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利用微接觸印刷工藝在基材上圖案化分子的方法

文檔序號:5031552閱讀:443來源:國知局
專利名稱:利用微接觸印刷工藝在基材上圖案化分子的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及利用微接觸印刷工藝在基材上圖案化分子的方法、通過所述方法制造的基材以及所述基材的應(yīng)用。還涉及用于執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法的設(shè)備。
背景技術(shù)
在過去十年中,軟平版印刷術(shù)已經(jīng)發(fā)展成了用于化學(xué)法制造微結(jié)構(gòu)和毫微結(jié)構(gòu)表面的通用工藝[1,2]。在幾種被統(tǒng)稱為軟平版印刷術(shù)的工藝中,微接觸印刷(μCP)已經(jīng)成為最常用的方法[1]。圖案化聚合物印模(stamp)是采用接觸供墨或濕供墨被分子墨水覆蓋的。在接觸供墨中,溶劑被減縮到干態(tài),同時(shí)分子自組裝在印臺(ink-pad)上。通過使印模與印臺發(fā)生共形接觸(conformal contact),分子在環(huán)境條件下轉(zhuǎn)移到印模上。在濕供墨法中,墨水被傾注在印模上,然后在氮?dú)饬飨卤粶p縮到干態(tài)。上述兩種情形下,分子在被轉(zhuǎn)移到基材上之前都位于印模之上。為了將墨水轉(zhuǎn)移到基材上,使印模與基材發(fā)生共形接觸,以完成分子從印模到基材的轉(zhuǎn)移[3,4]。
近來,蛋白質(zhì)也被轉(zhuǎn)移到各種基材上[5-7]。因此,μCP的優(yōu)點(diǎn)在于蛋白質(zhì)的直接、快速和平緩轉(zhuǎn)移,不過,目前報(bào)告的所有μCP技術(shù)最終都會導(dǎo)致印刷的蛋白質(zhì)的變性。被固定到改性表面上的天然蛋白質(zhì)對于傳感器技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)和微生物學(xué)來說至關(guān)重要。一個(gè)應(yīng)用是例如在二氧化硅上用于引導(dǎo)細(xì)胞生長的生長因子蛋白質(zhì)的圖案化[8]。
在表面上固定生物分子例如蛋白質(zhì)、核酸等等的關(guān)鍵問題在于它們的變性和由此在其固定之后喪失功能。所述功能,例如對于細(xì)胞色素c(cyt c)來說,可能取決于表面上的蛋白質(zhì)的取向和構(gòu)象。到目前為止,已經(jīng)在化學(xué)改性的Au表面[9-11]和ITO[12]上研究了cyt c的固定和氧化還原活性。Runge等人報(bào)告了將cyt c分子轉(zhuǎn)移到ITO表面上的方法,其中蛋白質(zhì)在印模上被干燥[12]。對于ITO表面,可證實(shí)蛋白質(zhì)的活性取決于用于所述方法的印模的表面改性[11]。
除了轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)之外,Nakao等人還描述了使用PDMS印模轉(zhuǎn)印高度取向的DNA納米線的方法[13]。在此方法中流體動力被用于在PDMS上取向DNA。在取向步驟之后,使PDMS印模與云母片發(fā)生共形接觸以將DNA轉(zhuǎn)移到云母上。AFM圖像表明如此轉(zhuǎn)移的DNA的視在高度在0.27nm和0.35nm之間,這表明由于流體動力的結(jié)果DNA分子可能被拉長了且可能受到了剪切。
但是,現(xiàn)有技術(shù)中使用的所有上述供墨方法都會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性并喪失其活性。

發(fā)明內(nèi)容
因此,本發(fā)明的目的在于提供一種允許在基片上固定和圖案化分子的方法,從而使要圖案化和固定的分子保持其功能和/或天然構(gòu)象和/或活性。此外,本發(fā)明的目的還在于提供一種甚至對生物大分子也簡單易行的在基片上圖案化分子并同時(shí)保持其功能的方法。此外,本發(fā)明的目的還在于提供在基片上圖案化分子的方法,借此可以獲得≤200nm的圖案特征。
所有這些目的都可以通過一種利用微接觸印刷工藝在基片上圖案化分子的方法來達(dá)到,通過該方法在整個(gè)微接觸印刷工藝過程中使要圖案化的分子被保持在溶劑中或被溶劑覆蓋。
這種在整個(gè)工藝過程中使要圖案化的分子都被保持在溶劑中或被溶劑覆蓋的微接觸印刷工藝在本文中有時(shí)也被稱作″原地印刷法″或″原地壓印法″。術(shù)語″原地印刷法″或″原地壓印法″在本文中是指使要圖案化的分子由于在整個(gè)印刷工藝過程中都被保持在溶劑中或被溶劑覆蓋的結(jié)果而能保留其功能和/或構(gòu)象的微接觸印刷法。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述″原地印刷法″是指在其整個(gè)過程中使要圖案化的分子都被保持在使其可以保留其天然功能和/或構(gòu)象的其各自的生理?xiàng)l件下的微接觸印刷法。應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào),術(shù)語″生理?xiàng)l件″將取決于要被圖案化的分子的類型。例如,如果要圖案化的分子是氧轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子,對于這樣一種分子來說″生理?xiàng)l件″將優(yōu)選地包括7.0-7.8的pH值,優(yōu)選在pH 7.4左右。另一方面,如果要圖案化的分子是胃酶,對于這樣一種分子來說″生理?xiàng)l件″將包括1.8-4的pH值。因此,總的來說術(shù)語″生理?xiàng)l件″將包括可為1-10的pH值。
在一個(gè)實(shí)施方案中,所述微接觸印刷法不包括干燥步驟。
在一個(gè)實(shí)施方案中,根據(jù)本發(fā)明的方法包括以下步驟a)提供在溶劑中的將要圖案化的分子,和提供圖案化的表面,優(yōu)選地是印模形式的表面,b)在將所述分子保持在所述溶劑中或被所述溶劑覆蓋的同時(shí)將所述要圖案化的分子轉(zhuǎn)移到所述圖案化的表面上并將它們固定于其上,c)提供基材并使具有固定在其上的所述分子的所述圖案化的表面與所述基材發(fā)生共形接觸,由此在所述基材上建立所述分子的圖案,同時(shí)使所述分子保持在所述溶劑中或被所述溶劑覆蓋。
術(shù)語″與某某發(fā)生共形接觸″是指兩個(gè)實(shí)體例如表面之間的接觸,它允許在接觸前位于其中一個(gè)實(shí)體上的分子向另一個(gè)實(shí)體轉(zhuǎn)移。在某些實(shí)施方案中,要實(shí)現(xiàn)所述轉(zhuǎn)移需要施加壓力,而且在這種情況下,術(shù)語″與某某發(fā)生共形接觸″將等同于″壓在某某上″。
術(shù)語″將分子固定在表面上″在本文中是指使分子變得附著到表面上的行為,并不是指由此固定的分子將完全不能移動。例如,由此固定的分子的某些部分將仍可以繞某些化學(xué)鍵旋轉(zhuǎn)和/或可以在覆蓋該表面的溶劑之內(nèi)″搖擺″?!骞潭ā逶诒疚闹袃H表示分子向表面的某種附著,這種附著能防止分子從所述表面自由擴(kuò)散。最簡單的表現(xiàn)形式為,分子在表面上的這種固定可能通過將所述表面暴露于所述分子而發(fā)生。
在一個(gè)實(shí)施方案中,在步驟a)中,在所述溶劑中提供所述分子并首先將其固定在位于所述溶劑之內(nèi)的優(yōu)選地為非圖案化表面形式的印臺上,其中,優(yōu)選地,在步驟b)使具有固定于其上的所述分子的所述印臺與所述圖案化表面在含有將所述要圖案化的分子的第一溶劑環(huán)境中發(fā)生共形接觸,所述溶劑和任選地緩沖劑由此將所述分子轉(zhuǎn)移到所述圖案化的表面上并將它們固定于其上,且其中更優(yōu)選地,在步驟c),在含有所述溶劑和任選地緩沖劑的第二溶劑環(huán)境中提供所述基材,且其中具有固定于其上的所述分子的所述圖案化表面在步驟b)之后被轉(zhuǎn)移到所述第二溶劑環(huán)境中并與所述基材發(fā)生共形接觸。第一、第二和隨后的溶劑環(huán)境含有溶劑并可以除此之外還含有溶質(zhì),如鹽,優(yōu)選地緩沖劑,更優(yōu)選地通過其存在可以建立起生理?xiàng)l件或建立起模仿生理狀態(tài)的條件的緩沖劑。第二和隨后的溶劑環(huán)境最初不包含或只包含極少量的要被圖案化的分子。不過,一旦圖案化表面或印臺已經(jīng)轉(zhuǎn)移到所述第二、第三、第四等溶劑環(huán)境中,就將有一些要圖案化的分子存在于所述溶劑環(huán)境中。
術(shù)語″印臺″在本文中代表能夠充當(dāng)要圖案化的分子的促進(jìn)轉(zhuǎn)移表面的任何表面。其最簡單的形式可以僅僅是非圖案化的表面。不過,在某些條件下,它也可以是上面具有圖案的,和/或能夠吸收要圖案化的分子并在印模與所述印臺發(fā)生共形接觸時(shí)能夠釋放一些這些分子的某種表面。
在一個(gè)實(shí)施方案中,在步驟b)中,在將具有固定于其上的所述分子的所述印臺轉(zhuǎn)移到含有所述溶劑和任選地緩沖劑的第二溶劑環(huán)境中之后,使具有固定于其上的所述分子的所述印臺與所述圖案化表面在所述第二溶劑環(huán)境中發(fā)生共形接觸,從而將所述分子轉(zhuǎn)移到所述圖案化的表面上并將它們固定于其上,其中優(yōu)選地,在步驟c),在含有所述溶劑和任選地緩沖劑的第三溶劑環(huán)境中提供所述基材,且其中具有固定于其上的所述分子的所述圖案化表面在步驟b)之后被轉(zhuǎn)移到所述第三溶劑環(huán)境中并與所述基材發(fā)生共形接觸。
在一個(gè)實(shí)施方案中,在步驟a)中,在所述溶劑中提供所述分子,且在步驟b),在所述溶劑之內(nèi)將所述分子固定在所述圖案化表面上,其中優(yōu)選地,步驟b)通過將所述圖案化表面浸入所述溶劑中而發(fā)生,且其中更優(yōu)選地,在步驟c),在含有所述溶劑和任選地緩沖劑的第四溶劑環(huán)境中提供所述基材,且其中具有固定于其上的所述分子的所述圖案化表面在步驟b)之后被轉(zhuǎn)移到所述第四溶劑環(huán)境中并與所述基材發(fā)生共形接觸。
在一個(gè)實(shí)施方案中,在步驟c)無需溶劑環(huán)境而提供所述基材,且其中在保持所述分子被所述溶劑覆蓋的同時(shí)使具有固定于其上的所述分子的所述圖案化表面與所述基材發(fā)生共形接觸,且其中在與所述基材接觸的同時(shí)所述圖案化表面被轉(zhuǎn)移到含有所述溶劑和任選地緩沖劑的第五溶劑環(huán)境中,所述圖案化表面與所述基材的轉(zhuǎn)移在所述圖案化表面與所述基材發(fā)生共形接觸之后立即發(fā)生,以避免所述圖案化表面在所述基材上干燥。
在一個(gè)實(shí)施方案中,所述步驟b)在1秒-60分的時(shí)間段內(nèi)執(zhí)行。步驟b)可被視為″供墨步驟″。
優(yōu)選地,步驟c)中使所述圖案化表面與所述基材共形接觸發(fā)生在將所述要圖案化的分子固定在所述圖案化表面上之后不長于180min、優(yōu)選地不長于120min、更優(yōu)選地不長于10min、最優(yōu)選地不長于1min的時(shí)間段內(nèi)。
在本文中,″發(fā)生在固定......之后不長于......的一段時(shí)間內(nèi)″是指所述使進(jìn)行共形接觸必須在最長180min的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行,所述時(shí)間段從所述要圖案化的分子被固定在所述圖案化表面上時(shí)開始。
在一個(gè)實(shí)施方案中,在步驟c)之后,所述圖案化表面被從所述基材上提起,從而留下其上具有所述分子的圖案的基材,其中優(yōu)選地,所述其上具有分子圖案的基材被保持在任選地含有緩沖劑的溶劑中或被其覆蓋。
在一個(gè)實(shí)施方案中,要被圖案化的所述分子選自蛋白質(zhì)、核酸,優(yōu)選地DNA或RNA,脂質(zhì),以及上述物質(zhì)的組合,其中優(yōu)選地,要被圖案化的所述分子是蛋白質(zhì)分子。
優(yōu)選地,由于在整個(gè)微接觸印刷工藝過程中所述要圖案化的分子都被保持在溶劑中或被溶劑覆蓋,所以它們在整個(gè)工藝過程中都保留其功能和/或活性和/或天然構(gòu)象,其中更優(yōu)選地,所述要圖案化的分子在整個(gè)微接觸印刷工藝過程中都被保持在由例如pH和鹽度度量的生理?xiàng)l件下。
在本文中術(shù)語″溶質(zhì)″并不排除溶質(zhì)存在于溶劑中。事實(shí)上,為了建立期望的生理?xiàng)l件這些可能是優(yōu)選的。這些溶質(zhì)包括但不限于鹽及其離子組分、緩沖劑、蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施方案中,如果所述要圖案化的分子是親水性的則所述基材具有親水性表面,如果所述要圖案化的分子是疏水性的則所述基材具有疏水性表面。
優(yōu)選地,所述基材具有能促進(jìn)所述基材通過共價(jià)鍵、靜電力、范德華力、氫鍵、倫敦力或它們的任意組合與所述要圖案化的分子結(jié)合的隔離層和/或粘合層。
在一個(gè)實(shí)施方案中,所述基材選自金屬和半金屬、單晶或多晶材料;優(yōu)選單晶或多晶金屬和半金屬(最優(yōu)選金、鉑、硅)或復(fù)合材料,優(yōu)選單晶或多晶復(fù)合材料(最優(yōu)選氧化硅,GaAs)或非晶態(tài)復(fù)合材料(最優(yōu)選玻璃);塑料,優(yōu)選彈性體(最優(yōu)選聚二甲基硅氧烷),優(yōu)選塑性體(最優(yōu)選聚烯烴),優(yōu)選離子聚合物、優(yōu)選抗蝕劑(resist)材料(最優(yōu)選UV-NIL抗蝕劑);用分子層、優(yōu)選地用SAM(自組裝單分子層)改性以直接結(jié)合或間接結(jié)合的任何上述材料,用于間接結(jié)合的SAM將具有一或多種化學(xué)制劑或處理以實(shí)現(xiàn)期望的結(jié)合部位;最優(yōu)選具有兩個(gè)端基的SAM一個(gè)用于將分子附著到基材上,如用于在金上結(jié)合的硫醇首基;最優(yōu)選具有用于結(jié)合在氧化硅上的硅烷首基端基的SAM;第二個(gè)端基用于偶聯(lián)墨水,例如具有用于結(jié)合金屬的巰基或氨基的SAM,具有用于靜電結(jié)合的羧基的SAM,最優(yōu)選具有用于結(jié)合金屬的巰基、具有帶用于范德華相互作用的亞甲基的平滑烷鏈、具有用于共價(jià)連接的-COOH、-OH或乙烯基的SAM;或具有用于結(jié)合相應(yīng)抗原的抗體的SAM,或具有用于結(jié)合相應(yīng)抗體的抗原的SAM,或具有用于特異結(jié)合分子的受體的SAM;或用帶有用于結(jié)合相應(yīng)抗原的抗體的分子層改性的、或用帶有用于結(jié)合相應(yīng)抗體的抗原的分子層改性的、或用帶有用于特異結(jié)合分子的受體的分子層改性的任何上述材料;最優(yōu)選用巰基十一烷酸層(MUA)改性的金。
優(yōu)選地,所述圖案化表面由選自以下的材料制成單晶和多晶材料如硅、氧化硅,層壓復(fù)合材料體系如硅上的氧化硅,硅/氧化硅上的金屬層;非晶態(tài)材料如玻璃;塑料,如彈性體,優(yōu)選聚二甲硅氧烷,塑性體,優(yōu)選聚烯烴(POP,聚烯烴塑性體),離子聚合物,抗蝕劑材料如UV-NIL抗蝕劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中,所述印臺表面由選自以下的材料制成單晶和多晶材料如硅、氧化硅,層壓復(fù)合材料體系如硅上的氧化硅,硅/氧化硅上的金屬層;非晶態(tài)材料如玻璃;塑料,如彈性體,優(yōu)選聚二甲硅氧烷,塑性體,優(yōu)選聚烯烴(POP,聚烯烴塑性體),離子聚合物,抗蝕劑材料如UV-NIL抗蝕劑。
優(yōu)選地,所述要圖案化的分子選自蛋白質(zhì)分子如氧化還原蛋白質(zhì)、核酸結(jié)合蛋白質(zhì)、酶,金屬蛋白質(zhì)如細(xì)胞色素c、阿祖林、細(xì)胞支架蛋白質(zhì)、抗體、核酸如DNA、RNA、PNA,脂質(zhì)如磷脂和神經(jīng)鞘脂。
在一個(gè)實(shí)施方案中,所述要圖案化的分子是具有一個(gè)或幾個(gè)賴氨酸殘基的蛋白質(zhì)分子,且其中所述基材為金,優(yōu)選地在其表面上具有隔離層以避免所述蛋白質(zhì)的變性,所述隔離層的厚度優(yōu)選地在0.5nm-200nm的范圍之內(nèi)。
在一個(gè)實(shí)施方案中,圖案包含長度為約10nm到500μm,優(yōu)選地約10nm到≤200nm,更優(yōu)選地約10nm到≤150nm的特征。顯然,通過根據(jù)本發(fā)明的方法印刷的實(shí)際特征的尺寸取決于由此印刷的圖案的預(yù)期應(yīng)用。例如,如果預(yù)期應(yīng)用在核酸芯片或傳感器應(yīng)用領(lǐng)域,則印刷特征的平均尺寸可能在1μm到500μm的范圍之內(nèi)。如果預(yù)期應(yīng)用在分子電子學(xué)領(lǐng)域,則印刷特征的平均尺寸可能在約10納米到≤200nm,優(yōu)選地約10nm到≤150nm的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的目的也可通過由根據(jù)本發(fā)明的方法制造并在其上包含能保持其功能和/或活性和/或天然構(gòu)象的分子的圖案的基材來達(dá)到。
本發(fā)明的目的還可以通過在傳感器、生物反應(yīng)器中或在引導(dǎo)細(xì)胞生長時(shí)使用根據(jù)本發(fā)明的基材來達(dá)到。
本發(fā)明的目的也可通過一種用于執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明方法的設(shè)備來達(dá)到,該設(shè)備包括-容納要圖案化的分子的溶液的第一裝置,-圖案化的表面,優(yōu)選地是印模形式的,-基材,被保持在溶劑中或被溶劑覆蓋,-用于將所述要圖案化的分子從所述第一裝置轉(zhuǎn)移到所述圖案化表面的第二裝置,-用于將所述要圖案化的分子從所述圖案化表面轉(zhuǎn)移到所述基材的第三裝置,-用于保證所述要圖案化的分子在從所述第一裝置轉(zhuǎn)移到所述圖案化表面再到所述基材的過程中被保持在溶劑中或被溶劑覆蓋的第四裝置。
在根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的優(yōu)選實(shí)施方案中,第二裝置是印臺,優(yōu)選未圖案化的表面。
發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)可以利用分子、優(yōu)選地生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸和/或脂質(zhì)并將這些生物大分子始終保持在溶液中或溶劑(優(yōu)選地水性溶劑)之下來執(zhí)行微接觸印刷工藝。根據(jù)本發(fā)明的方法可以采用下面進(jìn)一步所列的各種方案來進(jìn)行。
在這里術(shù)語″分子″是指可以具有生物相關(guān)性的任何分子。它包括包括低聚核苷酸在內(nèi)的核酸,包括肽在內(nèi)的蛋白質(zhì),和脂質(zhì)。所述分子可以是合成的也可以是天然的。對蛋白質(zhì)或核酸來說,它們可以具有天然存在的序列或人工序列。
因此本發(fā)明的發(fā)明人描述了一種可以防止在供墨步驟之后分子例如蛋白質(zhì)在印模上干燥或變性的原地壓印工藝。在此μCP工藝中,在所有工藝步驟中印模、印臺(如果有的話)和基材都被保持在溶劑環(huán)境例如緩沖溶液中或至少被緩沖溶液覆蓋。由此所有步驟都可以在原地生理?xiàng)l件下進(jìn)行。
在一方面,本發(fā)明的方法可以通過如下進(jìn)一步說明的各種工藝描述工藝1(參見圖4的方案1)將印臺浸在所需分子的溶液中。幾小時(shí)之后,在同一容器中立即使印模與該印臺接觸幾分鐘。然后將印模迅速轉(zhuǎn)移到盛有純緩沖溶液的容器中,使得印模的表面并未干燥。此緩沖溶液中含有將把分子轉(zhuǎn)移到其上的基材。使印模與基材接觸幾分鐘。最后將改性的基材插入不含要印刷/壓印的分子的緩沖溶液中保存。
工藝2(參見圖4的方案2)將印臺浸在所需分子的溶液中。幾小時(shí)之后,將印臺迅速轉(zhuǎn)移到盛有純緩沖溶液的容器中,使得印臺的表面并未干燥。立即使印模與印臺接觸幾分鐘。然后將印模迅速轉(zhuǎn)移到盛有純緩沖溶液的另一容器中,該容器中含有目標(biāo)基材。將印模在基材上壓幾分鐘。最后將改性的基材插入不含要印刷/壓印的分子的緩沖溶液中保存。
工藝3(參見方案3)將印模浸在所需分子的溶液中。分子吸附到印模表面。幾小時(shí)之后,將印模迅速轉(zhuǎn)移到盛有純緩沖溶液的容器中,使得印模的表面并未干燥。此緩沖溶液中含有將把分子轉(zhuǎn)移到其上的基材。使印模與基材接觸幾分鐘。最后將改性的基材插入不含要印刷/壓印的分子的無蛋白質(zhì)緩沖溶液中保存。
工藝4(參見方案4)使其上已經(jīng)固定了要被壓印的分子的方案1、2或3的印模在將其從墨水溶液中取出之后立即與基材在環(huán)境條件下接觸。這必須在印模是濕的條件下完成。將印模與附著的基材立即放入盛有純緩沖溶液的容器中。幾分鐘之后轉(zhuǎn)移完成。最后將改性的基材插入不含要印刷/壓印的分子的緩沖溶液中保存。
在下文中,參照附圖進(jìn)行說明


圖1cyt c在(MUA)/金上的SEM圖像。所示線為1μm到150nm,并且之間具有相等間距。暗線是cyt c分子。
圖2cyt c在MUA/金上的循環(huán)伏安曲線(掃描速率5OmV/s;參比電極SCE)。不含cyt c(-)、從溶液中吸附的cyt c(▲)、在原地壓印或印刷后的cyt c(■)和在環(huán)境壓印或印刷后的cyt c(·)的參考基材。
圖3cyt c在MUA/金上的循環(huán)伏安曲線(掃描速率5OmV/s;參比電極SCE)。比較了印模在接觸基材之前于緩沖容器中保持的不同時(shí)間,即5s(■)、10min(▲)和2h(-)。
圖4顯示了本發(fā)明的不同具體實(shí)施方案1-4的示意圖。
具體實(shí)施例方式
更具體地說,圖4及其中所示的方案可以總結(jié)如下方案1原地微接觸印刷工藝的示意圖。將印臺放入細(xì)胞色素c緩沖溶液中2h。將印模在印臺上放置2min。將印模取出并無需干燥而與緩沖溶液迅速接觸。被浸入緩沖溶液的是被疏基十一烷酸SAM覆蓋的金基材。使印模與基材共形接觸2min然后脫離。
方案2原地微接觸印刷工藝的示意圖。將印臺浸入含有所需分子的溶液中。幾小時(shí)之后將印臺迅速轉(zhuǎn)移到盛有緩沖溶液的容器中。立即使印模與印臺接觸幾分鐘。隨后將印模轉(zhuǎn)移到盛有緩沖溶液的容器中,該容器中還含有目標(biāo)基材。將印模壓在基材上幾分鐘隨后脫離。
方案3原地微接觸印刷工藝的示意圖。將印模浸在所需分子的溶液中。分子吸附到印模表面。幾小時(shí)之后將印模迅速轉(zhuǎn)移到盛有純緩沖溶液的容器中,該容器中含有目標(biāo)基材。使印模與基材共形接觸幾分鐘,隨后脫離。
方案4使根據(jù)方案1、2或3制備的濕印模在將其從墨水溶液中取出之后立即與基材在環(huán)境條件下發(fā)生接觸。將印模與附著的基材立即浸入盛有純緩沖溶液的容器中。幾分鐘之后將印模與基材脫離。
此外,參考以下實(shí)施例,它們只用于說明而不用于限制本發(fā)明。
實(shí)施例A)印模和功能/結(jié)構(gòu)研究對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說很明顯的是,基材和印模的選擇取決于要圖案化的分子。例如對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說很明顯的是,如果要印刷核酸,則親水性和疏水性的基材是適合的。根據(jù)基材的親水性,DNA可以以束的形式(疏水性表面)或以單獨(dú)的股(親水性基材)固定。本領(lǐng)域技術(shù)人員還清楚,要將含有半胱氨酸基團(tuán)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到金上必須使用隔離層(例如巰基SAM)覆蓋裸露的金表面,以免半胱氨酸結(jié)合到金上使蛋白質(zhì)變性。另一方面本領(lǐng)域技術(shù)人員還清楚,親水性的多肽(具有不確定的叔碳和季碳結(jié)構(gòu))如多細(xì)胞溶素可被印刷到親水性的氧化硅表面上。本領(lǐng)域技術(shù)人員還清楚,印模材料的選擇取決于圖案尺寸。最小圖案尺寸強(qiáng)烈依賴于材料的拉伸模量,例如拉伸模量為1MPa的聚二甲基硅氧烷適于印刷直到300nm的圖案,而對于小于300nm的圖案,拉伸模量為1GPa的聚烯烴可能是適用的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還清楚,要大面積地印刷圖案的話,用柔性塑性材料制造的柔性印模比用任何其它材料制造的都更優(yōu)選,因?yàn)槿嵝杂∧D軌蛟谡麄€(gè)面積上都產(chǎn)生共形接觸。本領(lǐng)域技術(shù)人員還清楚,印模和基材的親水性以及要轉(zhuǎn)移的生物分子的溶解度決定著該生物分子與印臺、印模和基材的相互作用。
用于本工藝的印模通常由彈性體、塑性體、離子聚合物、抗蝕劑材料制成,也可以由硬質(zhì)材料如晶體和多晶材料制成。也可以使用這些材料的組合來制造復(fù)合印模(軟-軟、軟-硬以及硬-硬)。印模通過滴鑄和熱或光引發(fā)的固化或者通過熱壓印技術(shù)由原版(master)制造,其中根據(jù)需要所述原版用脫模層例如(1,1,2,2-十三氟-辛基)-三氯硅烷或十二烷硫酸鈉(SDS)的單層鈍化??梢酝ㄟ^將印模表面暴露于例如氧等離子或通過使其起化學(xué)反應(yīng)而對印模表面的表面進(jìn)行化學(xué)改性。
對于下面進(jìn)一步公開的具體實(shí)施方案,使用了來自Dow Chemicals的POP(聚烯烴塑性體)(Affinity VP 8770G)。將POP加熱到85℃并以90kPa的壓強(qiáng)壓入用(1,1,2,2,-十三氟-辛基)-三氯硅烷(Sigma Aldrich)鈍化的氧化硅(Sioxide)原版中。
所有具體實(shí)施方案都使用馬心細(xì)胞色素c作模型體系來進(jìn)行。
使用由運(yùn)行2.4版CorrWare軟件的PC控制的PAR Model 283恒電位儀來研究蛋白質(zhì)的氧化還原活性。工作電極是直徑3,5mm的金(l11)單晶圓柱體。為進(jìn)行測量,應(yīng)用了懸掛彎月面(hanging meniscus)法。在此方法中,通過形成彎月使單晶體的特定金屬面與電解質(zhì)發(fā)生接觸。將Au晶體在硫酸中清洗?;鹧嫱嘶鹬髮⒔?l11)晶體放入疏基十一酸(MUA)(Sigma-Aldrich)中10min,隨后用乙醇和MilliQ水(18.2MΩ,碳總量3-4ppm)沖洗。使用標(biāo)準(zhǔn)甘汞電極(SCE)作參考電極;反電極為鉑線圈。將裝置放在法拉第籠中以減少電子噪聲。
為SEM成像,將5nm的鉻層和50nm和金層蒸鍍到一片氧化硅晶片上。芯片也用硫酸進(jìn)行清洗,火焰退火并放入10mM的MUA(Sigma-Aldrich)的乙醇溶液中放置10min。
B)制備和印刷使用pH值為7濃度為3.26mM的磷酸鈉溶液(Na2HPO4/NaH2PO4)(Merck)作緩沖劑來準(zhǔn)備12.6μM的馬心cyt c(Sigma-Aldrich)溶液。將聚二甲硅氧烷(PDMS)(Sylgard184,Dow Coming)印臺浸入該cyt c溶液中。2h之后,將印模放入該溶液中并輕輕地壓在印臺上保持2min。印臺與印模一旦分開,立即將印模無需干燥就放入包含基材的緩沖溶液中,以用薄的濕膜覆蓋蛋白質(zhì),以在把印模從一種溶液轉(zhuǎn)移到另一種的過程中保持期望的生理?xiàng)l件。轉(zhuǎn)移時(shí)間小于5s。在將印模轉(zhuǎn)移到包含基材的溶液中之后,通過施加柔和的指壓使印模與基材共形接觸2min,以把蛋白質(zhì)從印模轉(zhuǎn)移到MUA改性的Au基材上。cyt c向MUASAM上的固定基于靜電作用。
MUA的酸基被去除質(zhì)子并由此帶上負(fù)電荷,而cyt c具有正的凈電荷。由于賴氨酸基團(tuán)的正電荷位于cyt c的一側(cè),所以cyt c在表面上的取向總是相同的。圖1顯示了轉(zhuǎn)移的圖案的SEM圖像。四個(gè)150nm寬的線被150nm寬的間隙(右側(cè))清楚地分開。轉(zhuǎn)移的線之間的空隙中沒有分子??床坏溅藽P的任何共同缺陷或缺點(diǎn)如墨水分子的流掛或擴(kuò)散。
C)循環(huán)伏安法測量采用循環(huán)伏安法測量用非結(jié)構(gòu)化的印模壓印到Au/Cr涂覆的硅/Sioxide晶片上的蛋白質(zhì)的氧化還原活性。蛋白質(zhì)以與B)中相同的方式壓印。在將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到基材上之后,將基材直接轉(zhuǎn)移到測量池中。圖2示出了根據(jù)本發(fā)明的原地μCP工藝(″原地印刷″)之后的cyt c與在環(huán)境條件(其中cyt c在印模上已經(jīng)干燥)下壓印的cyt c(“在環(huán)境條件下壓印”)、以及從溶液中吸附的cyt c(″溶液中的cyt c″)相比的循環(huán)伏安曲線。在所有情形下,都在E0=-60mV的氧化還原電勢處出現(xiàn)一個(gè)清楚且可逆的氧化還原峰。峰的對稱表明cyt c被吸附的到表面上。在氧化還原電勢處的電流與通過原地印刷和從溶液中吸附而制備的試樣相當(dāng),而在環(huán)境條件下觀測到的轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)的電流要小70%。這可能是由于較低的蛋白質(zhì)密度或干燥過程導(dǎo)致的功能部分損失而造成的。
工藝的一個(gè)重要方面似乎在于印模暴露于緩沖溶液未與基材發(fā)生共形接觸的持續(xù)時(shí)間。圖3顯示了轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)在印模暴露于緩沖溶液5s-120min(5s、10min和2h)之后轉(zhuǎn)移過程之前的氧化還原活性。印模暴露于緩沖溶液的時(shí)間越長,在氧化還原電勢下的電流越低。電流的降低是由印模上的表面覆蓋度下降所造成的。由于蛋白質(zhì)只是通過倫敦力弱吸附在印模表面上,濃度梯度驅(qū)使蛋白質(zhì)脫附到緩沖溶液中。
根據(jù)本發(fā)明的方法允許通過采用原地工藝將生物分子圖案化到小至150nm的尺寸并同時(shí)保持它們的結(jié)構(gòu)完整性和功能。
在說明書、權(quán)利要求書和/或附圖中所公開的本發(fā)明的特征即可以單獨(dú)又可以以其任意組合用于以其各種形式實(shí)施本發(fā)明。
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權(quán)利要求
1.一種利用微接觸印刷工藝在基片上圖案化分子的方法,通過該方法使將要圖案化的分子在整個(gè)微接觸印刷工藝過程中被保持在溶劑中或被溶劑覆蓋。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中所述微接觸印刷法中不存在干燥步驟。
3.根據(jù)上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法,包括以下步驟a)提供在溶劑中的將要圖案化的分子,和提供圖案化的表面,優(yōu)選地是印模形式的表面,b)在將所述分子保持在所述溶劑中或被所述溶劑覆蓋的同時(shí),將所述要圖案化的分子轉(zhuǎn)移到所述圖案化的表面上并將它們固定于其上,c)提供基材,并使具有固定在其上的所述分子的所述圖案化的表面與所述基材發(fā)生共形接觸,從而在所述基材上建立所述分子的圖案,同時(shí)將所述分子保持在所述溶劑中或被所述溶劑覆蓋。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法,其中在步驟a)中,在所述溶劑中提供所述分子并首先將其固定在位于所述溶劑之內(nèi)的優(yōu)選地為未圖案化的表面的形式的印臺上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法,其中在步驟b)中,使具有固定于其上的所述分子的所述印臺與所述圖案化表面在含有將要圖案化的所述分子、所述溶劑和任選地緩沖劑的第一溶劑環(huán)境中發(fā)生共形接觸,由此將所述分子轉(zhuǎn)移到所述圖案化的表面并將它們固定于其上。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法,其中在步驟c)中,在含有所述溶劑和任選地緩沖劑的第二溶劑環(huán)境中提供所述基材,且其中具有固定于其上的所述分子的所述圖案化表面在步驟b)之后被轉(zhuǎn)移到所述第二溶劑環(huán)境中并與所述基材發(fā)生共形接觸。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法,其中在步驟b)中,在將具有固定于其上的所述分子的所述印臺轉(zhuǎn)移到含有所述溶劑和任選地緩沖劑的第二溶劑環(huán)境中之后,使具有固定于其上的所述分子的所述印臺與所述圖案化表面在所述第二溶劑環(huán)境中發(fā)生共形接觸,從而將所述分子轉(zhuǎn)移到所述圖案化的表面并將它們固定于其上。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法,其中在步驟c)中,在含有所述溶劑和任選地緩沖劑的第三溶劑環(huán)境中提供所述基材,且其中具有固定于其上的所述分子的所述圖案化表面在步驟b)之后被轉(zhuǎn)移到所述第三溶劑環(huán)境中并與所述基材發(fā)生共形接觸。
9.根據(jù)權(quán)利要求3的方法,其中在步驟a)中,在所述溶劑中提供所述分子,且其中在步驟b)中,在所述溶劑之內(nèi)將所述分子固定在所述圖案化表面上。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法,其中步驟b)通過將所述圖案化表面浸入所述溶劑中而發(fā)生。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法,其中在步驟c)中,在含有所述溶劑和任選地緩沖劑的第四溶劑環(huán)境中提供所述基材,且其中具有固定于其上的所述分子的所述圖案化表面在步驟b)之后被轉(zhuǎn)移到所述第四溶劑環(huán)境中并與所述基材發(fā)生共形接觸。
12.根據(jù)權(quán)利要求3的方法,其中在步驟c)中無需溶劑環(huán)境而提供所述基材,且其中在保持所述分子被所述溶劑覆蓋的同時(shí),使具有固定于其上的所述分子的所述圖案化表面與所述基材發(fā)生共形接觸,且其中在與所述基材接觸的同時(shí),所述圖案化表面被轉(zhuǎn)移到含有所述溶劑和任選地緩沖劑的第五溶劑環(huán)境中,所述圖案化表面與所述基材的轉(zhuǎn)移在使所述圖案化表面與所述基材發(fā)生共形接觸之后立即發(fā)生,以避免所述圖案化表面在所述基材上干燥。
13.根據(jù)權(quán)利要求3-12中任何一項(xiàng)的方法,其中步驟c)中使所述圖案化表面與所述基材共形接觸發(fā)生在將所述要圖案化的分子固定在所述圖案化表面上之后不長于180min,優(yōu)選地不長于120min,更優(yōu)選地不長于10min,最優(yōu)選地不長于1min的時(shí)間段內(nèi)。
14.根據(jù)權(quán)利要求3-13中任何一項(xiàng)的方法,其中在步驟c)之后,所述圖案化表面被從所述基材上提起,從而留下其上具有所述分子的圖案的基材。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法,其中其上具有分子圖案的所述基材被保持在任選地含有緩沖劑的溶劑中或被其覆蓋。
16.根據(jù)上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法,其中所述要圖案化的分子選自蛋白質(zhì)、核酸,優(yōu)選DNA或RNA,脂質(zhì),以及上述物質(zhì)的組合。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法,其中要被圖案化的所述分子是蛋白質(zhì)分子。
18.根據(jù)上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法,其中由于在整個(gè)微接觸印刷工藝過程中所述要圖案化的分子都被保持在溶劑中或被溶劑覆蓋,所以它們在整個(gè)工藝過程中都保留其功能和/或活性和/或天然構(gòu)象。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法,其中所述要圖案化的分子在整個(gè)微接觸印刷工藝過程中都被保持在由例如pH和鹽度度量的生理?xiàng)l件下。
20.根據(jù)上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法,其中所述基材包括能促進(jìn)所述基材通過共價(jià)鍵、靜電力、范德華力、氫鍵、倫敦力或它們的任意組合而與所述要圖案化的分子結(jié)合的隔離層和/或粘合層。
21.根據(jù)上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法,其中所述基材選自金屬和半金屬、單晶或多晶材料;優(yōu)選地單晶或多晶金屬和半金屬(最優(yōu)選金、鉑、硅);或復(fù)合材料,優(yōu)選地單晶或多晶復(fù)合材料(最優(yōu)選氧化硅,GaAs)或非晶態(tài)復(fù)合材料(最優(yōu)選玻璃);塑料,優(yōu)選地彈性體(最優(yōu)選聚二甲基硅氧烷),優(yōu)選塑性體(最優(yōu)選聚烯烴),優(yōu)選地離子聚合物、優(yōu)選地抗蝕劑材料(最優(yōu)選UV-NIL抗蝕劑);用分子層、優(yōu)選SAM(自組裝單分子層)改性以直接結(jié)合或間接結(jié)合的任何上述材料,用于間接結(jié)合的SAM將具有一或多種化學(xué)制劑或處理以實(shí)現(xiàn)期望的結(jié)合部位;最優(yōu)選具有兩個(gè)端基的SAM一個(gè)端基用于將分子附著到基材上,如用于在金上結(jié)合的硫醇首基;最優(yōu)選具有用于結(jié)合在氧化硅上的硅烷首基端基的SAM;第二個(gè)端基用于偶聯(lián)墨水,例如具有用于結(jié)合金屬的巰基或氨基的SAM,具有用于靜電結(jié)合的羧基的SAM,最優(yōu)選具有用于結(jié)合金屬的巰基、具有帶用于范德華相互作用的亞甲基的平滑烷鏈、具有用于共價(jià)連接的-COOH、-OH或乙烯基的SAM;或具有用于結(jié)合相應(yīng)抗原的抗體的SAM,或具有用于結(jié)合相應(yīng)抗體的抗原的SAM,或具有用于特異結(jié)合分子的受體的SAM;或用帶有用于結(jié)合相應(yīng)抗原的抗體的分子層改性的、或用帶有用于結(jié)合相應(yīng)抗體的抗原的分子層改性的、或用帶有用于特異結(jié)合分子的受體的分子層改性的任何上述材料;最優(yōu)選用巰基十一烷酸層(MUA)改性的金。
22.根據(jù)權(quán)利要求3-21中任何一項(xiàng)的方法,其中所述圖案化表面由選自以下的材料制成單晶和多晶材料如硅、氧化硅,層壓復(fù)合材料體系如硅上的氧化硅、硅/氧化硅上的金屬層;非晶態(tài)材料如玻璃;塑料,如彈性體,優(yōu)選地聚二甲基硅氧烷,塑性體,優(yōu)選地聚烯烴(POP,聚烯烴塑性體),離子聚合物,抗蝕劑材料如UV-NIL抗蝕劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求3-22中任何一項(xiàng)的方法,其中所述印臺,優(yōu)選地至少所述印臺的表面,由選自以下的材料制成單晶和多晶材料如硅、氧化硅,層壓復(fù)合材料體系如硅上的氧化硅,硅/氧化硅上的金屬層;非晶態(tài)材料如玻璃;塑料,如彈性體,優(yōu)選地聚二甲基硅氧烷,塑性體,優(yōu)選地聚烯烴(POP,聚烯烴塑性體),離子聚合物,抗蝕劑材料,如UV-NIL抗蝕劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求3-23中任何一項(xiàng)的方法,其中所述要圖案化的分子選自蛋白質(zhì)分子如氧化還原蛋白質(zhì)、核酸結(jié)合蛋白質(zhì)、酶、金屬蛋白質(zhì)如細(xì)胞色素c、阿祖林、細(xì)胞支架蛋白質(zhì)、抗體,核酸如DNA、RNA、PNA,脂質(zhì)如磷脂和神經(jīng)鞘脂。
25.根據(jù)上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法,其中所述要圖案化的分子是具有一個(gè)或幾個(gè)賴氨酸殘基的蛋白質(zhì)分子,且其中所述基材為金,優(yōu)選地在其表面上具有隔離層以避免所述蛋白質(zhì)變性,所述隔離層的厚度優(yōu)選地在0.5nm-200nm的范圍之內(nèi)。
26.根據(jù)上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法,其中圖案包含長度為約10nm到500μm,優(yōu)選地約10nm到≤200nm,更優(yōu)選地約10nm到≤150nm的特征。
27.由根據(jù)上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法制造并在其上包含能保持其功能和/或活性和/或天然構(gòu)象的分子的圖案的基材。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的基材在傳感器、生物反應(yīng)器或引導(dǎo)細(xì)胞生長中的應(yīng)用。
29.一種用于實(shí)施權(quán)利要求1-26中任何一項(xiàng)的方法的設(shè)備,包括-容納要圖案化的分子的溶液的第一裝置,-圖案化的表面,優(yōu)選地是印模形式的表面,-基材,被保持在溶劑中或被溶劑覆蓋,-用于將所述要圖案化的分子從所述第一裝置轉(zhuǎn)移到所述圖案化表面的第二裝置,-用于將所述要圖案化的分子從所述圖案化表面轉(zhuǎn)移到所述基材的第三裝置,-用于保證所述要圖案化的分子在從所述第一裝置轉(zhuǎn)移到所述圖案化表面再到所述基材的過程中被保持在溶劑中或被溶劑覆蓋的第四裝置。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的設(shè)備,其中所述第二裝置是印臺,優(yōu)選非圖案化的表面。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用微接觸印刷工藝在基材上圖案化分子的方法、通過所述方法制造的基材以及所述基材的應(yīng)用。還涉及用于執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法的設(shè)備。
文檔編號B01L99/00GK1958301SQ20061014360
公開日2007年5月9日 申請日期2006年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月2日
發(fā)明者J·維澤爾斯, G·克倫, 安田章夫, D·施瓦布, D·邁爾, A·奧芬豪澤爾 申請人:索尼德國有限責(zé)任公司
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