專利名稱：聚丙烯酸包覆四氧化三鐵磁性納米粒子的制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種聚丙烯酸(PAA)包覆的四氧化三鐵磁性納米粒子的制備方法及其應(yīng) 用，屬于納米材料和生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
四氧化三鐵磁性納米粒子毒性低，具有磁響應(yīng)性，當(dāng)粒徑足夠小時(shí)，具有 超順磁性，即在外加磁場中有較強(qiáng)的磁性，撤離磁場時(shí)，磁性很快消失，剩磁 為零，不會被永久磁化。
經(jīng)PAA包覆的四氧化三鐵磁性納米粒子，可以使其既具有磁性和水溶性， 又具有表面活性基團(tuán)，能進(jìn)一步和細(xì)胞、酶、蛋白質(zhì)、抗體及核酸等多種生物 分子偶聯(lián)。在外加磁場的作用下，磁性納米粒子能夠很方便地和底液分離，具 有操作簡便和分離效率高的優(yōu)點(diǎn)。此外，PAA四氧化三鐵磁性納米粒子具有大 的比表面積，為修飾多種高密度分子探針提供了基礎(chǔ)，在細(xì)胞分離、蛋白質(zhì)純 化及DNA分離檢測等領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景。
總的來說，磁性納米粒子的制備方法可以分為物理法、生物法和化學(xué)法。 其中物理法以機(jī)械球磨法為主要代表，球磨法是將微米或亞微米的粒子進(jìn)行長 時(shí)間研磨，然后分散到油基介質(zhì)中而得，這種制備方法得到的粒子的粒徑分布 比較寬，同時(shí)這種制備方法所消耗的時(shí)間也比較長。磁性納米粒子的生物制備 法主要是指磁性納米粒子廣泛地存在于各種生物體如細(xì)菌，鴿子等體內(nèi)，利用 生物法制備的粒子粒徑比較均一且形貌規(guī)則，缺點(diǎn)在于細(xì)菌培養(yǎng)較為困難，粒 子提取的過程也較為繁瑣。所以目前來說，對于研究磁性納米粒子的合成主要 還限于化學(xué)法制備的磁性納米粒子，磁性納米材料的化學(xué)合成法又可以分為均 相制備法和非均相制備法，其中均相制備法包括共沉淀法和高溫分解法，非均相 制備方法有微乳液法、溶膠-凝膠法、超聲化學(xué)法、激光分解法和電化學(xué)沉積法 等。
本發(fā)明采用高溫分解法研制粒徑均一、磁響應(yīng)性強(qiáng)的生物相容性PAA四氧 化三鐵磁性納米粒子，應(yīng)用于細(xì)胞DNA的提取純化。
傳統(tǒng)的DNA分離純化方法不僅需接觸多種有機(jī)溶劑和有毒試劑，而且步驟 繁雜難以控制。PAA四氧化三鐵磁性納米粒子可以通過其表面羧基與DNA分 子結(jié)合，再用緩沖液洗脫即可得到純化率較高的DNA分子。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種PAA四氧化三鐵磁性納米粒子的制備方法，制 備的粒子粒徑均一、磁響應(yīng)性強(qiáng)，具有良好的生物相容性，可用于細(xì)胞DNA的 提取純化，操作方法簡便易行。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種聚丙烯酸PAA包覆四氧化三鐵磁性納米粒子的制 備方法，采用高溫分解法合成，化學(xué)反應(yīng)流程為
FeCl3—Fe(OH)3— Fe(OH)2—Fe304
步驟如下
(1) 稱量lOOmmol的NaOH溶于20mL 二甘醇(DEG)中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下 油浴12(TC加熱lh，攪拌使NaOH全部溶解，得到淡黃色膠狀NaOH的DEG液 體，7(TC密封保存；
(2) 稱量10mmol的PAA和4mmolFeCl3粉末，溶于20mLDEG中，氮?dú)獗Ｗo(hù) 下油浴22(TC加熱回流2h后，加入15mL NaOH的DEG液體，繼續(xù)22(TC加熱回流 反應(yīng)2h，得到黑色粘稠的膠體液，終止反應(yīng)，靜置冷卻，得反應(yīng)液；
(3) 取反應(yīng)液于離心管中，加入5倍反應(yīng)液體積的無水乙醇，8000rpm離心 5min，重復(fù)洗滌3次，沉淀用去離子水洗漆2次，分散于反應(yīng)液相等體積的去離 子水中；
(4) 用0.22pm膜過濾，制得聚丙烯酸包覆四氧化三鐵磁性納米粒子。 本方法制備的PAA四氧化三鐵磁性納米粒子為球形，平均粒徑在10nm左右，
磁響應(yīng)性強(qiáng)，分散性好，在水和生理鹽水中較穩(wěn)定。
制備得到的PAA包覆四氧化三鐵磁性納米粒子的應(yīng)用，用于細(xì)胞DNA的分 離純化，步驟如下
(1) 2mL細(xì)胞，1000rpm離心5min，棄上清，加生理鹽水5mL，離心2次；
(2) 離心后的細(xì)胞加5pL細(xì)胞裂解液(3MNaCl、 5M尿素Urea、 40g/LTriton X-IOO、 10mM乙二胺四乙酸EDTA、 pH6.5的25mMTris-HCl)混勻，加25pg/^iL的 蛋白酶K 10[iL及40ng/^iL的RNA酶5(iL， 37 。C孵育30min，加入18mg/mL的PAA 包覆四氧化三鐵磁性納米粒子1(VL，靜置2min，加異丙醇靜置2min，磁分離， 加質(zhì)量濃度70%乙醇，磁分離，棄上清，加Tris-EDTA緩沖液，孵育5min，磁分 離，取上清，即為DNA洗脫液；
(3) 紫外測得OD26o/OD28Q的比值，并取2pL瓊脂糖凝膠電泳。
PAA四氧化三鐵磁性納米粒子用于細(xì)胞DNA的提取純化，減少有機(jī)溶劑的 使用，與傳統(tǒng)的DNA分離方法相比克服了接觸有毒試劑、步驟復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、費(fèi) 力等缺點(diǎn)。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種高溫分解法制備PAA四氧化三鐵磁 性納米粒子，制備的磁性納米粒子用于細(xì)胞DNA高效提取純化，大大提高了提 取率，操作更加簡便。建立在磁性納米粒子基礎(chǔ)上的DNA純化方法無論是分離
4效率還是DNA收率都不遜于傳統(tǒng)方法。


圖l PAA四氧化三鐵磁性納米粒子的透射電鏡圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l PAA四氧化三鐵磁性納米粒子的制備 采用高溫分解法合成，其化學(xué)反應(yīng)為-FeCl3—Fe(OH)3— Fe(OH)2—Fe304
步驟如下
(1) 稱量4gNaOH (lOOmmol)溶于20mL 二甘醇(DEG)中，在氮?dú)獗Ｗo(hù) 下油浴12(TC加熱lh，攪拌使NaOH全部溶解，得到淡黃色膠狀液，水浴70°C 密封保存。
(2) 稱量720mg PAA(10 mmol)和648.84mg FeCl3 (4 mmol)粉末，溶于20mL DEG中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下油浴22(TC加熱回流2h后，加入已制備保存的15mLNaOH的 DEG液體，繼續(xù)加熱回流反應(yīng)2h，得到黑色粘稠的膠體液，終止反應(yīng)，靜置冷卻。
(3) 取2mL反應(yīng)液于離心管中，加入10mL無水乙醇，8000rpm離心5min，洗 滌3次，沉淀用去離子水洗滌2次，分散于2mL去離子水中。
(4) 0.22pm膜過濾。
上述方法制備的PAA四氧化三鐵磁性納米粒子為球形，平均粒徑在10nm左 右，磁響應(yīng)性強(qiáng)，分散性好，在水和生理鹽水中較穩(wěn)定?？捎糜诩?xì)胞DNA的分 離純化。
實(shí)施例2細(xì)胞DNA的提取純化 步驟如下
(1) 2mL細(xì)胞，1000rpm離心5min，棄上清，力Q5mL生理鹽水，離心2次；
(2) 離心后的細(xì)胞加5卩iL細(xì)胞裂解液(3MNaCl、 5MUrea、 40g/LTriton X-IOO、 10mMEDTA、 pH6.5的25mMTris-HCl)混勻，加10^iL蛋白酶K(25iig/(iL) 及5jLiLRNA酶(40iig/VL) ， 37 。C孵育30min，加入l(HiL磁性粒子(18mg/mL)靜置 2min ，加異丙醇20pL靜置2min，磁分離，加70%乙醇20^，磁分離，棄上清， 加Tris-EDTA緩沖液20jiL， 37 。C孵育5min，磁分離，取上清，即為DNA洗脫液。
(3) 紫外測得OD26o/OD28Q的比值，并取2pL瓊脂糖凝膠電泳。
權(quán)利要求
1、一種聚丙烯酸PAA包覆四氧化三鐵磁性納米粒子的制備方法，其特征在于采用高溫分解法合成，其化學(xué)反應(yīng)為FeCl3→Fe(OH)3→Fe(OH)2→Fe3O4步驟如下(1)稱量100mmol的NaOH溶于20mL二甘醇DEG中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下油浴120℃加熱1h，攪拌使NaOH全部溶解，得到淡黃色膠狀NaOH的DEG液體，70℃密封保存；(2)稱量10mmol的PAA和4mmol FeCl3粉末，溶于20mL DEG中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下油浴220℃加熱回流2h后，加入15mL NaOH的DEG液體，繼續(xù)220℃加熱回流反應(yīng)2h，得到黑色粘稠的膠體液，終止反應(yīng)，靜置冷卻，得反應(yīng)液；(3)取反應(yīng)液于離心管中，加入5倍反應(yīng)液體積的無水乙醇，8000rpm離心5min，重復(fù)洗滌3次，沉淀用去離子水洗滌2次，分散于反應(yīng)液相等體積的去離子水中；(4)用0.22μm膜過濾，制得聚丙烯酸包覆四氧化三鐵磁性納米粒子。
2、 權(quán)利要求1方法制備得到的PAA包覆四氧化三鐵磁性納米粒子的應(yīng)用， 其特征在于用于細(xì)胞DNA的分離純化，步驟如下(1) 2mL細(xì)胞，1000rpm離心5min，棄上清，加生理鹽水5mL，離心2次；(2) 離心后的細(xì)胞加5pL細(xì)胞裂解液混勻，細(xì)胞裂解液組成為含3MNaCl、 5M尿素、40g/L Triton X-100、 10mM乙二胺四乙酸、pH 6.5的25mM Tris-HCl 緩沖液，加25pg/iiL的蛋白酶Kl(HiL及40(xg/ixL的RNA酶5pL， 37'C孵育 30min，加入18mg/mL的PAA包覆四氧化三鐵磁性納米粒子10^iL，靜置2min，加 異丙醇20)aL靜置2min，磁分離，加質(zhì)量濃度70。/。的乙醇20nL，磁分離，棄上清， 加Tris-EDTA緩沖液20iiL， 37 。C孵育5min，磁分離，取上清，即為DNA洗脫液；(3) 紫外測得OD26Q/OD28()的比值，并取2pL瓊脂糖凝膠電泳。
全文摘要
聚丙烯酸(PAA)包覆四氧化三鐵磁性納米粒子的制備及其應(yīng)用，屬于納米材料和生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括PAA四氧化三鐵磁性納米粒子的制備方法以及PAA四氧化三鐵磁性納米粒子用于細(xì)胞DNA的提取純化。本發(fā)明提供了一種高溫分解法制備PAA四氧化三鐵磁性納米粒子的方法，制備的磁性納米粒子用于細(xì)胞DNA高效提取純化，大大提高提取率，且操作更加簡便。建立在磁性納米粒子基礎(chǔ)上的DNA純化方法無論是分離效率還是DNA收率都不遜于傳統(tǒng)方法。
文檔編號B01J13/02GK101612541SQ20091018203
公開日2009年12月30日 申請日期2009年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日
發(fā)明者劉微波, 華 匡, 彭池方, 胥傳來, 媛 趙, 偉 陳 申請人:江南大學(xué)