專利名稱:固定了生物物質(zhì)的芯片及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及固定了生物物質(zhì)的芯片、制造它們的方法、及其用途。具體而言,本發(fā)明涉及包含導(dǎo)電性支持物和生物物質(zhì),如經(jīng)由金屬原子固定在支持物上的蛋白的固定了生物物質(zhì)的芯片。
背景技術(shù):
蛋白芯片用于分析蛋白結(jié)合物質(zhì)等。為了達(dá)到這種目的,應(yīng)以同一方向穩(wěn)定固定蛋白。已知截留方法(Journal of ElectroanalyticalChemistry,vol.347,pp293-301(199))和聚合方法(Journal ofElectroanalytical Chemistry,vol.511,pp128-133(2001))是典型的蛋白固定技術(shù)。然而,任何一種方法都存在不能控制固定化蛋白的方向的問題。已知自積累方法(Sensors and Actuator B,vol.24-25,pp113-116(1995))利用半胱氨酸的硫原子與金屬,如具有高結(jié)晶性的金的表面的巰基-鍵。然而,自積累方法存在蛋白活性降低和方向雜亂的問題,這是由于半胱氨酸殘基存在于蛋白結(jié)構(gòu)的許多部分中,且反應(yīng)在每個半胱氨酸殘基中進(jìn)行。此外,上述固定方法是不可逆的,不能使固定化蛋白再次解離,因而很難再次使用基質(zhì)和蛋白,且很難分析與固定化蛋白結(jié)合的少量樣品。
另一種技術(shù),其中通過使用結(jié)合金屬的多肽,如與蛋白融合的聚組氨酸。使蛋白與金屬離子結(jié)合,從而控制固定化蛋白的方向(JP2001-083155A)。然而,結(jié)合金屬的多肽與金屬離子之間的鍵易解離,這是因為配位鍵的競爭反應(yīng),因此該方法不適于穩(wěn)定的固定。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種固定了生物物質(zhì)的芯片,其中生物物質(zhì)如蛋白以恒定的方向被穩(wěn)定固定在導(dǎo)電性支持物上。本發(fā)明另一目的是提供使用固定了生物物質(zhì)的芯片的分析方法;和生物物質(zhì)的純化方法。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過使具有能夠與金屬離子形成配位鍵的部分的蛋白與金屬離子形成配位鍵;使所得配合物接近導(dǎo)電性支持物;并向?qū)щ娦灾С治锸┘舆€原電位,可將蛋白穩(wěn)定固定在導(dǎo)電性支持物上。本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)其中蛋白以恒定的方向被穩(wěn)定固定在導(dǎo)電性支持物上的蛋白芯片可利用固定化技術(shù)制備。此外,本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過向其上固定了蛋白的導(dǎo)電性支持物施加氧化電位,可再次解離該蛋白?;谶@些發(fā)現(xiàn),本發(fā)明人完成了本發(fā)明。
即,本發(fā)明如下。
(1)一種固定了生物物質(zhì)的芯片,其中所述芯片包含導(dǎo)電性支持物和經(jīng)由金屬原子固定在導(dǎo)電性支持物上的生物物質(zhì),且其中所述生物物質(zhì)具有能夠與金屬離子形成配位鍵的部分,且所述金屬原子是通過還原金屬離子產(chǎn)生的。
(2)根據(jù)(1)所述的固定了生物物質(zhì)的芯片,其中所述導(dǎo)電性支持物具有尖頂,且所述生物物質(zhì)經(jīng)由金屬原子而被固定在導(dǎo)電性支持物的尖頂上。
(3)根據(jù)(1)或(2)所述的固定了生物物質(zhì)的芯片,其中所述導(dǎo)電性支持物載于基質(zhì)上。
(4)根據(jù)(1)-(3)任何一項所述的固定了生物物質(zhì)的芯片,其中所述能夠與金屬離子形成配位鍵的部分是聚組氨酸。
(5)根據(jù)(1)-(4)任何一項所述的固定了生物物質(zhì)的芯片,其中所述導(dǎo)電性支持物是金屬。
(6)根據(jù)(1)-(4)任何一項所述的固定了生物物質(zhì)的芯片,其中所述導(dǎo)電性支持物是選自金、銀、銅、鋁和鉑的一種或多種金屬。
(7)根據(jù)(1)-(6)任何一項所述的固定了生物物質(zhì)的芯片,其中所述金屬原子是通過還原二價金屬離子產(chǎn)生的。
(8)根據(jù)(1)-(7)任何一項所述的固定了生物物質(zhì)的芯片,其中所述生物物質(zhì)是蛋白。
(9)一種制造固定了生物物質(zhì)的芯片的方法,其包括下列步驟使具有能與金屬離子形成配位鍵部分的生物物質(zhì)與金屬離子形成配位鍵;使所得配合物接近導(dǎo)電性支持物;并向?qū)щ娦灾С治锸┘舆€原電位,并由此將具有能夠與金屬離子形成配位鍵部分的生物物質(zhì)固定在導(dǎo)電性支持物上。
(10)一種分析生物物質(zhì)或樣品中的物質(zhì)的方法,包括使固定在(1)-(8)任何一項的固定了生物物質(zhì)的芯片上的生物物質(zhì)與含有能夠特異性結(jié)合該生物物質(zhì)的物質(zhì)的樣品反應(yīng);檢測通過結(jié)合固定化的生物物質(zhì)而與芯片間接結(jié)合的物質(zhì),并分析在固定了生物物質(zhì)的芯片上固定的生物物質(zhì)或樣品中的物質(zhì)。
(11)一種分析生物物質(zhì)或樣品中的物質(zhì)的方法,包括使固定在(1)-(8)任何一項的芯片上的生物物質(zhì)與含有能夠特異性結(jié)合固定化的生物物質(zhì)的物質(zhì)的樣品反應(yīng);通過向?qū)щ娦灾С治锸┘友趸娢唬鴱男酒膶?dǎo)電性支持物上將反應(yīng)獲得的含固定化的生物物質(zhì)和特異性結(jié)合生物物質(zhì)的物質(zhì)的配合物解離下來。
(12)一種純化生物物質(zhì)的方法,包括下列步驟將導(dǎo)電性支持物浸在含有金屬離子和具有能夠與金屬離子形成配位鍵的部分的生物物質(zhì)的溶液中;向?qū)щ娦灾С治锸┘舆€原電位,而使生物物質(zhì)固定在導(dǎo)電性支持物上;將上步獲得的、其上固定了生物物質(zhì)的導(dǎo)電性支持物浸在解離溶液中;并向?qū)щ娦灾С治锸┘友趸娢唬股镂镔|(zhì)從導(dǎo)電性支持物上解離下來。
(13)一種固定物質(zhì)的方法,包括下列步驟使具有能夠與金屬離子形成配位鍵的部分的物質(zhì)與金屬離子形成配位鍵;使所得配合物接近導(dǎo)電性支持物;并向?qū)щ娦灾С治锸┘舆€原電位,從而使物質(zhì)固定在導(dǎo)電性支持物上。
(14)根據(jù)權(quán)利要求(13)所述的方法,其中所述物質(zhì)是蛋白。
附圖簡述
圖1是固定化方法原理的示意圖。
圖2是表示發(fā)光值的曲線圖。
圖3是用CDD照相機拍攝的發(fā)光圖像(照片)。
圖4是從大腸桿菌溶解產(chǎn)物中純化與聚組氨酸融合的蛋白A的示意圖。
優(yōu)選實施方案的描述此后,將詳細(xì)說明本發(fā)明。
<1>本發(fā)明的固定了生物物質(zhì)的芯片本發(fā)明的固定了生物物質(zhì)的芯片是包含導(dǎo)電性支持物;和經(jīng)由金屬原子而被固定在導(dǎo)電性支持物上的生物物質(zhì)的固定了生物物質(zhì)的芯片,其中生物物質(zhì)具有能夠與金屬離子形成配位鍵的部分;且金屬原子是通過還原金屬離子產(chǎn)生的。固定了生物物質(zhì)的芯片的例子包括其上固定了蛋白的蛋白芯片和固定了核酸的芯片,如其上固定了核酸的DNA芯片。
此后,將說明蛋白芯片。
對具有能夠與金屬離子形成配位鍵部分的蛋白長度沒有限制,且該蛋白可以是肽。
對能夠與金屬離子形成配位鍵的部分的類型沒有限制,且該蛋白的例子包括能夠與金屬形成配位鍵的、含有原子如氮原子、硫原子和氧原子的分子鏈和分子骨架。這種分子鏈或分子骨架可以是肽或除肽之外的化合物。具體而言,能夠與金屬離子形成配位鍵的分子鏈和分子骨架的例子包括含聚組氨酸(聚組氨酸標(biāo)記)、polyfilin的肽,和含硫醇的肽或化合物。它們之中,聚組氨酸標(biāo)記是特別優(yōu)選的。這里,聚組氨酸標(biāo)記是指含有兩個或多個組氨酸殘基的多肽。肽中組氨酸殘基數(shù)為2或更多,且該數(shù)不會不利地影響所固定蛋白的功能,但組氨酸殘基數(shù)優(yōu)選6。肽中的聚組氨酸殘基無需連續(xù),且可在肽的組氨酸殘基之間插入除組氨酸外的一個或若干氨基酸。能夠與金屬離子形成配位鍵的部分,如聚組氨酸標(biāo)記,可與所固定蛋白的任何位點融合,但優(yōu)選與蛋白的氨基-末端或羧基-末端融合。
本發(fā)明的蛋白芯片可用于,例如,篩選結(jié)合靶蛋白的藥物;使用抗體等診斷;通過使用固定化的酶而生產(chǎn)有用物質(zhì);純化蛋白;和通過SPM分析蛋白結(jié)構(gòu)。用于這些目的的本發(fā)明蛋白芯片中的、經(jīng)由能夠與金屬離子形成配位鍵的部分而被固定的蛋白的具體例子包括下述蛋白。即,所述蛋白包括蛋白激素或肽激素如胰島素、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、和催產(chǎn)素;酶如膽堿酯酶、淀粉酶和胃蛋白酶及其前體;識別抗原如HBs抗原和HIV抗原的抗體;和結(jié)合抗體的蛋白,如蛋白A。還可使用任意蛋白作為蛋白文庫。本發(fā)明的固定化蛋白可以是非-天然蛋白,如化學(xué)合成的蛋白,且本發(fā)明的固定化蛋白還包括肽。
本發(fā)明蛋白芯片中的、通過還原金屬離子產(chǎn)生的金屬原子優(yōu)選是通過還原能夠與蛋白中結(jié)合金屬離子的部分形成配位鍵的金屬離子而產(chǎn)生的金屬原子。當(dāng)把與聚組氨酸-融合蛋白用作具有能夠與金屬離子形成配位鍵部分的蛋白時,優(yōu)選通過還原二價陽離子,如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Ca2+、Co2+或Mg2+而產(chǎn)生金屬原子。構(gòu)成本發(fā)明蛋白芯片的導(dǎo)電性支持物是指可向其施加電位的支持物。導(dǎo)電性支持物的例子包括金屬構(gòu)成的支持物;半導(dǎo)體如銦錫氧化物(ITO)、GaAs、或硅構(gòu)成的支持物;和碳構(gòu)成的支持物。它們之中,優(yōu)選金屬構(gòu)成的支持物,且特別優(yōu)選金、銀、銅、鋁或鉑構(gòu)成的支持物。
本發(fā)明還提供一種蛋白芯片,其中具有能夠與金屬離子形成配位鍵的部分的蛋白經(jīng)由金屬原子而被固定在具有尖頂?shù)膶?dǎo)電性支持物的尖頂上。這里,具有尖頂?shù)膶?dǎo)電性支持物的例子包括其本身具有尖頂?shù)闹С治?,如具有尖頂?shù)你K棒。這種導(dǎo)電性支持物的例子還包括其中將蛋白固定在通過將導(dǎo)電性支持物與基質(zhì)如具有尖頂?shù)墓柽B接獲得的導(dǎo)電性支持物尖頂上。這種導(dǎo)電性支持物的例子包括掃描探測顯微鏡(SPM)(JP 05-026614A)、或原子探測顯微鏡(JP 05-018742)所用懸臂的探針,其中導(dǎo)電性支持物如鉑連接在基質(zhì)如硅上。當(dāng)?shù)鞍妆还潭ㄔ趯?dǎo)電性支持物的尖頂上時,可以一個導(dǎo)電性支持物上一個或若干分子的比例固定蛋白。特別是,這種蛋白芯片可用作SPM和原子探測顯微鏡的樣品,且可通過向?qū)щ娦灾С治锏募忭斒┘与娢欢苽?。?dāng)向?qū)щ娦灾С治锏募忭斒┘与娢?,可固定單個或若干蛋白分子,這是因為電位通過邊緣效應(yīng)而被集中在尖頂上(Pure Appl.Chem.Vol.72No.8,pp1483-1492(2000))。
本發(fā)明的蛋白芯片包括其中具有能夠與金屬離子形成配位鍵的部分的蛋白經(jīng)由金屬原子結(jié)合在導(dǎo)電性支持物上的芯片。然而,優(yōu)選其中導(dǎo)電性支持物載于基質(zhì)上的蛋白芯片。這里,術(shù)語“導(dǎo)電性支持物載于基質(zhì)上”是指芯片中的導(dǎo)電性支持物順序結(jié)合在基質(zhì)整個表面上、或芯片中的多個導(dǎo)電性支持物與基質(zhì)結(jié)合,使多個導(dǎo)電性支持物以恒定的間隔排列在基質(zhì)上。當(dāng)多個蛋白被固定在本發(fā)明的蛋白芯片上時,無需所有蛋白都經(jīng)由金屬原子而被固定在導(dǎo)電性支持物上,且至少一部分蛋白可經(jīng)由金屬原子而被固定在導(dǎo)電性支持物上。換句話說,一部分蛋白可在沒有金屬原子的情況下被固定,例如某些蛋白可經(jīng)由金屬離子結(jié)合。
可用作基質(zhì)的材料的例子包括塑料、無機聚合物、天然聚合物、和陶瓷。塑料的具體例子可包括聚乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚酰胺、酚樹脂、環(huán)氧樹脂、聚碳二亞胺樹脂、聚氯乙烯、聚偏二氟乙烯、聚氟乙烯、聚酰亞胺和丙烯酸樹脂。無機聚合物的具體例子包括玻璃、水晶、碳、硅膠和石墨。天然聚合物的具體例子包括纖維素、纖維素衍生物、殼多糖、脫乙酰殼多糖、藻酸和藻酸鹽。陶瓷的具體例子包括礬土、硅石、碳化硅、氮化硅和碳化硼。
基質(zhì)形狀的例子包括膜片、平板、顆粒、模塑片(珠、帶、多孔平板的孔或帶、管、網(wǎng)、連續(xù)發(fā)泡的形式、膜、紙、針、纖維、平板、玻片、和細(xì)胞培養(yǎng)皿)、膠乳、和懸臂的探針。對基質(zhì)的大小沒有特別限制。
上述實施方案用于說明蛋白芯片,然而,可將與上述相同種類的、能夠與金屬離子形成配位鍵的部分,導(dǎo)電性支持物,金屬原子,基質(zhì)等用于其上固定了其它生物物質(zhì)的芯片。
<2>制造固定了生物物質(zhì)的芯片的方法本發(fā)明固定了生物物質(zhì)的芯片可通過下列方法制造,該方法包括使具有能夠與金屬離子形成配位鍵的部分的生物物質(zhì)與金屬離子形成配位鍵,使所得配合物接近導(dǎo)電性支持物并向?qū)щ娦灾С治锸┘舆€原電位,而使具有能夠與金屬離子形成配位鍵部分的生物物質(zhì)固定在導(dǎo)電性支持物上的步驟。
下面說明蛋白芯片的制造方法。
固定在本發(fā)明蛋白芯片上、具有能夠與金屬離子形成配位鍵的部分的蛋白可通過,例如,在網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物、或宿主細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞中體外表達(dá)含DNA的載體,其中該DNA編碼具有能夠與金屬離子形成配位鍵的肽的融合蛋白,并純化所表達(dá)的蛋白而獲得。這種蛋白還可通過化學(xué)合成獲得。蛋白可單獨制備并和能夠與金屬離子形成配位鍵的部分化學(xué)結(jié)合。含聚組氨酸標(biāo)記的蛋白,其是本發(fā)明的優(yōu)選蛋白,可通過,例如,將編碼目標(biāo)蛋白的DNA插入到已知的聚組氨酸-融合蛋白表達(dá)載體(例如,pET系列,由Novagen制造)中,通過用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌等而表達(dá)融合蛋白,并利用親和柱等純化融合蛋白而生產(chǎn)。此外,這種蛋白可通過下列步驟獲得合成包括編碼聚組氨酸標(biāo)記的核苷酸序列的寡核苷酸和寡核苷酸的互補鏈,使兩個鏈雜交,將所得DNA插入到含編碼目標(biāo)蛋白的DNA的表達(dá)載體中,以便表達(dá)融合蛋白,通過用所得載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌等而表達(dá)融合蛋白,并純化所表達(dá)的蛋白。
在本方法中,用于固定的、具有能夠與金屬離子形成配位鍵的部分的蛋白并非必需是純化蛋白,這是因為具有該部分的蛋白可被特異性固定在蛋白芯片上。即,含有該蛋白的來源于大腸桿菌的溶解產(chǎn)物、提取物等或網(wǎng)狀細(xì)胞的溶解產(chǎn)物可直接用于固定。在這種情況下,具有省略純化過程的優(yōu)點。
在本發(fā)明的制造方法中,與具有能夠與金屬離子形成配位鍵的部分的蛋白形成配位鍵的金屬離子是指能夠與蛋白的這種部分形成配位鍵的金屬離子。在將聚組氨酸-融合蛋白用作具有結(jié)合金屬離子部分的蛋白時,優(yōu)選使用二價陽離子如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Ca2+、Co2+或Mg2+作為金屬離子。各金屬離子和具有能夠與金屬離子形成配位鍵的部分的蛋白之間的配位鍵可通過在含該蛋白的緩沖液中加入與金屬離子相對應(yīng)的鹽如NiCl2而形成。優(yōu)選在沒有金屬離子的緩沖液中透析金屬離子和蛋白的配位鍵配合物,從而在配位鍵形成反應(yīng)后,除去游離金屬離子。
本發(fā)明制造方法中的術(shù)語“使接近導(dǎo)電性支持物”是指使金屬離子和具有能形成配位鍵的部分的蛋白之間的配位鍵配合物接近導(dǎo)電性支持物,且優(yōu)選是指將導(dǎo)電性支持物浸在含配位鍵配合物的溶液中。對浸沒導(dǎo)電性支持物的溶液沒有特別限制,只要可施加電位,且可使用磷酸鹽緩沖溶液等。
在制造方法中,向?qū)щ娦灾С治锸┘与娢豢赏ㄟ^下列進(jìn)行例如,將導(dǎo)電性支持物和參比電極浸在含金屬離子與蛋白的配位鍵配合物的電解液中;并通過使用標(biāo)準(zhǔn)電力供給而施加電位。參比電極的例子包括銀-氯化銀電極。施加的電位是還原電位,其相對于參比電極是負(fù)電位。作為還原電位的優(yōu)選電位根據(jù)導(dǎo)電性支持物的類型而有所不同;且當(dāng)使用鉑作為導(dǎo)電性支持物時,電位相對于參比電極為-10mV或更低,更優(yōu)選相對于參比電極為-100mV或更低;且特別優(yōu)選相對于參比電極為-200mV或更低。
在制造其中導(dǎo)電性支持物載于基質(zhì)上的蛋白芯片時,導(dǎo)電性支持物可按照常規(guī)方法結(jié)合在基質(zhì)上,方法的實例包括濺射、蒸汽沉積方法、和離子-噴鍍方法、電鍍方法、和非-電鍍方法。
上述實施方案用于說明制造蛋白芯片的方法,然而,可將與上述相同的過程用于制造其中固定其它生物物質(zhì)的芯片。
<3>本發(fā)明的分析方法本發(fā)明的分析方法是分析生物物質(zhì)或樣品中的結(jié)合物質(zhì)的方法,包括使在本發(fā)明固定了生物物質(zhì)的芯片上固定的生物物質(zhì)與所含物質(zhì)特異性結(jié)合生物物質(zhì)的樣品反應(yīng),并檢測經(jīng)由與固定化的生物物質(zhì)結(jié)合而與芯片間接結(jié)合的物質(zhì)。
下面說明使用蛋白芯片的分析方法。
含有能夠特異性結(jié)合固定在蛋白芯片上的蛋白的、蛋白-結(jié)合物質(zhì)的樣品例子包括含蛋白(包括肽)、抗原物質(zhì)、核酸及醫(yī)藥化合物的樣品。那些蛋白-結(jié)合物質(zhì)可以是一類物質(zhì),或作為蛋白文庫的任意蛋白的混合物,此外,任意化合物的混合物可被用作化合物文庫。含那些蛋白-結(jié)合物質(zhì)的各樣品可以是溶液,該溶液是通過將那些物質(zhì)溶于適宜緩沖溶液中制備的,或是生物樣品如血液或細(xì)胞提取物。
本發(fā)明的分析方法可用于各種應(yīng)用。當(dāng)把涉及特定疾病的醫(yī)藥靶蛋白用作固定化蛋白并把醫(yī)藥化合物文庫用作蛋白-結(jié)合物質(zhì)時,該方法可用于篩選結(jié)合靶蛋白的醫(yī)藥化合物。此外,當(dāng)把可能含有抗原的樣品如血液用作含蛋白-結(jié)合物質(zhì)的樣品并把特異性識別該抗原的抗體用作固定化的蛋白時,該分析方法可根據(jù)是否存在該抗原而診斷疾病。在將任意蛋白的混合物固定并用作蛋白文庫,并將特定蛋白或特定化合物用作蛋白-結(jié)合物質(zhì)時,該分析方法可用于研究特異性結(jié)合特定蛋白或特定化合物的蛋白的功能分析。
測量對象可以是固定化蛋白或蛋白-結(jié)合物質(zhì)。通過與固定化蛋白結(jié)合而間接結(jié)合支持物的蛋白-結(jié)合物質(zhì)的檢測可如下進(jìn)行。優(yōu)選在固定蛋白后,通過使它與過量牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、鮭魚精子DNA等接觸而阻斷導(dǎo)電性支持物,以阻止蛋白-結(jié)合物質(zhì)與導(dǎo)電性支持物或基質(zhì)在反應(yīng)過程中非-特異性結(jié)合。
在固定化蛋白與含蛋白-結(jié)合物質(zhì)的樣品反應(yīng)后,可進(jìn)行與標(biāo)準(zhǔn)固相免疫測定相同的過程,以檢測與固定化蛋白結(jié)合的蛋白-結(jié)合物質(zhì)。當(dāng)固定化蛋白是測量對象時,例如,已經(jīng)用標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記過的蛋白-結(jié)合物質(zhì)與蛋白芯片反應(yīng),然后檢測或量化結(jié)合在導(dǎo)電性支持物上的標(biāo)記物質(zhì),由此檢測或量化蛋白-結(jié)合物質(zhì),從而檢測或量化固定化蛋白。
當(dāng)?shù)鞍?結(jié)合物質(zhì)是測量對象時,在蛋白芯片與蛋白-結(jié)合物質(zhì)反應(yīng)過程中,在反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)一步加入用標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的蛋白-結(jié)合物質(zhì),樣品中蛋白-結(jié)合物質(zhì)的量可通過測量與固定化蛋白結(jié)合的標(biāo)記物質(zhì)的量而間接測定(抑制技術(shù))。
與固定化蛋白結(jié)合的蛋白-結(jié)合物質(zhì)可通過能夠特異性結(jié)合基質(zhì)的抗體的反應(yīng)而檢測。例如,當(dāng)?shù)鞍?結(jié)合物質(zhì)是抗原且固定化蛋白是針對該抗原的抗體(第一抗體)時,蛋白-結(jié)合物質(zhì)可通過其它標(biāo)記抗體(第二抗體)與導(dǎo)電性支持物-第一抗體-抗原的配合物反應(yīng),形成導(dǎo)電性支持物-第一抗體-抗原-第二抗體的配合物,并基于配合物中第二抗體的量檢測(三明治技術(shù))。
標(biāo)記物質(zhì)可以并不總是自身可檢測的物質(zhì)。例如,當(dāng)把生物素用作標(biāo)記物質(zhì)時,蛋白-結(jié)合物質(zhì)可通過使用與特異性結(jié)合生物素的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白偶聯(lián)的酶而間接檢測。
本發(fā)明提供分析樣品中固定化蛋白或蛋白-結(jié)合物質(zhì)的方法,包括使固定在蛋白芯片上的蛋白與含有能夠特異性結(jié)合固定化蛋白的蛋白-結(jié)合物質(zhì)的樣品反應(yīng),并通過向?qū)щ娦灾С治锸┘友趸娢欢鴮⒎磻?yīng)所得的固定化蛋白與蛋白-結(jié)合物質(zhì)的配合物從導(dǎo)電性支持物上解離下來。
可通過向固定了蛋白的支持物上施加氧化電位而從導(dǎo)電性支持物上將蛋白解離下來。具體而言,固定在蛋白芯片上的配合物可通過將用于與蛋白-結(jié)合物質(zhì)反應(yīng)的蛋白芯片浸在電解液中,并相對于參比電極,向蛋白芯片的導(dǎo)電性支持物上施加氧化電位而解離。這里,所施加的電位相對于參比電極是正電位。在使用鉑作為導(dǎo)電性支持物的情況下,氧化電位優(yōu)選相對于參比電極為+10mV或更高,更優(yōu)選相對于參比電極為+100mV或更高。在本發(fā)明的分析方法中,從導(dǎo)電性支持物上解離下來的配合物可直接分析或在將蛋白-結(jié)合物質(zhì)從固定化蛋白分離之后分析。此外,除了上述本發(fā)明分析方法中的定量分析外,樣品中固定化蛋白或蛋白-結(jié)合物質(zhì)的分析包括定性分析,如各種色譜法和質(zhì)譜法。
<4>本發(fā)明純化生物物質(zhì)的方法本發(fā)明還提供使用本發(fā)明固定了生物物質(zhì)的芯片純化生物物質(zhì)的方法。所述生物物質(zhì)優(yōu)選蛋白。本發(fā)明的蛋白純化方法包括下列步驟將導(dǎo)電性支持物浸在含金屬離子和具有能夠與金屬離子形成配位鍵的部分的蛋白的溶液中,向?qū)щ娦灾С治锸┘舆€原電位從而將該蛋白固定在支持物上,將上步獲得的、其上固定了蛋白的支持物浸在解離溶液中,并向?qū)щ娦灾С治锸┘友趸娢唬瑥亩鴮⒌鞍讖闹С治锷辖怆x下來。在本發(fā)明的純化方法中,洗滌操作可在固定化步驟和解離步驟之間進(jìn)行,從而減少外源性蛋白的污染。
上述那些相同種類的金屬離子、蛋白、導(dǎo)電性支持物等可用于純化方法,且還可使用與上述那些相同的反應(yīng)條件,如相同的施加電位。此外,對解離溶液沒有特別限制,只要可施加該電位。例如,可使用磷酸鹽緩沖溶液,且純化可在成批-系統(tǒng)或流動-系統(tǒng)中進(jìn)行。純化所用的導(dǎo)電性支持物可具有任何一種形狀,但優(yōu)選它所具有形狀的表面積較大,例如,優(yōu)選可提高純化效率的掃帚或海綿狀的導(dǎo)電性支持物。根據(jù)本發(fā)明的方法,無需使用吸附緩沖溶液和用于標(biāo)準(zhǔn)純化的蛋白洗脫液,且目標(biāo)蛋白可在沒有稀釋的情況下被純化。
<5>本發(fā)明的固定化方法本發(fā)明還提供一種將物質(zhì)固定的方法,包括下列步驟使具有能夠與金屬離子形成配位鍵的部分的物質(zhì)與金屬離子形成配位鍵;使所得配合物接近導(dǎo)電性支持物;并向?qū)щ娦灾С治锸┘舆€原電位,從而將具有該部分的物質(zhì)固定在導(dǎo)電性支持物上。對所固定的物質(zhì)沒有特別限制,可以是生物物質(zhì)如蛋白或核酸,或可以是非-生物物質(zhì)如低分子量的聚合物。該固定化方法可按照與上述“Method of manufacturingbiological substance-immobilized chip”相同的方式進(jìn)行。
實施例之后,將參考實施例詳細(xì)說明本發(fā)明。然而,本發(fā)明不限于實施例。
(1)用于與聚組氨酸融合的蛋白A的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)造,和與聚組氨酸融合的蛋白A在大腸桿菌中的表達(dá)及其純化用于固定的蛋白是通過將聚組氨酸與蛋白A的5個重復(fù)B亞基串(氨基酸序列SEQ ID NO4)連接而制備的。編碼蛋白A的B亞基的DNA是通過PCR擴增的。將化學(xué)合成的多核苷酸(SEQ ID NO3)及其互補鏈多核苷酸(SEQ ID NO5)的混合物用作模板。使用具有pstI和AccI位點的5’側(cè)引物(SEQ ID NO1)和具有KpnI和AccI位點的3’側(cè)引物(SEQ ID NO2)作為引物,進(jìn)行PCR,其中95℃60秒、60℃30秒、72℃30秒,循環(huán)30次。
用AccI消化所得PCR產(chǎn)物,并使用連接試劑盒(Takara Bio Inc.)將編碼蛋白A的B亞基的各DNA相互連接起來。編碼蛋白A的產(chǎn)物可利用AccI以一個方向連接,這是因為AccI識別序列是非-回文序列。隨后該連接產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳,并將具有蛋白A的5個重復(fù)B亞基長度的那些從凝膠上切除下來。使用平端化試劑盒(Takara BioInc.),將該產(chǎn)物平端化并插入到pBluescript II SK(STRATAGENE)的EcoRV位點中。該質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌并從所得菌落中分離出來,根據(jù)常規(guī)方法用核苷酸測序儀測定所述核苷酸序列。所得質(zhì)粒被稱為pBluescript II SK-蛋白A。
如下,使用合成DNA(SEQ ID NOS6和7)將編碼含聚組氨酸的多肽(氨基酸序列SEQ ID NO8)的DNA與編碼蛋白A的DNA的羧基末端連接。在相同的試管中,將SEQ ID NOS6和7的合成DNA溶于10mM Tris-EDTA緩沖液中,并在64℃加熱1分鐘。加熱后,將溶液冷卻至室溫,由此雜交形成雙鏈DNA。將與含聚組氨酸的多肽相對應(yīng)的DNA序列插入到用Hind II和KpnI消化的pBluescript II SK-蛋白A中。按照與上述相同的方式證實該核苷酸序列。所得質(zhì)粒被稱為pBluescript II SK-蛋白A-His。
通過電穿孔將pBluescript II SK-蛋白A-His質(zhì)粒引入到大腸桿菌M15的感受態(tài)細(xì)胞中,并基于氨芐西林抗性獲得重組大腸桿菌。通過37℃在LB肉湯中培養(yǎng)所得重組大腸桿菌,并在600nm波長下的吸光度(細(xì)菌細(xì)胞的濃度)變?yōu)?.8時,以0.1mM的終濃度向LB肉湯中加入異丙基-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷,再培養(yǎng)大腸桿菌4小時。超聲波處理后,從細(xì)菌細(xì)胞獲得可溶性級分,并上樣到IgG-瓊脂糖凝膠柱(Pharmacia K.K.)上,從而純化表達(dá)蛋白,由此獲得與聚組氨酸融合的蛋白A。
(2)與聚組氨酸融合的蛋白A的電化學(xué)固定將上面部分(1)獲得的與聚組氨酸融合的蛋白A溶于0.1M磷酸鈉緩沖溶液(pH 5.8)中,終濃度達(dá)到0.3mg/ml,并以200mM終濃度加入NiCl2。4℃反應(yīng)2小時后,使與聚組氨酸融合的蛋白A與Ni2+形成配位鍵。為了除去游離的Ni2+離子,將1ml含有與聚組氨酸融合的蛋白A-Ni2+配合物的溶液倒在透析盒(Slide-A-Lyzer,PierceBiotechnology,Inc)中,并每20分鐘在1,000ml沒有Ni2+的磷酸鈉緩沖溶液(pH5.8)中透析一次,共透析兩次。Ni2+離子的配位鍵合是利用原子吸收分光光度計AA-670(Shimazu Corporation),通過原子吸收分析加以證實的。
將作為固定化支持物的鉑微電極浸在含有與Ni2+離子結(jié)合的聚組氨酸融合的蛋白A的溶液中。使用三電極系統(tǒng)施加電位,其中包括作為工作電極的鉑電極,作為對電極的鉑線圈,作為參比電極的銀-氯化銀電極,由此進(jìn)行固定化反應(yīng)。施加+300mV的初始電位5秒后,施加-100mV的恒定電位5分鐘。鉑微電極是通過將具有50μm外徑的鉑絲插入到鈉玻璃管(外徑1.2mm)中,用加熱器密封起來,并用金剛石紙(0.1μm篩目)將邊緣拋光而制備的。
通常,當(dāng)施加電位時,通過基于電荷的非-法拉第電流。然而,在出現(xiàn)還原反應(yīng)的情況下,觀察到非-法拉第電流和法拉第電流。由于施加還原電位而使二價鎳離子變?yōu)榱銉r鎳原子可通過測量法拉第電流加以證實。法拉第電流值是通過在不含Ni2+離子的反應(yīng)系統(tǒng)中測量實際電流值與非-法拉第電流值之間的差值測定的。觀察到320μA/cm2的法拉第電流,其證實通過固定化反應(yīng),二價鎳離子變?yōu)榱肆銉r鎳原子。
(3)與聚組氨酸融合的蛋白A的固定化狀態(tài)的評價結(jié)合Ni、與聚組氨酸融合的蛋白A的固定化狀態(tài)的評價是利用蛋白A與IgG抗體蛋白之間的特異性結(jié)合進(jìn)行的。將上述部分(2)中獲得的固定了與聚組氨酸融合的蛋白A的微電極浸在含0.5mg/ml辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)的0.1M磷酸鈉緩沖溶液(pH7.0)中。室溫溫育1小時后,利用超聲清潔器W-113(Honda)在0.1M不含辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG的磷酸鈉緩沖溶液(pH7.0)中超聲清洗微電極。隨后,將微電極浸在過氧化物酶發(fā)光基質(zhì)溶液(Duolux,由Pierce Biotechnology,Inc.制造)中。用發(fā)光計Gene Light 55(Microtec Co.,Ltd)測量發(fā)光量,并利用高靈敏度CCD-照相機L-1100(KEYENCE CORPORATION)觀察發(fā)光狀態(tài)。
圖2表示發(fā)光量的測量。當(dāng)沒有向電極施加電位且只浸在含有與Ni2+離子結(jié)合的聚組氨酸融合的蛋白A的溶液中時,沒有出現(xiàn)發(fā)光反應(yīng)。另一方面,當(dāng)把微電極浸在含有與Ni2+離子結(jié)合的聚組氨酸融合的蛋白A的溶液中,并向微電極施加-100mV的還原電位時,檢測到發(fā)光反應(yīng)。用光電倍增器測量發(fā)光量為1.4×1010cps(計數(shù)/秒)。雖然圖2中沒有顯示,但在按照與上述相同的方式,向含有未與Ni2+結(jié)合的聚組氨酸融合的蛋白A的溶液施加電位的情況下,沒有檢測到發(fā)光反應(yīng)。
圖3表示用高靈敏度的CCD照相機給其上進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)的電極拍攝的照片。當(dāng)電極上的電化學(xué)固定化是使用含有未與Ni2+結(jié)合的聚組氨酸融合的蛋白A的溶液進(jìn)行時,沒有檢測到發(fā)光反應(yīng)(A)。此外,當(dāng)沒有向電極施加電位且只將電極浸在含有與Ni2+離子配位鍵合的聚組氨酸融合的蛋白A的溶液中時,沒有檢測到發(fā)光反應(yīng)(B)。另一方面,當(dāng)把微電極浸在含有與Ni2+離子配位鍵合的聚組氨酸融合的蛋白A的溶液中,并向微電極施加-100mV還原電位時,檢測到發(fā)光反應(yīng)(C)。虛線表示電極在圖3的(A)和(B)中的位置,因為沒有觀察到發(fā)光。如上所述,證實了通過將組氨酸融合的蛋白A配位鍵合的Ni2+還原為Ni原子,可穩(wěn)定固定聚組氨酸融合的蛋白A。
此外,為了測定固定化所需的電位范圍,通過施加約+200mV--400mV范圍的電位進(jìn)行固定化,并使用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG評價所得固定化電極的發(fā)光。結(jié)果證實了可實現(xiàn)固定化,只要電位為-100mV或更高(未給出數(shù)據(jù))。
(4)固定化的聚組氨酸融合的蛋白A的解離通過施加250mV電位,將通過上述過程固定的聚組氨酸融合的蛋白A從鉑電極上解離下來。聚組氨酸融合的蛋白A自電極上的解離是通過使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG的發(fā)光方法加以證實的(未給出數(shù)據(jù))。測定能夠解離的電位范圍,發(fā)現(xiàn)施加+100mV或更高電位可實現(xiàn)解離。
(5)將聚組氨酸融合的蛋白A固定在具有尖頂?shù)你K支持物上使用具有探針的懸臂作為電極,其由硅基質(zhì)構(gòu)成且它的尖頂用鉑涂覆(Micro Cantilever with platinum coat,由Olympus Corporation制造)。通過下列過程固定聚組氨酸融合的蛋白A。即,將懸臂浸在5%牛血清白蛋白溶液中用于阻斷。按照與上述相同的方式,將懸臂浸在含有與Ni2+離子結(jié)合的聚組氨酸融合的蛋白A的溶液中,并相對于銀-氯化銀參比電極,施加-50mV電位5分鐘。使用電子顯微鏡證實固定化。
(6)從大腸桿菌溶解產(chǎn)物中純化聚組氨酸融合蛋白A37℃,將上述用pBluescript II SK-蛋白A轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在6孔平板的LB肉湯中,以15ml/孔培養(yǎng)4小時,然后向肉湯中加入IPTG,并進(jìn)一步溫育轉(zhuǎn)化體4小時。溫育完成后,用平板離心機使細(xì)菌細(xì)胞沉淀,然后用含Ni2+離子的磷酸鹽緩沖溶液(組成與上述相同)替換LB肉湯的上清液。隨后,如圖4所示,利用探針型超聲處理器使平板各孔中的細(xì)菌細(xì)胞破裂,然后將用于純化的掃帚型支持物浸在溶液中。通過向支持物施加-100mV電位,將溶液中聚組氨酸融合的蛋白A固定在支持物上。
然后,將用于純化的掃帚型支持物從溶液中取出,并浸在制備于不同的六孔平板中的解離緩沖溶液中(0.1M KH2PO4-K2HPO4和0.1MKCl(pH7.0))。然后,向支持物施加+250mV電位,且由此,固定化的聚組氨酸融合的蛋白A在解離緩沖溶液中解離。結(jié)果,純化0.45mg聚組氨酸融合的蛋白A/孔。最后,在沒有用洗脫緩沖液在柱上稀釋的情況下,快速且簡便地獲得了蛋白的純化。
工業(yè)實用性本發(fā)明固定了生物物質(zhì)的芯片優(yōu)選用于篩選藥物等,這是因為可以恒定的方向穩(wěn)定固定生物物質(zhì)如蛋白。此外,固定了生物物質(zhì)的芯片優(yōu)選用于研究目的,這是因為它可使生物物質(zhì)從導(dǎo)電性支持物上解離下來,從而在反應(yīng)后再次使用基質(zhì)和生物物質(zhì),并分析生物物質(zhì)。此外,它對于生物物質(zhì)的快速且簡便的純化是有用的。
序列表<110>Kitakyushu Foundation for the Advancement of Industry Science and Technology<120>固定了生物物質(zhì)的芯片及其用途<130>OP-C4005-PCT<150>JP 2003/69924<151>2003-03-14<150>JP 2003/207081<151>2003-08-11<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>1gctgcagtag acaacaaatt caacaaagaa c 31<210>2<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>2cggtaccgtc tacttttggt gcttgagcat c 31<210>3<211>177<212>DNA<213>金黃色葡萄球菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(177)<223>
<400>3gac aac aaa ttc aac aaa gaa caa caa aat gct ttc tat gaa att tta 48Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu1 5 10 15cat tta cct aac tta act gaa gaa caa cgt aac ggc ttc ate caa agc 96His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Set20 25 30ctt aaa gac gat cct tca gtg agc aaa gaa att tta gca gaa gct aaa144Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala GLu Ala Lys35 40 45aag cta aac gat gct caa gca cca aaa gct aga177Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Arg50 55<210>4<211>59<212>PRT<213>金黃色葡萄球菌
<400>4Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu1 5 10 15His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn G1y Phe Ile Gln Ser20 25 30Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys35 40 45Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Arg50 55<210>5<211>177<212>DNA<213>人工的<220>
<223>互補的<400>5tctagctttt ggtgcttgag catcgtttag ctttttagct tctgctaaaa tttctttgct 60cactgaagga tcgtctttaa ggctttggat gaagccgtta cgttgttctt cagttaagtt120aggtaaatgt aaaatttcat agaaagcatt ttgttgttct ttgttgaatt tgttgtc 177<210>6<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物
<400>6ccatcatcac caccatcact a 21<210>7<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>7agcttagtga tggtggtgat gatgggtac 29<210>8<211>8<212>PRT<213>人工的<220>
<223>聚組氨酸<400>8Gly Thr His His His His His His1 權(quán)利要求
1.一種固定了生物物質(zhì)的芯片,其中所述芯片包含導(dǎo)電性支持物和經(jīng)由金屬原子固定在導(dǎo)電性支持物上的生物物質(zhì),且其中所述生物物質(zhì)具有能夠與金屬離子形成配位鍵的部分,且所述金屬原子是通過還原金屬離子產(chǎn)生的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定了生物物質(zhì)的芯片,其中所述導(dǎo)電性支持物具有尖頂,且所述生物物質(zhì)經(jīng)由金屬原子而被固定在導(dǎo)電性支持物的尖頂上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固定了生物物質(zhì)的芯片,其中所述導(dǎo)電性支持物載于基質(zhì)上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任何一項所述的固定了生物物質(zhì)的芯片,其中所述能夠與金屬離子形成配位鍵的部分是聚組氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項所述的固定了生物物質(zhì)的芯片,其中所述導(dǎo)電性支持物是金屬。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項所述的固定了生物物質(zhì)的芯片,其中所述導(dǎo)電性支持物是選自金、銀、銅、鋁和鉑的一種或多種金屬。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任何一項所述的固定了生物物質(zhì)的芯片,其中所述金屬原子是通過還原二價金屬離子產(chǎn)生的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任何一項所述的固定了生物物質(zhì)的芯片,其中所述生物物質(zhì)是蛋白。
9.一種制造固定了生物物質(zhì)的芯片的方法,其包括下列步驟使具有能夠與金屬離子形成配位鍵部分的生物物質(zhì)與金屬離子形成配位鍵;使所得配合物接近導(dǎo)電性支持物;并向?qū)щ娦灾С治锸┘舆€原電位,并由此將具有能夠與金屬離子形成配位鍵部分的生物物質(zhì)固定在導(dǎo)電性支持物上。
10.一種分析生物物質(zhì)或樣品中的物質(zhì)的方法,包括使固定在權(quán)利要求1-8任何一項的固定了生物物質(zhì)的芯片上的生物物質(zhì)與含有能夠特異性結(jié)合該生物物質(zhì)的物質(zhì)的樣品反應(yīng);檢測通過結(jié)合固定化的生物物質(zhì)而與芯片間接結(jié)合的物質(zhì),并分析在固定了生物物質(zhì)的芯片上固定的生物物質(zhì)或樣品中的物質(zhì)。
11.一種分析生物物質(zhì)或樣品中的物質(zhì)的方法,包括使固定在權(quán)利要求1-8任何一項的芯片上的生物物質(zhì)與含有能夠特異性結(jié)合固定化的生物物質(zhì)的物質(zhì)的樣品反應(yīng);通過向?qū)щ娦灾С治锸┘友趸娢?,而從芯片的?dǎo)電性支持物上將反應(yīng)獲得的含有固定化的生物物質(zhì)和特異性結(jié)合生物物質(zhì)的物質(zhì)的配合物解離下來。
12.一種純化生物物質(zhì)的方法,包括下列步驟將導(dǎo)電性支持物浸在含有金屬離子和具有能夠與金屬離子形成配位鍵的部分的生物物質(zhì)的溶液中;向?qū)щ娦灾С治锸┘舆€原電位,從而使生物物質(zhì)固定在導(dǎo)電性支持物上;將上步獲得的、其上固定了生物物質(zhì)的導(dǎo)電性支持物浸在解離溶液中;并向?qū)щ娦灾С治锸┘友趸娢?,從而使生物物質(zhì)從導(dǎo)電性支持物上解離下來。
13.一種固定物質(zhì)的方法,包括下列步驟使具有能夠與金屬離子形成配位鍵的部分的物質(zhì)與金屬離子形成配位鍵;使所得配合物接近導(dǎo)電性支持物;并向?qū)щ娦灾С治锸┘舆€原電位,從而使物質(zhì)固定在導(dǎo)電性支持物上。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法,其中所述物質(zhì)是蛋白。
全文摘要
具有可與金屬離子配位鍵合的部分的生物物質(zhì)與金屬離子配位鍵合。該生物物質(zhì)接近導(dǎo)電性支持物,并向?qū)щ娦灾С治锸┘舆€原電位。如此,生物物質(zhì)被固定在導(dǎo)電性支持物上,從而制造出固定了生物物質(zhì)的芯片。
文檔編號B01J19/00GK1761878SQ20048000696
公開日2006年4月19日 申請日期2004年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月14日
發(fā)明者春山哲也 申請人:財團法人北九州產(chǎn)業(yè)學(xué)術(shù)推進(jìn)機構(gòu)