎn)生。反應(yīng)小室位于主通道下方時(shí)，封接層與反應(yīng)層I封合前，二者分別用空氣等離子體進(jìn)行處理。與水不相容的油相液體根據(jù)反應(yīng)小室與主通道的相對位置可以選用氟化油、石蠟油或硅油等。芯片使用時(shí)，樣品溶液的進(jìn)樣無需外接驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)，而是利用具有透氣性質(zhì)的聚合物本身的透氣性質(zhì)，預(yù)先將聚合物芯片置于真空泵中，進(jìn)行抽真空除氣處理，然后置于常壓環(huán)境下，由于主通道和反應(yīng)小室的氣體優(yōu)先再溶入經(jīng)過脫氣處理的聚合物塊體，從而使主通道及反應(yīng)小室與外界形成氣壓差，主通道和反應(yīng)小室處于負(fù)壓狀態(tài)，進(jìn)樣口處的樣品溶液利用此氣壓差自動(dòng)分配進(jìn)入各個(gè)反應(yīng)小室，實(shí)現(xiàn)樣品的無動(dòng)力源進(jìn)樣，待串聯(lián)的反應(yīng)小室完全均勻充滿樣品溶液后，向進(jìn)樣口內(nèi)加入與水不相容的油相液體，同樣利用氣壓差使與水不相容的油相液體將主通道中的樣品溶液沖入后續(xù)的反應(yīng)小室，直至樣品進(jìn)入所有的反應(yīng)小室，從而將反應(yīng)樣品封入反應(yīng)小室內(nèi)，使其在反應(yīng)過程中彼此獨(dú)立，實(shí)現(xiàn)樣品的無閥隔離，從而將樣品離散化。樣品的引入通過利用透氣性的聚合物材料的透氣性質(zhì)，預(yù)先將微流控芯片置于抽氣容器中，進(jìn)行抽真空除氣處理。抽真空除氣的壓強(qiáng)和時(shí)間，根據(jù)不同的主通道4和反應(yīng)小室的尺寸參數(shù)選擇不同的抽真空除氣的壓強(qiáng)和時(shí)間，1-20 kPa，0.5-12小時(shí)。芯片抽真空除氣操作完成后，將芯片取出置于常壓，迅速在其上粘附透明耐熱膠帶備用。芯片進(jìn)行抽真空除氣處理結(jié)束后，透氣性的聚合物塊體內(nèi)氣壓下降，將其置于常壓下時(shí)，其內(nèi)主通道和反應(yīng)小室中的氣體優(yōu)先進(jìn)入聚合物塊體，導(dǎo)致主通道和反應(yīng)小室中的氣壓相應(yīng)下降，與外界環(huán)境形成氣壓差，此氣壓差驅(qū)動(dòng)樣品溶液均勻充滿整個(gè)主通道和反應(yīng)小室。使用前取出芯片，刺破進(jìn)樣口處的膠帶，將樣品溶液加入進(jìn)樣口處。樣品溶液在主通道和反應(yīng)小室與外界的氣壓差的驅(qū)動(dòng)下均勻充滿整個(gè)主通道和反應(yīng)小室。待樣品溶液均勻充滿整個(gè)主通道和反應(yīng)小室后，緊接著在樣品的進(jìn)樣口處加入與水不相容的油相液體。與水不相容的油相液體在內(nèi)外氣壓差的驅(qū)動(dòng)下進(jìn)入主通道，將主通道中的樣品溶液沖入后續(xù)的反應(yīng)小室，直至樣品進(jìn)入所有的反應(yīng)小室，從而將反應(yīng)樣品封入反應(yīng)小室內(nèi)，使其在反應(yīng)過程中彼此獨(dú)立，實(shí)現(xiàn)樣品的離散化。待與水不相容的油相液體完全充滿整個(gè)主通道后，用耐熱膠帶等將進(jìn)樣口和出樣口封閉。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種利用上述裝置進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)的方法，所述的方法包括以下步驟
(1)將模板DNA/RNA核酸擴(kuò)增試劑混合；
(2)預(yù)先將微流控芯片置于抽氣容器中，進(jìn)行抽真空除氣處理；
(3)微流控芯片置于抽氣容器中抽真空除氣后，取出芯片，迅速粘附透明耐熱膠帶；
(4)刺破芯片進(jìn)樣口處的膠帶，將樣品溶液加入進(jìn)樣口處，樣品溶液在主通道和反應(yīng)小室與外界的氣壓差的驅(qū)動(dòng)下均勻充滿整個(gè)主通道和反應(yīng)小室；
(5)待樣品溶液均勻充滿整個(gè)主通道和反應(yīng)小室后，緊接著在樣品的進(jìn)樣口處加入與水不相容的油相液體；
(6)與水不相容的油相液體在內(nèi)外氣壓差的驅(qū)動(dòng)下進(jìn)入主通道，將主通道中的樣品溶液沖入后續(xù)的反應(yīng)小室，直至樣品進(jìn)入所有的反應(yīng)小室，從而將反應(yīng)樣品封隔入反應(yīng)小室內(nèi)，使其在反應(yīng)過程中彼此獨(dú)立，實(shí)現(xiàn)樣品的離散化；
(7)待與水不相容的油相液體完全充滿整個(gè)主通道后，用耐熱膠帶將進(jìn)樣口和出樣口封閉；
(8)將上述微流控芯片置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀等核酸擴(kuò)增裝置上，采用電荷耦合元件(CCD)等圖像傳感器，在每一輪的PCR反應(yīng)結(jié)束時(shí)，采集每個(gè)反應(yīng)小室在該輪反應(yīng)的熒光信號(hào)，并最終繪制成反應(yīng)過程的熒光信號(hào)曲線，反應(yīng)結(jié)束后，通過對反應(yīng)過程中指數(shù)期熒光信號(hào)的分析對核酸進(jìn)行定量。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用上述裝置進(jìn)行數(shù)字核酸擴(kuò)增的方法，所述的方法包括以下步驟
(1)將模板DNA/RNA與帶有熒光染料的核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑混合
如果核酸擴(kuò)增采用熒光定量PCR方法，則將模板DNA/RNA與Taqman探針核酸擴(kuò)增試齊U、SYBR核酸擴(kuò)增試劑等混合；
如果核酸擴(kuò)增采用等溫?cái)U(kuò)增，則將模板DNA/RNA與等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑及DNA熒光染料SYBR Green1、鈣黃綠素、FITC等混合；
(2)預(yù)先將微流控芯片置于抽氣容器中，進(jìn)行抽真空除氣處理；
(3)微流控芯片置于抽氣容器中抽真空除氣半小時(shí)后，暫停抽真空除氣，將芯片迅速取出在其上粘附透明耐熱膠帶后，再將芯片迅速置于抽氣容器中繼續(xù)抽真空除氣操作；
(4)芯片抽真空除氣操作完成后，迅速取出芯片置于常壓下，刺破進(jìn)樣口處的膠帶，將樣品溶液加入進(jìn)樣口處，樣品溶液在主通道和反應(yīng)小室與外界的氣壓差的驅(qū)動(dòng)下均勻充滿整個(gè)主通道和反應(yīng)小室；(5)待樣品溶液均勻充滿整個(gè)主通道和反應(yīng)小室后，緊接著在樣品的進(jìn)樣口處加入與水不相容的油相液體；
(6)與水不相容的油相液體在內(nèi)外氣壓差的驅(qū)動(dòng)下進(jìn)入主通道，將主通道中的樣品溶液沖入后續(xù)的反應(yīng)小室，直至樣品進(jìn)入所有的反應(yīng)小室，從而將反應(yīng)樣品封隔入反應(yīng)小室內(nèi)，使其在反應(yīng)過程中彼此獨(dú)立，實(shí)現(xiàn)樣品的離散化；
(7)待與水不相容的油相液體完全充滿整個(gè)主通道后，用耐熱膠帶將進(jìn)樣口和出樣口封閉；
(8)將上述微流控芯片置于原位PCR儀或類似于原位PCR儀的溫控裝置上，進(jìn)行核酸擴(kuò)增；若對核酸進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，將微流控芯片組件置于普通的熱板上進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)即可；
(9)反應(yīng)結(jié)束后，采用CCD等圖像傳感器采集反應(yīng)小室的熒光信號(hào)，每一個(gè)發(fā)出熒光強(qiáng)度大于閾值的小室代表一個(gè)陽性核酸擴(kuò)增反應(yīng)，通過對陽性反應(yīng)小室的計(jì)數(shù)，就可以實(shí)現(xiàn)對所檢測樣品的原始拷貝數(shù)進(jìn)行絕對定量。本發(fā)明的應(yīng)用范圍包括SNP的檢測，單堿基突變的檢測，拷貝數(shù)失衡的檢測，單細(xì)胞基因表達(dá)譜的研究，癌癥標(biāo)志物的早期檢測以及干細(xì)胞分化和鑒定的相關(guān)研究。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1、與多孔板上進(jìn)行數(shù)字PCR相比，本發(fā)明利用微流控芯片微型化的特點(diǎn)，試劑和樣品的消耗量均減少，大大減小了實(shí)驗(yàn)成本。該發(fā)明裝置利用制作芯片主體結(jié)構(gòu)的聚合物塊體的透氣性質(zhì)，在抽真空脫氣處理后，利用主通道和反應(yīng)小室與外界大氣形成的氣壓差，并通過后續(xù)的油相封隔，使樣品自動(dòng)快速均勻的分散到成千上百個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)小室，大大提高了實(shí)驗(yàn)速度。2、本發(fā)明裝置無需外接的驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)和閥門開關(guān)控制裝置，大大減少了裝置的復(fù)雜性，充分體現(xiàn)了當(dāng)今分析設(shè)備微型化、便攜化的發(fā)展趨勢，在高通量、低消耗和大規(guī)模平行處理方面具有極大的優(yōu)勢。再者，由于樣品和試劑的分配都在芯片內(nèi)部完成，不與外界大氣直接接觸，可有效防止外界污染和交叉污染。3、與現(xiàn)有的商品化數(shù)字PCR芯片相比，本發(fā)明不需要微閥便可使少量液體分配到成百上千個(gè)獨(dú)立的小室中，大大減少了芯片制作和使用的復(fù)雜程度，為制作大規(guī)模微流控芯片提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。4、利用本發(fā)明可將單拷貝的核酸分子分配到獨(dú)立的納升級微室中并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。可以快速對樣品中核酸的起始拷貝數(shù)進(jìn)行絕對定量。對SNP、單堿基突變、拷貝數(shù)失衡、早期癌癥標(biāo)志物的檢測，單細(xì)胞基因表達(dá)譜的研究，以及干細(xì)胞分化和鑒定的相關(guān)研究具有廣闊的應(yīng)用前景?？蓱?yīng)用于現(xiàn)場的醫(yī)療檢驗(yàn)、疾病防控、食品安全、農(nóng)業(yè)、林業(yè)、畜牧養(yǎng)殖、水產(chǎn)養(yǎng)殖、分子生物、法醫(yī)鑒定、生命科研等諸多領(lǐng)域。5、本發(fā)明結(jié)構(gòu)及操作簡單，芯片只需要一個(gè)配套的真空泵，或者使用真空包裝將預(yù)先抽真空脫氣的聚合物芯片封包，無需其他的控制設(shè)備，其應(yīng)用成本比目前基于PDMS彈性微閥的數(shù)字PCR芯片大大減少，為數(shù)字PCR技術(shù)的推廣與應(yīng)用提供了一個(gè)良好的平臺(tái)。


圖1是本發(fā)明裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2是本發(fā)明裝置實(shí)施例2的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3是本發(fā)明裝置制作的掩模圖。圖4是實(shí)施例5中應(yīng)用本發(fā)明裝置進(jìn)行數(shù)字PCR反應(yīng)后的結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1
參見圖1，一種無需外接驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)、無需閥門、制作工藝簡便并且易于操作的用于核酸擴(kuò)增的微流控芯片裝置。該裝置由反應(yīng)層1、修飾層2、封接層3、主通道4、反應(yīng)小室5、進(jìn)樣口 6、出樣口 7和耐熱膠帶8構(gòu)成，反應(yīng)層I由主通道4串聯(lián)反應(yīng)小室5組成，反應(yīng)小室5位于主通道4上方，進(jìn)樣口 6、出樣口 7位于主通道4兩端，修飾層2預(yù)先與封接層3連接，反應(yīng)層I通過修飾層2與封接層3封接后組成微流控芯片組件。耐熱膠帶8粘貼于反應(yīng)層I的上表面。反應(yīng)層I采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)為材料，以采用多層軟光刻技術(shù)制作的具有微通道結(jié)構(gòu)的基板為模具，在模具上澆注具有透氣性質(zhì)的PDMS固化脫模形成。反應(yīng)小室5的邊長為 100 μπι, 200 μπι或 300 Pm 的正方形，深 50 μ m, 100 μ m, 200 μ m, 300 μπι。根據(jù)不同的寬度和模具高度，反應(yīng)小室5的體積可為200 pL, I nL, 2 nL, 4.5 nL, 8 nL,18 nL, 60 nL等；反應(yīng)小室5也可以為五邊形、梯形或圓形。主通道4的寬度為50 μ m，100 μ m 或 500 μ m。封接層3采用0.17mm厚的蓋玻片玻璃作為材料，預(yù)先采用空氣等離子體處理，以備與修飾層2的結(jié)合。修飾層2采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)為材料，采用勻膠機(jī)旋轉(zhuǎn)涂覆的方法均勻涂覆在預(yù)先經(jīng)空氣等離子體處理的作為封接層3的0.17mm厚的蓋玻片玻璃上。與水不相容的油相液體選用氟化油、石蠟油或硅油。反應(yīng)層I制作好后，將進(jìn)樣口 6與出樣口 7用打孔器打孔，然后用涂覆有修飾層2的封接層3將反應(yīng)層I封接閉合。封接方法可以通過將芯片置于熱板上加熱，利用具有透氣性質(zhì)的PDMS聚合物固有的化學(xué)性質(zhì)而以化學(xué)方法粘合在一起。制作完成的微流控PDMS芯片置于容器中抽真空除氣，取出后迅速在其整個(gè)上表面粘附透明耐熱膠帶8并且封閉進(jìn)樣口 6和出樣口 7，之后再將芯片迅速真空密封包裝。PDMS芯片進(jìn)行抽真空除氣處理后，透氣性的聚合物塊體內(nèi)氣壓下降，停止抽真空除氣后并置于常壓下時(shí)，其內(nèi)主通道4和反應(yīng)小室5中的氣體優(yōu)先進(jìn)入聚合物塊體，導(dǎo)致主通道4和反應(yīng)小室5中的氣壓相應(yīng)下降，與外界環(huán)境形成氣壓差，此氣壓差驅(qū)動(dòng)樣品溶液均勻充滿整個(gè)主通道4和反應(yīng)小室5。將芯片迅速從經(jīng)過真空除氣的容器中取出置于常壓環(huán)境下，刺破進(jìn)樣口 6處的透明耐熱膠帶8，將樣品溶液加入進(jìn)樣口 6處，樣品溶液在氣壓差的驅(qū)動(dòng)下均勻充滿主通道4和反應(yīng)小室5。待樣品溶液均勻充滿整個(gè)主通道4和反應(yīng)小室5后，在樣品的進(jìn)樣口 6處加入與水不相容的油相液體，將主通道4中的樣品溶液沖入后續(xù)的反應(yīng)小室5，直至樣品進(jìn)入所有的反應(yīng)小室5，從而將反應(yīng)樣品封隔入反應(yīng)小室5內(nèi)，使其在反應(yīng)過程中彼此獨(dú)立，實(shí)現(xiàn)樣品的離散化。
待與水不相容的油相液體完全充滿整個(gè)主通道4后，用耐熱透明膠帶將進(jìn)樣口 6和出樣口 7封閉。實(shí)施例2
參見圖2，一種無需外接驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)、無需閥門、制作工藝簡便并且易于操作的用于核酸擴(kuò)增的微流控芯片裝置。該裝置由反應(yīng)層1、修飾層2、封接層3、主通道4、反應(yīng)小室5、進(jìn)樣口 6、出樣口 7和耐熱膠帶8構(gòu)成，反應(yīng)層I由主通道4串聯(lián)反應(yīng)小室5組成，反應(yīng)小室5位于主通道4下方，進(jìn)樣口 6、出樣口 7位于主通道4兩端，修飾層2預(yù)先與封接層3連接，反應(yīng)層I通過修飾層2與封接層3封接后組成微流控芯片組件。耐熱膠帶8粘貼于反應(yīng)層I的上表面。反應(yīng)層I采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)為材料，以采用多層軟光刻技術(shù)制作的具有微通道結(jié)構(gòu)的基板為模具，先在模具上澆注一層Imm厚的具有透氣性質(zhì)的PDMS薄層，待該P(yáng)DMS層經(jīng)烘烤固化后，將其與氟膜一起用空氣等離子體處理，然后將氟膜均勻粘附在該固化PDMS薄層上。同時(shí)在平整光滑的基板上澆注一層Icm厚的PDMS層。待上述氟膜與PDMS薄層穩(wěn)定粘合后，通過氟膜將PDMS薄層脫模，與前述Icm厚的PDMS層粘合，打孔器對準(zhǔn)打孔。反應(yīng)小室5的邊長為100 μπι,200 μπι或300 μπι的正方形，深50 μπι, 100 μπι,200 ym, 300 μπι。根據(jù)不同的寬度和模具高度，反應(yīng)小室5的體積可為500 pL，I nL, 2nL, 4.5 nL, 8 nL, 9 nL, 18 nL ;反應(yīng)小室5也可以為五邊形、梯形或圓形。主通道4的寬度為 50 μ m, 100 μ m 或 200 μ m。與水不相容的油相液體選用氟化油、石蠟油或硅油等。反應(yīng)層I制作好后，將進(jìn)樣口 6與出樣口 7用打孔器打孔，然后用涂覆有修飾層2的封接層3將反應(yīng)層I封接閉合。制作完成的微流控PDMS芯片置于容器中抽真空除氣，取出后迅速在其整個(gè)上表面粘附透明耐熱膠帶8并且封閉進(jìn)樣口 6和出樣口 7，之后再將芯片迅速真空密封包裝。PDMS芯片進(jìn)行抽真空除氣處理后，透氣性的聚合物塊體內(nèi)氣壓下降，停止抽真空除氣后并置于常壓下時(shí)，其內(nèi)主通道4和反應(yīng)小室5中的氣體優(yōu)先進(jìn)入聚合物塊體，導(dǎo)致主通道4和反應(yīng)小室5中的氣壓相應(yīng)下降，與外界環(huán)境形成氣壓差，此氣壓差驅(qū)動(dòng)樣品溶液均勻充滿整個(gè)主通道4和反應(yīng)小室5。將芯片迅速從經(jīng)過真空除氣的容器中取出置于常壓環(huán)境下，刺破進(jìn)樣口 6處的透明耐熱膠帶8，將樣品溶液加入進(jìn)樣口 6處，樣品溶液在氣壓差的驅(qū)動(dòng)下均勻充滿整個(gè)主通道4和反應(yīng)小室5。待樣品溶液均勻充滿整個(gè)主通道4和反應(yīng)小室5后，在樣品的進(jìn)樣口 6處加入與水不相容的油相液體，將主通道4中的樣品溶液沖入后續(xù)的反應(yīng)小室5，直至樣品進(jìn)入所有的反應(yīng)小室5，從而將反應(yīng)樣品封隔入反應(yīng)小室5內(nèi)，使其在反應(yīng)過程中彼此獨(dú)立，實(shí)現(xiàn)樣品的離散化。
待與水不相容的油相液體完全充滿整個(gè)主通道4后，用耐熱透明膠帶將進(jìn)樣口 6和出樣口 7封閉。實(shí)施例3
無動(dòng)力源無閥型微流控PDMS芯片上的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-timePCR) ο本實(shí)施例采用實(shí)施例1的裝置進(jìn)樣，并進(jìn)行后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)。具體步驟:1、參見圖3設(shè)計(jì)通道結(jié)構(gòu)并制成掩膜。2、反應(yīng)層I采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)為材料，以采用多層軟光刻技術(shù)制作的具有微通道結(jié)構(gòu)的基板為模具，在模具上澆注具有透氣性質(zhì)的PDMS固化形成。反應(yīng)小室5的邊長為 100 μ m, 200 μ m 或 300 Pm 的正方形，深 50 μ m, 100 μ m, 200 μ m, 300 μ m。根據(jù)不同的寬度和模具高度，反應(yīng)小室5的體積可為500 pL, I nL, 2 nL, 4.5 nL, 8 nL,9 nL, 18 nL ;反應(yīng)小室5也可以為五邊形、梯形或圓形。主通道4的寬度為50 μ m, 100 μ m或 200 μ m。3、封接層3采用0.17mm厚的蓋玻片玻璃作為材料，預(yù)先采用空氣等離子體處理，以備與修飾層2的結(jié)合。4、修飾層2采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)為材料，采用勻膠機(jī)旋轉(zhuǎn)涂覆的方法均勻涂覆在預(yù)先經(jīng)空氣等離子體處理的作為封接層3的0.17mm厚的蓋玻片玻璃上。5、反應(yīng)層I制作好后，將進(jìn)樣口 6與出樣口 7用打孔器對準(zhǔn)打孔，然后用涂覆有修飾層2的封接層3將反應(yīng)層I封接閉合。6、制作完成的微流控PDMS芯片置于容器中抽真空除氣，取出迅速在其上粘附透明耐熱膠帶8并且封閉進(jìn)樣口 6和出樣口 7，之后再將芯片迅速真空密封包裝。7、PDMS芯片進(jìn)行抽真空除氣處理后，透氣性的聚合物塊體內(nèi)氣壓下降，停止抽真空除氣后并置于常壓下時(shí)，其內(nèi)主通道4和反應(yīng)小室5中的氣體優(yōu)先進(jìn)入聚合物塊體，導(dǎo)致主通道4和反應(yīng)小室5中的氣壓相應(yīng)下降，與外界環(huán)境形成氣壓差，此氣壓差驅(qū)動(dòng)樣品溶液均勻充滿整個(gè)主通道4和反應(yīng)小室5。8、采用商業(yè)化的β -actin cDNA作為反應(yīng)模板考察芯片性能:將模板DNA稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛炔⑴c適量的熒光定量PCR反應(yīng)試劑混合:
(I)將 500 ng/μ L 的 β-actin cDNA 溶液稀釋為 5 pg/μ L、0.5 pg/μ L、0.05 pg/μ L、0.005 pg/ μ L，作為DNA模板各取I μ L進(jìn)行PCR反應(yīng)。(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，按照10 μ L體積配制反應(yīng)液，PCR緩沖液5 μ L，PCR正向引物I yL，PCR反向引物I yL，探針I(yè) μ L，ddH20 I μ L，DNA模板I μ L。反應(yīng)條件:50°C 2 min, 95°C 10 min 預(yù)變性，95°C 15 sec,60°C I min，共 40 個(gè)循環(huán)。所用β -actin cDNA的引物序列如下:
Actin F (上游引物):5’ ACCGAGCGCGGCTACAG3’
Actin R (下游引物):5’ CTTAATGTCACGCACGATTTCC3’
Actin-probe (5，— 3，): FAM+TTCACCACCACGGCCGAGC+TAMRA
(3)PCR的擴(kuò)增反應(yīng)及檢測還可以采用SYBR試劑來完成。按照50 μ L體積配制反應(yīng)液，SYBR緩沖液(2Χ) 25 yL，PCR正向引物(10 μ M) I yL，PCR反向引物(ΙΟμΜ)
Iμ I, ddH20 21 μ L，DNA 模板 2.0 μ L0 反應(yīng)條件:95°C 30 sec 預(yù)變性，95°C 5 sec,60°C 30 sec,共30-40個(gè)循環(huán)。所用β -actin cDNA的引物序列如下:
Actin F (上游引物):5’ACCGAGCGCGGCTACAG3’
Actin R (下游引物):5，CTTAATGTCACGCACGATTTCC3’9、將芯片迅速從抽過真空除氣的容器中取出置于常壓環(huán)境下，刺破進(jìn)樣口 6處的透明耐熱膠帶8，將樣品溶液加入進(jìn)樣口 6處，樣品溶液在氣壓差的驅(qū)動(dòng)下均勻充滿整個(gè)主通道4和反應(yīng)小室5。10、待樣品溶液均勻充滿整個(gè)主通道4和反應(yīng)小室5后，在樣品的進(jìn)樣口 6處加入與水不相容的油相液體，將主通道4中的樣品溶液沖入后續(xù)的反應(yīng)小室5，直至樣品進(jìn)入所有的反應(yīng)小室5，從而將反應(yīng)樣品封隔入反應(yīng)小室5內(nèi)，使其在反應(yīng)過程中彼此獨(dú)立，實(shí)現(xiàn)樣品的離散化。11、待與水不相容的油相液體完全充滿整個(gè)主通道4后，用耐熱膠帶8將進(jìn)樣口 6和出樣口 7封閉。12、將微流控芯片組件置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀等核酸擴(kuò)增裝置上，采用C⑶等圖像傳感器，在每一輪的PCR反應(yīng)結(jié)束時(shí)，采集每個(gè)反應(yīng)小室5在該輪反應(yīng)的熒光信號(hào)，并最終繪制成反應(yīng)過程的熒光信號(hào)曲線。反應(yīng)結(jié)束后，通過對反應(yīng)過程中指數(shù)期熒光信號(hào)的分析對核酸進(jìn)行定量。實(shí)施例4無動(dòng)力源無閥型微流控PDMS芯片上的核酸等溫?cái)U(kuò)增本實(shí)施例采用實(shí)施例1的裝置進(jìn)樣，并進(jìn)行后續(xù)的數(shù)字核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。具體步驟:1、參見圖3設(shè)計(jì)通道結(jié)構(gòu)并制成掩膜。2、反應(yīng)層I采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)為材料，以采用多層軟光刻技術(shù)制作的具有微通道結(jié)構(gòu)的基板為模具，在模具上澆注具有透氣性質(zhì)的PDMS固化形成。反應(yīng)小室5的邊長為 100 μ m, 200 μ m 或 300 Pm 的正方形，深 50 μ m, 100 μ m, 200 μ m, 300 μ m。根據(jù)不同的寬度和模具高度，反應(yīng)小室5的體積可為500 pL, I nL, 2 nL, 4.5 nL, 8 nL,18 nL, 60 nL等；反應(yīng)小室5也可以為五邊形、梯形或圓形等。主通道4的寬度為50 μ m，100 μ m 或 500 μ m 等。3、封接層3采用0.17mm厚的蓋玻片玻璃作為材料，預(yù)先采用空氣等離子體處理，以備與修飾層2的結(jié)合。4、修飾層2采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)為材料，采用勻膠機(jī)旋轉(zhuǎn)涂覆的方法均勻涂覆在預(yù)先經(jīng)空氣等離子體處理的作為封接層3的0.17mm厚的蓋玻片玻璃上。5、反應(yīng)層I制作好后，將進(jìn)樣口 6與出樣口 7用打孔器打孔，然后用涂覆有修飾層2的封接層3將反應(yīng)層I封接閉合。6、制作完成的微流控PDMS芯片置于容器中抽真空除氣，取出后迅速在其上粘附透明耐熱膠帶8并且封閉進(jìn)樣口 6和出樣口 7，之后再將芯片迅速真空密封包裝。7、PDMS芯片進(jìn)行抽真空除氣處理后，透氣性的聚合物塊體內(nèi)氣壓下降，停止抽真空除氣后并置于常壓下時(shí)，其內(nèi)主通道4和反應(yīng)小室5中的氣體優(yōu)先進(jìn)入聚合物塊體，導(dǎo)致主通道4和反應(yīng)小室5中的氣壓相應(yīng)下降，與外界環(huán)境形成氣壓差，此氣壓差驅(qū)動(dòng)樣品溶液均勻充滿整個(gè)主通道4和反應(yīng)小室5。8、采用商業(yè)化的疋16s rRNA作為反應(yīng)模板考察芯片性能:將模板DNA稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛炔⑴c適量的LAMP反應(yīng)試劑及DNA熒光染料SYBR Green I混合:
(I)將 500 ng/ μ L 的厶 coli 16s rRNA 溶液稀釋為 5 pg/ μ L、0.5 pg/ μ L、0.05 pg/μ L、0.005 pg/ μ L，作為DNA模板各取I μ L進(jìn)行PCR反應(yīng)。
(2 )按照 50 μ L 體系配制 LAMP 反應(yīng)混合物-.E.coli 16s rRNA 模板 IyLj^FIP(40 μΜ) 2 μ L，引物 BIP (40 μ Μ) 2 yL，引物 F3 (5 μ Μ) 2 yL，引物 Β3 (5 μ Μ) 2μ L, dNTP (2.5 mM each) 8 μ L, MgSO4 (50 mM) 6 μ L, betaine (5 Μ) 10 μ L，Bst 酶 2μ L, Bstbuffer 5 μ L, SYBR Green I 2 μ L, ddH20 8 μ L。LAMP 引物如下:
F3: 5’ GATGTGCCCAGATGGGATT3’
Β3: 5’ GGCCTTCTTCATACACGCG3’
FIP: 5’ TGGTCATCCTCTCAGACCAGCTTTTTGCTAGTAGGTGGGGTAACGG3’
BIP: 5’ TGGAACTGAGACACGCTCCAGATTTTATGGCTGCATCAGGCTTG3’
9、將芯片迅速從抽過真空除氣的容器中取出置于常壓環(huán)境下，刺破進(jìn)樣口 6處的透明耐熱膠帶8，將樣品溶液加入進(jìn)樣口 6處，樣品溶液在氣壓差的驅(qū)動(dòng)下均勻充滿整個(gè)主通道4和反應(yīng)小室5。10、待樣品溶液均勻充滿整個(gè)主通道4和反應(yīng)小室5后，在樣品的進(jìn)樣口 6處加入與水不相容的油相液體，將主通道4中的樣品溶液沖入后續(xù)的反應(yīng)小室5，直至樣品進(jìn)入所有的反應(yīng)小室5，從而將反應(yīng)樣品封隔入反應(yīng)小室5內(nèi)，使其在反應(yīng)過程中彼此獨(dú)立，實(shí)現(xiàn)樣品的離散化。11、待與水不相容的油相液體完全充滿整個(gè)主通道4后，用耐熱膠帶8將進(jìn)樣口 6和出樣口 7封閉。12、將芯片置于原位PCR儀、熱板等裝置上，按所需擴(kuò)增樣品不同的進(jìn)行不同的恒溫加熱，對核酸進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增。由于SYBR Green I熒光染料只與雙鏈DNA小溝結(jié)合，當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出較 原先強(qiáng)80(Γ1000倍的熒光，因此，發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)的小室將呈現(xiàn)綠色熒光，陰性將無顏色變化 。因此，如果有核酸分子被分配到某個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)小室5，該小室在反應(yīng)后將產(chǎn)生綠色的熒光；如果核酸的濃度足夠低，使每個(gè)反應(yīng)小室5最多能分到一個(gè)核酸分子，那么，通過對陽性孔的計(jì)數(shù)就可以對起始的核酸模板量進(jìn)行精確定量。13、反應(yīng)結(jié)束后,米用(XD圖像傳感器米集反應(yīng)小室5的突光信號(hào),每一個(gè)發(fā)出突光強(qiáng)度大于閾值的小室代表一個(gè)陽性反應(yīng)，通過對陽性反應(yīng)小室5的計(jì)數(shù)，就可以實(shí)現(xiàn)對所檢測樣品的原始拷貝數(shù)進(jìn)行絕對定量。實(shí)施例5
無動(dòng)力源無閥型微流控PDMS芯片上的數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Digital-PCR)
本實(shí)施例采用實(shí)施例1的裝置進(jìn)樣，并進(jìn)行后續(xù)的數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Digital-PCR)
具體步驟:1、參見圖3設(shè)計(jì)通道結(jié)構(gòu)并制成掩膜。2、反應(yīng)層I采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)為材料，以采用多層軟光刻技術(shù)制作的具有微通道結(jié)構(gòu)的基板為模具，澆注Icm左右的PDMS，打孔器打孔。3、反應(yīng)小室5的邊長為100 μπι,200 μ m或300 μπι的正方形，深50 μ m, 100μπι, 200 ym, 300 ym.根據(jù)不同的寬度和模具高度，反應(yīng)小室5的體積可為200 pL，InL, 2 nL, 4.5 nL, 8 nL, 9 nL, 60 nL ;反應(yīng)小室5也可以為五邊形、梯形或圓形。主通道4的寬度為50 μ m，100 μ m或500 μ m。4、與水不相容的油相液體選用氟化油、石蠟油或硅油等。
5、反應(yīng)層I制作好后，將進(jìn)樣口 6與出樣口 7用打孔器打孔，然后用涂覆有修飾層2的封接層3將反應(yīng)層I封接閉合。6、制作完成的微流控PDMS芯片置于容器中抽真空除氣，取出后迅速在其整個(gè)上表面粘附透明耐熱膠帶8并且封閉進(jìn)樣口 6和出樣口 7，之后再將芯片迅速真空密封包裝。7、PDMS芯片進(jìn)行抽真空除氣處理后，透氣性的聚合物塊體內(nèi)氣壓下降，停止抽真空除氣后并置于常壓下時(shí)，其內(nèi)主通道4和反應(yīng)小室5中的氣體優(yōu)先進(jìn)入聚合物塊體，導(dǎo)致主通道4和反應(yīng)小室5中的氣壓相應(yīng)下降，與外界環(huán)境形成氣壓差，此氣壓差驅(qū)動(dòng)樣品溶液均勻充滿整個(gè)主通道4和反應(yīng)小室5。8、采用商業(yè)化的β -actin cDNA作為反應(yīng)模板考察芯片性能:將模板DNA稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛炔⑴c適量的熒光定量PCR反應(yīng)試劑混合:
(I)將 500 ng/μ L 的 β-actin cDNA 溶液稀釋為 5 pg/μ L、0.5 pg/μ L、0.05 pg/μ L、
0.005 pg/ μ L，作為DNA模板各取I μ L進(jìn)行PCR反應(yīng)。(2)使用TaqMan反應(yīng)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，按照10 μ L體積配制反應(yīng)液，PCR緩沖液5 μ L7PCR前向引物I yL，PCR反向引物I μ L，探針I(yè) μ L，ddH20 I yL,DNA模板 I UL。反應(yīng)條件:50°C 2 min, 95°C 10 min 預(yù)變性，95°C 15 sec, 60°C I min，共30-40個(gè)循環(huán)。所用β-actin cDNA的引物序列如下:
Actin F (上游引物):5’ACCGAGCGCGGCTACAG3’
Actin R (下游引物):5，CTTAATGTCACGCACGATTTCC3’
Actin-probe (5，— 3，): FAM+TTCACCACCACGGCCGAGC+TAMRA
(3)PCR的擴(kuò)增反應(yīng)及檢測還可以采用SYBR反應(yīng)試劑來完成。使用SYBR進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，按照50 μ L體積配制反應(yīng)液，SYBR緩沖液(2Χ) 25 yL，PCR前向引物I μ L，PCR反向引物I μ ，ddH20 21 “1^，0嫩模板2.0 μ L0反應(yīng)條件:95°C 30 sec預(yù)變性，95°C 5 sec,60°C 30 sec,共40個(gè)循環(huán)。所用β-actin cDNA的引物序列如下:
Actin F (上游引物):5’ ACCGAGCGCGGCTACAG3’
Actin R (下游引物):5’ CTTAATGTCACGCACGATTTCC3’
9、將芯片迅速從抽過真空除氣的容器中取出置于常壓環(huán)境下，刺破進(jìn)樣口 6處的透明耐熱膠帶8，將樣品溶液加入進(jìn)樣口 6處，樣品溶液在氣壓差的驅(qū)動(dòng)下均勻充滿整個(gè)主通道4和反應(yīng)小室5。10、待樣品溶液均勻充滿整個(gè)主通道4和反應(yīng)小室5后，在樣品的進(jìn)樣口 6處加入與水不相容的油相液體，將主通道4中的樣品溶液沖入后續(xù)的反應(yīng)小室5，直至樣品進(jìn)入所有的反應(yīng)小室5，從而將反應(yīng)樣品封隔入反應(yīng)小室5內(nèi)，使其在反應(yīng)過程中彼此獨(dú)立，實(shí)現(xiàn)樣品的離散化。11、待與水不相容的油相液體完全充滿整個(gè)主通道4后，用耐熱膠帶8將進(jìn)樣口 6和出樣口 7封閉。12、將芯片組件置于原位PCR儀上，根據(jù)不同的反應(yīng)試劑設(shè)定不同的反應(yīng)條件。13、反應(yīng)結(jié)束后,米用突光成像系統(tǒng)米集反應(yīng)小室5的突光信號(hào),每一個(gè)發(fā)出突光強(qiáng)度大于閾值的小室代表一個(gè)陽性的PCR反應(yīng)，通過對陽性反應(yīng)小室5的計(jì)數(shù)，就可以實(shí)現(xiàn)對所檢測樣品的原始拷貝數(shù)進(jìn)行絕對定量(圖4)。TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴(kuò)增相關(guān)。它設(shè)計(jì)為與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對。熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端，而淬滅劑則在3’末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的5’外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。實(shí)驗(yàn)中使用的是FAM標(biāo)記的探針，當(dāng)其水解時(shí)，發(fā)綠色熒光，因此，發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)的小室將呈現(xiàn)綠色熒光，陰性將無顏色變化。因此，如果有核酸分子被分配到某個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)小室5，該小室在反應(yīng)后將產(chǎn)生綠色的熒光；如果核酸的濃度足夠低，使每個(gè)反應(yīng)小室5最多能分到一個(gè)核酸分子，那么，通過對陽性孔的計(jì)數(shù)就可以對起始的核酸模板量進(jìn)行精確定量。SYBR Green I熒光染料只與雙鏈DNA小溝結(jié)合，當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出較原先強(qiáng)80(Γ1000倍的熒光，因此，發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)的小室將呈現(xiàn)綠色熒光，陰性將無顏色變化。因此，如果有核酸分子被分配到某個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)小室5，該小室在反應(yīng)后將產(chǎn)生綠色的熒光；如果核酸的濃度足夠低，使每個(gè)反應(yīng)小室5最多能分到一個(gè)核酸分子，那么，通過對陽性孔的計(jì)數(shù)就可以對起始的核酸模`板量進(jìn)行精確定量?！?10〉浙江大學(xué)
〈120〉一種用于數(shù)字核酸擴(kuò)增的高密度陣列芯片裝置及應(yīng)用〈160〉 7
〈210〉 I〈211〉 19〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈220〉
〈223〉根據(jù)E. coli 16s rRNA序列設(shè)計(jì)的LAMP F3序列<400>1gatgtgccca gatgggatt 19
〈210〉 2〈211〉 19〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈220〉
〈223〉根據(jù)E.coli 16s rRNA序列設(shè)計(jì)的LAMP B3序列<400>2ggccttcttc atacacgcg 19
〈210〉 3〈211〉 46〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈220〉
〈223〉根據(jù)E.coli 16s rRNA序列設(shè)計(jì)的LAMP FIP序列〈400>3
tggtcatcct ctcagaccag ctttttgcta gtaggtgggg taacgg 46
〈210〉 4〈211〉 44〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈220〉
〈223〉根據(jù)E.coli 16s rRNA序列設(shè)計(jì)的LAMP BIP序列<400>4
tggaactgag acacgctcca gattttatgg ctgcatcagg cttg 44〈210〉 5〈211〉 17〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈220〉
〈223〉根據(jù)β-actin cDNA序列設(shè)計(jì)的PCR檢測上游引物序列〈400>5accgagcgcg gctacag 17
〈210〉 6〈211〉 22〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈220〉
〈223〉根據(jù)β-actin cDNA序列設(shè)計(jì)的PCR檢測下游引物序列〈400>6
cttaatgtca cgcacgattt cc 22
〈210〉 7〈211〉 19〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈220〉
〈223〉根據(jù)β-actin cDNA序列設(shè)計(jì)的PCR檢測探針序列<400>7
Fam—ttcaccacca cggccgagc-Tamra 19
權(quán)利要求
1.一種無動(dòng)力源無閥型單分子檢測芯片，由反應(yīng)層(I)、修飾層(2)、封接層(3)、主通道(4)、反應(yīng)小室(5)、進(jìn)樣口(6)、出樣口(7)和耐熱膠帶(8)構(gòu)成，反應(yīng)層(I)由主通道(4)串聯(lián)反應(yīng)小室(5)組成，反應(yīng)小室(5)位于主通道(4)上方或下方，進(jìn)樣口(6)、出樣口(7)位于主通道(4 )兩端，修飾層(2 )與封接層(3 )連接，反應(yīng)層(I)通過修飾層(2 )與封接層(3)封接后組成微流控芯片組件，耐熱膠帶(8)粘貼于反應(yīng)層(I)的上表面。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無動(dòng)力源無閥型單分子檢測芯片，其特征在于，反應(yīng)小室(5)位于主通道(4)上方時(shí)，封接層(3)與反應(yīng)層(I)封接前，預(yù)先在基底上鋪展與反應(yīng)層(I)材料相同的具有透氣性質(zhì)的聚合物薄膜作為修飾層(2 )。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無動(dòng)力源無閥型單分子檢測芯片，其特征在于，反應(yīng)小室(5)位于主通道(4)下方時(shí)，封接層(3)與反應(yīng)層(I)封合前，二者分別用空氣等離子體進(jìn)行處理。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無動(dòng)力源無閥型單分子檢測芯片，其特征在于，主通道(4)的寬度100nm-5 mm，主通道的深度范圍100 nm-1 mm，反應(yīng)小室(5)的體積為微升到皮升級別。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無動(dòng)力源無閥型單分子檢測芯片，其特征在于，反應(yīng)層(O的制作材料選用聚合物材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種無動(dòng)力源無閥型單分子檢測芯片，其特征在于，反應(yīng)層(O的制作材料選用聚二甲基硅氧烷。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無動(dòng)力源無閥型單分子檢測芯片，其特征在于，反應(yīng)小室(5)位于主通道(4)上方時(shí) ，封接層(3)的材料選用玻璃和單晶硅片作為基底；反應(yīng)小室(5)位于主通道(4)下方時(shí)，封接層(3)的材料選用透明膠帶、PET膜或氟膜。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無動(dòng)力源無閥型單分子檢測芯片在進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的應(yīng)用，通過以下步驟實(shí)現(xiàn):(1)將模板DNA/RNA核酸擴(kuò)增試劑混合；(2)預(yù)先將微流控芯片置于抽氣容器中，進(jìn)行抽真空除氣處理；(3)微流控芯片置于抽氣容器中抽真空除氣后，取出芯片，迅速粘附透明耐熱膠帶(8);(4)刺破芯片進(jìn)樣口(6)處的膠帶，將樣品溶液加入進(jìn)樣口(6)處，樣品溶液在主通道(4)和反應(yīng)小室(5)與外界的氣壓差的驅(qū)動(dòng)下均勻充滿整個(gè)主通道(4)和反應(yīng)小室(5)；(5)待樣品溶液均勻充滿整個(gè)主通道(4)和反應(yīng)小室(5)后，緊接著在樣品的進(jìn)樣口(6)處加入與水不相容的油相液體；(6)與水不相容的油相液體在內(nèi)外氣壓差的驅(qū)動(dòng)下進(jìn)入主通道(4)，將主通道(4)中的樣品溶液沖入后續(xù)的反應(yīng)小室(5)，直至樣品進(jìn)入所有的反應(yīng)小室(5)，從而將反應(yīng)樣品封隔入反應(yīng)小室(5)內(nèi)，使其在反應(yīng)過程中彼此獨(dú)立，實(shí)現(xiàn)樣品的離散化；(7)待與水不相容的油相液體完全充滿整個(gè)主通道(4)后，用耐熱膠帶(8)將進(jìn)樣口(6)和出樣口(7)封閉；(8)將上述微流控芯片置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀等核酸擴(kuò)增裝置上，采用電荷耦合元件圖像傳感器，在每一輪的PCR反應(yīng)結(jié)束時(shí)，采集每個(gè)反應(yīng)小室(5)在該輪反應(yīng)的熒光信號(hào)，并最終繪制成反應(yīng)過程的熒光信號(hào)曲線，反應(yīng)結(jié)束后，通過對反應(yīng)過程中指數(shù)期熒光信號(hào)的分析對核酸進(jìn)行定量。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無動(dòng)力源無閥型單分子檢測芯片在進(jìn)行數(shù)字核酸擴(kuò)增中的應(yīng)用，通過以下步驟實(shí)現(xiàn):(1)將模板DNA/RNA與帶有熒光染料的核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑混合:如果核酸擴(kuò)增采用熒光定量PCR方法，則將模板DNA/RNA與Taqman探針核酸擴(kuò)增試齊U、SYBR核酸擴(kuò)增試劑混合；如果核酸擴(kuò)增采用等溫?cái)U(kuò)增，則將模板DNA/RNA與等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑及DNA熒光染料SYBR Green1、鈣黃綠素、FITC混合；(2)預(yù)先將微流控芯片置于抽氣容器中，進(jìn)行抽真空除氣處理；(3)微流控芯片置于抽氣容器中抽真空除氣半小時(shí)后，暫停抽真空除氣，將微流控芯片迅速取出在其上粘附透明耐熱膠帶(8)后，再將微流控芯片迅速置于抽氣容器中繼續(xù)抽真空除氣操作；(4)微流控芯片抽真空除氣操作完成后，迅速取出微流控芯片置于常壓下，刺破進(jìn)樣口(6)處的膠帶，將樣品溶液加入進(jìn)樣口(6)處，樣品溶液在主通道(4)和反應(yīng)小室(5)與外界的氣壓差的驅(qū)動(dòng)下均勻充滿整個(gè)主通道(4)和反應(yīng)小室(5)；(5)待樣品溶液均勻充滿整個(gè)主通道(4)和反應(yīng)小室(5)后，緊接著在樣品的進(jìn)樣口(6)處加入與水不相容的油相液體；(6)與水不相容的油相液體在內(nèi)外氣壓差的驅(qū)動(dòng)下進(jìn)入主通道(4)，將主通道(4)中的樣品溶液沖入后續(xù)的反應(yīng)小室(5)，直至樣品進(jìn)入所有的反應(yīng)小室(5)，從而將反應(yīng)樣品封隔入反應(yīng)小室(5)內(nèi)，使其在反應(yīng)過程中彼此獨(dú)立，實(shí)現(xiàn)樣品的離散化；(7)待與水不相容的油相液體完全充滿整個(gè)主通道(4)后，用耐熱膠帶(8)將進(jìn)樣口(6)和出樣口(7)封閉；(8)將上述微流控芯片置于原位PCR儀的溫控裝置上， 進(jìn)行核酸擴(kuò)增；若對核酸進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，將微流控芯片組件置于普通的熱板上進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)即可；(9)反應(yīng)結(jié)束后，采用電荷耦合元件圖像傳感器采集反應(yīng)小室(5)的熒光信號(hào)，每一個(gè)發(fā)出熒光強(qiáng)度大于閾值的小室代表一個(gè)陽性核酸擴(kuò)增反應(yīng)，通過對陽性反應(yīng)小室(5)的計(jì)數(shù)，就可以實(shí)現(xiàn)對所檢測樣品的原始拷貝數(shù)進(jìn)行絕對定量。
全文摘要
本發(fā)明提供一種無動(dòng)力源無閥型單分子檢測芯片，由反應(yīng)層、修飾層、封接層、主通道、反應(yīng)小室、進(jìn)樣口、出樣口和耐熱膠帶構(gòu)成，反應(yīng)層由主通道串聯(lián)反應(yīng)小室組成，反應(yīng)小室位于主通道上方或下方，進(jìn)樣口、出樣口位于主通道兩端，修飾層預(yù)先與封接層連接，反應(yīng)層通過修飾層與封接層封接后組成微流控芯片組件，耐熱膠帶粘貼于反應(yīng)層的上表面。本發(fā)明微型化，減少試劑和樣品的消耗量，成本低；無需外接的驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)和閥門開關(guān)控制裝置，便可使少量液體分配到成百上千個(gè)獨(dú)立的小室中，減少了芯片制作和使用的復(fù)雜性。本發(fā)明操作簡單，無需其他控制設(shè)備，應(yīng)用成本低，可在實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和數(shù)字核酸擴(kuò)增中應(yīng)用。
文檔編號(hào)B01L3/00GK103071548SQ20121009649
公開日2013年5月1日 申請日期2012年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月5日
發(fā)明者牟穎, 朱強(qiáng)遠(yuǎn), 高一搏, 金偉 申請人:浙江大學(xué)