專利名稱：一種碳納米管－蛋白固定相的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了納米，生物技術(shù)及微全分析領(lǐng)域，提供了一種可用作微流控芯片手性固定相的制備方法。
背景技術(shù)：
手性研究在生命科學(xué)、新材料、新藥研究等領(lǐng)域起著重要作用。其中，手性分離一直是該領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)。多年來，色譜法及手性毛細(xì)管電泳已經(jīng)成為較成熟的手性異構(gòu)體分離模式(Wan，H.，Blomberg，L.G.，J.Chromatogr.A2000，875，43-88)。近年來，隨著微全分析系統(tǒng)(μ-TAS)的發(fā)展，由于其快速，高效，樣品消耗量少及集成度高等優(yōu)點(diǎn)，基于微流芯片的手性分離日益引起廣泛關(guān)注。在這些研究中，環(huán)糊精及其衍生物(Belder，D.，Ludwig，M.，Electrophoresis2003，24，2422-2430)是最常用的手性選擇劑，而且這些手性選擇劑都是作為準(zhǔn)固定相溶解在芯片槽道的電解液里的。將手性固定相固定在芯片通道內(nèi)壁而實(shí)現(xiàn)手性分離卻未見報(bào)道。原因在于兩個(gè)方面最關(guān)鍵的一點(diǎn)就是芯片分離通道相對較短，要借助固定相分離就必須有足夠的手性選擇劑固定在芯片通道，這就對固定劑提出了很高的要求；另外，大多數(shù)芯片材料因其疏水表面而帶來的不穩(wěn)定的電滲流(EOF)導(dǎo)致分離效果不佳及整體性能不穩(wěn)定。但可以預(yù)見，這將是一個(gè)重要的研究方向。
碳納米管因其獨(dú)特的力學(xué)、電子特性及化學(xué)特性，成為世界范圍內(nèi)的研究熱點(diǎn)之一。近年來，科學(xué)家們在碳納米管的水溶性及其與生物分子的結(jié)合上做了大量的研究工作，發(fā)現(xiàn)其在水相中可與蛋白牢固地結(jié)合(Huang，W.et al，Nano Lett.2002，2，311-314)。然而對于它的進(jìn)一步應(yīng)用并沒有研究過。眾所周知，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，與不同物質(zhì)有不同的作用位點(diǎn)，其構(gòu)象隨著環(huán)境溶液的pH，離子強(qiáng)度等諸多因素的變化而變化。這種多變性帶來了蛋白較廣的適應(yīng)性。很多在手性柱上難以拆分的異構(gòu)體，往往可在蛋白柱上得到較好的分離。國內(nèi)已有專利(專利申請?zhí)?9113091.X，公開號CN 1280986A)報(bào)道利用蛋白作色譜手性固定相，但并未涉及在微流控芯片中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可用于微流控芯片的碳納米管—蛋白固定相的制備方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述制備方法的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種碳納米管—蛋白固定相的制備方法。
本發(fā)明是采用活化劑將碳納米管上的羧基活化后，在水相中將蛋白共價(jià)結(jié)合在納米管上，這種方法不但能使蛋白牢固地固定，而且提高固定量。
本發(fā)明的蛋白手性固定相制備方法具體包括以下步驟(1)將碳納米管回流純化并通過超聲進(jìn)一步截?cái)啵?2)在上述碳納米管里加入羧基活化劑，超聲羧基活化成活潑酯；(3)加入0.3-1.2mg/mL的具有手性分離能力的蛋白，攪拌過夜，即得到芯片固定相；活化后的碳納米管∶羧基活化劑∶蛋白的質(zhì)量濃度比例為1∶4-6∶10-12。
本發(fā)明中，所述碳納米管可以是商品化的單壁碳納米管或者多壁碳納米管，如深圳市納米港有限公司生產(chǎn)的比表面積大于600平方米/克的單壁碳納米管或比表面積為40-300平方米/克的多壁碳納米管。本發(fā)明中，碳納米管可采用常規(guī)方法純化，例如用濃HNO3回流純化，以除去雜質(zhì)。
本發(fā)明中，在(1)中進(jìn)一步截?cái)鄷r(shí)可將純化后的碳納米管置于濃HNO3和濃H2SO4混合液中進(jìn)行超聲(工作頻率是40-80KHz)截?cái)啵粷釮NO3和濃H2SO4的混合比例遵循混酸與納米管的比例可以是0.5-1.2mL/mg，其中混酸即濃HNO3和濃H2SO4的體積比是1∶3；超聲時(shí)間為7-9小時(shí)。經(jīng)過進(jìn)一步截?cái)?，納米管的兩端及部分管壁出現(xiàn)大量羧基，并在水中形成良好的分散液。
本發(fā)明中，在(2)中羧基活化劑可以是碳二亞胺類；例如由美國Aldrich公司生產(chǎn)的乙基-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-烴基磺基琥珀酰亞胺(NHS)或者是乙基-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)。
本發(fā)明中，超聲(工作頻率范圍在40-80KHz)羧基活化可采用常規(guī)方法，例如用上海輕超超聲波儀器有限公司生產(chǎn)的SCS-3200的工作頻率是50KHz的超聲儀，超聲8小時(shí)即可。
納米管的羧基活化成活潑酯后，就可加入一定濃度的蛋白制備芯片固定相。其中，碳納米管∶羧基活化劑蛋白的質(zhì)量濃度比例為1∶4-6∶10-12。所用蛋白是具有手性分離能力的蛋白，例如，白蛋白、糖蛋白或者酶等。較好地，如白蛋白類中的牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HAS)，糖蛋白類中的α1-酸糖蛋白(AGP)或卵類粘蛋白(OMCHI)，以及酶類中的胃蛋白酶或溶解酵素等。在本發(fā)明的實(shí)施例中，采用了牛血清白蛋白和人血清白蛋白。
加入蛋白采用常規(guī)攪拌過夜方法即可使蛋白固定在納米管管壁，攪拌時(shí)間可為12小時(shí)以上，達(dá)到蛋白固定在納米管管壁的目的即可。
另一方面，本發(fā)明提供了上述制備方法的應(yīng)用。
將制得的碳納米管—蛋白固定相填充于羥基化的PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)芯片分離通中，在0-5℃干燥后，即可用于異構(gòu)體的分離。
本發(fā)明中，可采用常規(guī)方法將上述制得的固定相填充于羥基化的PMMA芯片分離通中。
本發(fā)明中，干燥可在0-5℃環(huán)境中進(jìn)行，例如，在4℃冰箱中干燥1-3天即可。
本發(fā)明中，羥基化的PMMA芯片可以是十字芯片，其中進(jìn)樣通道長1.8-2.0厘米，分離通道長2.5-4.5厘米，所有通道寬60-120微米，深50微米左右，較好的是，分離通道長為3.0-4.5厘米，通道寬80-100微米的，例如，本發(fā)明用的是進(jìn)樣通道長1.8厘米，分離通道長3.2厘米，通道寬90微米，深50微米的芯片。
上述PMMA芯片是將PMMA片子通過硅模熱壓的方法制備的。制備好的芯片用高分子修飾引入硅羥基后可以備用。例如，將熱壓法制得的PMMA芯片清洗并經(jīng)含有硅氧烷的聚酯修飾，然后利用無水乙醇將硅氧烷水解成硅羥基后制得。
本發(fā)明的簡易合成路線可見附圖1所示。
本發(fā)明的蛋白是通過共價(jià)法固定在納米管上的，所以蛋白有很好的穩(wěn)定性。而且用于固定蛋白的納米管由于活化后有著大量的羧基，所以可以提高蛋白的固定量，使得固定相的分離能力獲得改善，有效地用于芯片手性分離。本發(fā)明所述方法合成的蛋白固定相簡單易行，成功率極高，所固定的蛋白量大，活性高，穩(wěn)定性好。


圖1是合成路線圖。
圖2是色氨酸對映異構(gòu)體的分離結(jié)果圖。其中，D為D-色氨酸，L為L-色氨酸。
具體實(shí)施例方式
下面通過具體實(shí)施例詳述本發(fā)明。
實(shí)施例一.蛋白固定相的制備方法I(1)純化碳納米管取1g SWNTs置于圓底燒瓶中，加入16ml濃HNO3，油浴140℃回流4小時(shí)，加水稀釋，離心分離，棄去上層液，重復(fù)洗滌離心至上層清液pH～6為止，用孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾，得到黑色固體，干燥備用。
(2)截?cái)嗉{米管取上述純化的SWNTs 50mg在45ml的濃HNO3和濃H2SO4(1∶3v/v)中超聲8小時(shí)，稀釋，過濾，洗滌固體至濾液接近中性時(shí)，將得到固體干燥備用。
(3)納米管的活化及共價(jià)結(jié)合蛋白稱取上述截?cái)嗟?.075mg SWNTs加入1ml PBS，超聲5分鐘，加入0.4mgEDAC超聲2小時(shí)，繼續(xù)加入0.9mg BSA，攪拌24小時(shí)后即得到蛋白固定相。
實(shí)施例二.蛋白固定相的制備方法II與蛋白固定相的制備方法I的不同之處在于，稱取上述截?cái)嗟?.075mgSWNTs加入1ml PBS，超聲5分鐘，加入0.3mg EDC和0.75mg NHS超聲2小時(shí)，繼續(xù)加入0.9mg BSA，攪拌24小時(shí)后即得到蛋白固定相。
實(shí)施例三.色氨酸對映異構(gòu)體的分離。
用上述實(shí)施例制備的BSA固定相，用微量進(jìn)樣器充滿用高分子修飾過的PMMA芯片內(nèi)，4℃冰箱放置干燥，用磷酸緩沖液作流動(dòng)相，可分離色氨酸對映異構(gòu)體。分離條件為芯片分離通道長3.2cm；分離場強(qiáng)+218V/cm；20mM磷酸緩沖液，pH＝7.4；24μM色氨酸；恒電位檢測，電壓為0.6V。圖2顯示了色氨酸對映異構(gòu)體的分離結(jié)果?？梢?，色氨酸異構(gòu)體能在有BSA蛋白固定相的芯片通道里70s內(nèi)基線分離，分離度是1.28左右。此結(jié)果說明按照該發(fā)明制備的蛋白固定相不但能穩(wěn)定固定在芯片槽道中，而且蛋白較好地保存了原有構(gòu)象，從而在相對較短的芯片分離通道顯示出了理想的手性分離能力。
權(quán)利要求
1.一種碳納米管—蛋白固定相的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將碳納米管回流純化并通過超聲截?cái)啵?2)在上述(1)所得的碳納米管加入羧基活化劑中并超聲，使羧基活化成活潑酯；(3)加入0.3-1.2mg/mL的具有手性分離能力的蛋白，攪拌過夜，即得到固定相；活化后的碳納米管羧基活化劑蛋白的質(zhì)量濃度比為1∶4～6∶10～12。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述碳納米管是單壁碳納米管或者多壁碳納米管。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在(1)中截?cái)鄷r(shí)將純化后的碳納米管置于HNO3和H2SO4混合液中進(jìn)行超聲截?cái)?；HNO3和H2SO4的混合比例為1∶3(v/v)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中羧基活化劑是乙基-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-烴基磺基琥珀酰亞胺。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中羧基活化劑是乙基-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽中的一種。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中的蛋白是血清白蛋白、α1-酸糖蛋白、卵類粘蛋白、胃蛋白酶或溶解酵素中的一種。
7.如權(quán)利要求1所述方法的應(yīng)用，其特征在于，將制得的碳納米管—蛋白固定相填充于羥基化的PMMA芯片分離通中，在0-5℃干燥后，即可用于異構(gòu)體的分離。
全文摘要
本發(fā)明涉及了納米，生物技術(shù)及微全分析領(lǐng)域，提供了一種可用作微流控芯片手性固定相的制備方法。隨著微全分析系統(tǒng)的發(fā)展，基于微流芯片的手性分離嶄露頭角。但是，芯片材料往往會由于其不穩(wěn)定的電滲流而導(dǎo)致分離效果不佳及整體性能不穩(wěn)定。本發(fā)明報(bào)道了采用功能化碳納米管鍵合蛋白作為芯片手性分離固定相的制備方法。所得固定相能有效地用于修飾過的芯片進(jìn)行手性分離異構(gòu)體。該方法使得手性分離能借助于芯片分離通道內(nèi)的固定相得以實(shí)現(xiàn)。用本發(fā)明所述方法合成的蛋白固定相簡單，成功率極高，所固定的蛋白量大，活性高，穩(wěn)定性好。
文檔編號B01J20/29GK1803845SQ200510110689
公開日2006年7月19日 申請日期2005年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月24日
發(fā)明者孔繼烈, 劉寶紅, 翁雪香, 畢紅艷 申請人:復(fù)旦大學(xué)