專利名稱：基于流控技術的測定裝置的制作方法
背景技術：
在測定試樣中存在和/或不存在分析物的試驗中，通常使用多種分析方法和裝置。例如，免疫測定法是利用免疫系統(tǒng)機制，即為了響應致病的或對生物體異質的抗原的存在而產生抗體。這些抗體和抗原，即免疫反應物，能夠互相結合，從而引起高度特異性反應機制，可用于檢測生物樣品中特定抗原的存在或者濃度。
一些已知的免疫測定方法利用被可檢測成分標記的免疫反應物以便在分析上可檢測到分析物。例如，典型地是，“夾層式”測定法涉及混合試樣與所述分析物的抗體。這些抗體是可移動的并聯(lián)接著標記物或者探針，如染色乳膠珠、膠體金溶膠、或放射性同位素。再將該混合物與含有固定的分析物抗體帶或區(qū)域的層析分離介質接觸。層析分離介質通常呈類似于量尺的條帶形式。當分析物和標記抗體的復合物到達層析分離介質上固定了抗體的區(qū)域時，就發(fā)生結合并且該結合的標記抗體滯留在該區(qū)域。這就指示了分析物的存在。該技術可用于獲得定量或半定量的結果。Grubb等人的4168146號和Tom等人的4366241號美國專利中描述了這種夾層式測定法的例子。
另一種技術為“競爭式”測定法。在“競爭式”測定法中，典型地是，標記物為標記的分析物或分析物類似物，其與樣品中存在的任何非標記的分析物競爭結合抗體。競爭性測定法被典型地用于檢測諸如半抗原的分析物，每個半抗原為單價的并且只能夠結合一個抗體分子。Deutsch等人的4235601號，Liotta的4442204號，以及Buechler等人的5208535號美國專利中描述了這種競爭性免疫測定裝置的例子。
磁性結合測定法被廣泛地用于從復雜樣品中分離生物物質(例如，蛋白質、細胞、微生物)，因為其易于通過磁場來操縱并且不需要專門的和昂貴的儀器。這樣，磁性免疫測定法可提供快速而簡單的技術來測定所述物質的存在與否。在這種測定方法中，使用了多種信號發(fā)生機制，包括顏色(吸收和反射)、熒光、化學發(fā)光、放射性以及酶。
然而，常規(guī)的磁性免疫測定法每次用于獲得分析物的定量信息時，通常需要對照樣品以制成校正曲線。特別是在分析試樣中生物物質的存在與否時，要同時測定多個對照樣品，用于所述已知量的物質，從而在近似相同的條件下校正所述測定。遺憾地是，所述校正方法通常不是很方便、成本較高，對測試者來說比較麻煩。因此，目前需要一種易于控制而且較為便宜的用于測定的準確校正系統(tǒng)。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，揭示了一種用于檢測試樣中分析物的存在或者量的基于流控技術的測定裝置(如，毛細管裝置)。該裝置包括反應腔室，所述腔室能夠容納含有試樣、可產生檢測信號的檢測探針、和可產生校正信號的磁性校正探針的溶液。一般來說，檢測探針和校正探針可以用能夠產生可檢測信號的任何物質構成。例如，一些實施方式中，這些探針選自于包括以下物質的組生色基團、催化劑、熒光化合物、化學發(fā)光化合物物、磷光化合物、放射性化合物、直接可見標記物、脂質體及其組合。例如，檢測探針和校正探針可以為熒光化合物，如熒光顆粒。在一個特別的實施方式中，檢測探針為熒光非磁性化合物，而校正探針為熒光磁性顆粒。如果需要的話，熒光磁性顆粒可以和特異性結合成分結合或者被阻斷。
與反應腔室流體連通的通道界定了檢測區(qū)。在一個實施方式中，該通道有助于溶液毛細管流動經(jīng)過該裝置。如果需要的話，可在反應腔室和通道之間設置一隔離物，用于將溶液保持在反應腔室中一定時間。在一個實施方式里，例如，該隔離物能夠被溶液基本溶解。這種隔離物包含的材料可選自包括以下物質的組碳水化合物(例如蔗糖、葡萄糖等)，鹽(氯化鈉等)，以及其組合。在另一個實施方式中，隔離物能夠發(fā)生物理斷裂。
磁性裝置設置在鄰近檢測區(qū)處，以便將檢測探針和校正探針從溶液中分離。例如，在夾層測定形式的一個實施方式中，當在反應腔室中時，檢測探針和校正探針與分析物形成復合物。當與檢測區(qū)的磁性裝置相通時，這些分析物的復合物以及任何未復合的校正探針從溶液中分離。
從而分離的檢測和校正探針(復合形式的和/或非復合形式的)能夠指示試樣中分析物的存在或者量。特別是，試樣中分析物的量與檢測區(qū)被分離出的檢測探針(復合形式的和/或非復合形式的)所產生的檢測信號強度成比例，所述檢測信號經(jīng)過檢測區(qū)中分離的校正探針(復合形式的和/或非復合形式的)產生的校正信號強度值校正。例如，在一個實施方式中，試樣中分析物的量與檢測信號強度和校正信號強度的商成比例。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方式，揭示了一種用于檢測試樣中分析物的存在或者量的方法。該方法包括i)提供基于流控技術的裝置，所述裝置包括a)含有能夠產生檢測信號的檢測探針以及能夠產生校正信號的磁性校正探針的反應腔室；b)與反應腔室流體連通并限定檢測區(qū)的通道；以及c)設置在鄰近檢測區(qū)處的磁性裝置；ii)將含有分析物的試樣加至所述反應腔室形成溶液；iii)使所述溶液從所述反應腔室流到所述通道的檢測區(qū)；iv)利用所述磁性裝置在檢測區(qū)從所述溶液中分離檢測探針和校正探針；v)激發(fā)所述分離的檢測探針(復合形式的和/或非復合形式的)以及所述分離的校正探針(復合形式的和/或非復合形式的)，其中所述激發(fā)作用引起所述分離的檢測探針發(fā)出檢測信號，以及所述分離的校正探針發(fā)出校正信號；vi)在第一發(fā)射波長處測量所述檢測信號的強度以及在第二發(fā)射波長測量所述校正信號的強度，所述第二發(fā)射波長可以與第一發(fā)射波長相同或不同；以及vii)比較所述檢測信號和所述校正信號的強度，其中試樣中分析物的量與經(jīng)校正信號強度值校正的檢測信號的強度值成比例。
分離的檢測探針和校正探針可以被同時地或者分別地激發(fā)。同樣，檢測信號和校正信號的強度可以被同時地或者分別地測量。另外，在一個實施方式中，所述方法還包括為多個預定分析物濃度對經(jīng)校正信號強度校正的檢測信號強度進行作圖，從而得到校正曲線。
下面更詳細地討論了本發(fā)明的其它特征和方面。
附圖簡述針對本領域的普通技術人員，說明書的以下部分參考以下附圖對本發(fā)明進行全面而且有效的公開，其中包括最佳實施方式，所述附圖包括

圖1是本發(fā)明的基于流控技術的裝置的一個實施方式透視圖；圖2是用于本發(fā)明的一種夾層測定形式實施方式的機制圖解說明；圖3是用于本發(fā)明的另一種夾層測定形式實施方式的機制圖解說明；圖4是用于本發(fā)明的一種競爭性測定形式實施方式的機制圖解說明；圖5是用于本發(fā)明的另一種競爭性測定形式實施方式的機制圖解說明；圖6是抗體與羧酸鹽納米顆粒共價結合的一個實施方式圖解說明；圖7表示根據(jù)本發(fā)明一個實施方式中的校正探針(C)和檢測探針(FP)的激發(fā)(EX)和發(fā)射(EM)光譜；圖8表示如實施例1中所討論的標準化熒光強度與促黃體生成激素(LH)量的關系曲線；圖9表示如實施例2中所討論的標準化熒光強度與促黃體生成激素(LH)量的關系曲線；以及圖10表示如實施例4中所討論的標準化熒光強度與C反應蛋白(CRP)量的關系曲線。
說明書和附圖中重復使用的附圖標記表示本發(fā)明的相同或類系特征或元件。
代表性實施方式詳述定義這里使用的術語“分析物”通常是指待檢測的物質。例如，分析物可包括抗原物質、半抗原、抗體及其組合。分析物包括但不限于毒素、有機化合物、蛋白質、肽、微生物、氨基酸、核酸、激素、類固醇、維生素、藥物(包括出于治療目的以及出于違禁目的而服用的)、細菌、病毒顆粒以及任何上述物質的代謝物或抗體。一些分析物的具體實施方式
包括鐵蛋白，肌酐激酶MIB(CK-MB)、地高辛、苯妥英、苯巴比妥、卡馬西平、萬古霉素、慶大霉素、茶堿、丙戊酸、奎尼丁、促黃體生成激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、雌二醇、孕酮、IgE抗體、維生素B2、微球蛋白、糖化血紅蛋白(Gly.Hb)、皮質醇、毛地黃毒苷、N-普魯卡因乙酰胺(NAPA)、普魯卡因胺、風疹抗體如風疹IgG和風疹IgM、弓形體抗體如弓形蟲IgG(Toxo-IgG)和弓形蟲IgM(Toxo-IgM)、睪丸激素、水楊酸鹽、醋氨酚、B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、B型肝炎核心抗原的抗體，如B型肝炎核心抗原IgG和IgM抗體(抗HBC)，人類免疫缺陷病毒1和2(HIV1和HIV2)、人類T細胞白血病病毒1和2(HTLV)、B型肝炎e抗原(HBeAg)、B型肝炎e抗原抗體(抗HBe)、促甲狀腺激素(TSH)、甲狀腺素(T4)、總三碘甲狀腺原氨酸(總T3)、游離三碘甲狀腺原氨酸(游離T3)、癌胚抗原(CEA)以及甲胎蛋白(AFP)。濫用藥物以及受到控制的物質包括但不限于，安非他明、脫氧麻黃堿、巴比妥酸鹽、如阿米妥、司可巴比妥、戊巴比妥、苯巴比妥、以及巴比妥、苯化重氮，如利眠寧和安定，大麻的化學成分，如印度大麻制劑和大麻葉和花制劑，可卡因，芬太尼，LSD，安眠酮，鴉片劑，如海洛因、嗎啡、可待因、二氫嗎啡酮、二氫可待因酮、美沙酮、羥可酮、氧嗎啡酮和鴉片，苯環(huán)己哌啶，以及丙氧吩。Tom等人的第4366241號美國專利中記載了其它可能的分析物。
這里使用的術語“試樣”通常涉及被懷疑含有所述分析物的材料。試樣可以從提供源中一獲得就直接使用或者經(jīng)由預處理步驟以改善樣品的性質。試樣可以獲得自任何生物來源，例如生理性液體，包括血液、唾液、接目鏡液體、腦脊髓液、汗液、尿液、乳汁、腹水、raucous、滑液、腹膜液、羊水或其類似物。試樣在使用前可經(jīng)過預處理，例如從血液中制備血漿，稀釋粘液，或類似處理。處理方法包括過濾、蒸餾、濃縮、滅活干擾組分，以及加入試劑。除了生理性體液之外，也可使用其它液體樣品，例如用于環(huán)境和食品生產測定的水、食物產品及其類似物。此外，被懷疑含有所述分析物的固體材料也可用作試樣。在一些例子中，最好對固體試樣進行修飾以便形成液體介質或者釋放出分析物。
發(fā)明詳述現(xiàn)在將詳細參考說明本發(fā)明的多個實施方式，它們的一個或多個實例列在了下面。每個提供的實例用于解釋發(fā)明，而不是對發(fā)明的限定。實際上，對本領域技術人員來說，在不偏離本發(fā)明范圍和實質的情況下很明顯可以做出各種修改和變化。例如，圖示或者描述說明的作為一個實施方式部分的特征，可以被用于另一個實施方式中從而得到另外一個實施方式。因此，如本發(fā)明所附的權利要求及其等價物的范圍中包括這類修改和變化。
本發(fā)明主要致力于一種用于檢測試樣中分析物的存在或量的基于流控技術的測定裝置。該裝置利用自校正的磁性結合測定系統(tǒng)(例如夾層測定，競爭性測定等等)，包括能產生檢測信號的檢測探針(例如熒光非磁性顆粒)以及能產生校正信號的校正探針(例如熒光磁性顆粒)。試樣中分析物的量與經(jīng)校正信號強度值校正過的檢測信號強度值成比例(例如正比或者反比)。已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的基于流控技術的裝置能提供用于測定試樣中分析物存在的精確、廉價、并且易于控制的方法。
例如，參見圖1-2，現(xiàn)在將更為詳細地說明根據(jù)本發(fā)明制成的基于流控技術的裝置20的一個實施方式。如圖1所示，裝置20具有與流體通道14流體連通的反應腔室12。盡管所示的反應腔室12與流體通道14基本上成線性關系，但應該明白，該反應腔室12與流體通道14也可以設置成其它的關系。另外，還應當明白的是，反應腔室12與流體通道14可以相同或者不同。比如在一個實施方式中，流體通道與反應腔室同為一個流體腔所界定。
將試樣應用于該反應腔室12以開始檢測試樣中的分析物?；蛘?，可將試樣應用于與反應腔室12流體連通的加樣腔室(未示出)。反應腔室12內還包含了多種檢測探針41以幫助檢測試樣中分析物的存在與否。這些探針41當處于反應腔室12內時保持可與分析物結合的狀態(tài)。一旦與分析物結合，探針41隨后用于鑒別分析物的存在或者不存在。檢測探針41既可用于裝置20的檢測又可用于其校正。然而在可替代的實施方式中，反應腔室12中也可應用單獨的校正探針43用來與檢測探針41結合以有助于同時進行校正和檢測，從而消除常規(guī)測定校正體系通常造成的不準確性。然而應當明白的是，檢測探針41和/或校正探針43可以同時地或者分別地施加至毛細管流動裝置20的任何部位上。而且，還可以向反應腔室12中加入其它化合物，例如有利于反應試劑的懸浮或者混合。
通常能夠產生可見的或者利用儀器可檢測到的信號的任何物質可被用作檢測探針41和/或校正探針43。有多種適合的物質包括生色基團，催化劑，熒光化合物，化學發(fā)光化合物，磷光化合物，放射性化合物，直接視覺觀察的標記物，包括膠體金屬(如金)和非金屬顆粒、染色顆粒、酶或底物、或者有機聚合物乳膠顆粒，脂質體或其它含有信號發(fā)生物質的囊泡，等等。例如，Litman等人的第4275149號美國專利中披露了一些適合作為探針的酶，在此出于各種目的對其進行全文引用作為參考。酶/底物體系的一個例子為堿性磷酸酶和底物硝基藍四唑-5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，或者其衍生物或類似物，或者4-甲基傘形酮(methylumbelliferyl)-磷酸鹽底物。Jou等人的第5670381號和Tarcha等人的第5252459號美國專利中還披露了其它合適的探針，在此出于各種目的對其進行全文引用作為參考。
在一些實施方式中，檢測探針41和/或校正探針43可以包括產生可檢測信號的熒光化合物。所述熒光化合物可為分子、聚合物、樹枝狀大分子、顆粒及類似物。例如，一些適合的熒光分子的例子包括但不限于，熒光素、銪螯合物、藻膽蛋白、羅丹明以及其衍生物和類似物。另外，還有一些商業(yè)上用的適合的熒光顆粒的例子，包括Molecular Probes公司出售的商品名為“FluoSphere”(Red580/605)和“TransfluoSphere2”(543/620)以及“Texas Red”的熒光羧基微球和同為Molecular Probes公司出售的5-和6-羧基四甲基羅丹明。
不論所采用的使探針具有信號生成能力的技術，人們通常希望探針41和/或校正探針43為磁感應探針。一般來說，如果一種材料受施加的磁場影響，例如，被吸引或排斥或者具有可檢測的磁化率或感應度，就被認為是具有“磁感應性”或者“磁性”。例如，一些可用于向探針提供磁性能的合適的磁感應性材料的例子包括但不限于，順磁性材料、超順磁性材料、鐵磁性材料、亞鐵磁性材料以及變磁性材料。特別的例子有，金屬如鐵、鎳、鈷、鉻、錳等，鑭系元素如釹、鉺等，合金如鋁、鎳、鈷、銅等的磁性合金，氧化物如氧化鐵(Fe3O4)、氧化亞鐵(Fe2O3)、氧化鉻(CrO2)、氧化鈷(CoO)、氧化鎳(NiO2)、氧化錳(Mn2O3)等，復合材料如鐵素體等，以及固溶體如氧化鐵磁鐵礦等。
在一些實施方式中，檢測探針41和/或校正探針43是熒光的并且具有磁性。熒光磁性探針在本領域中一般來說是已知的并且通常包括磁感應成分和熒光成分。例如在一些實施方式中，將一個或多個熒光染料應用于磁性顆粒上以形成探針，而在其它的實施方式中，將熒光染料(們)應用于與磁性顆粒偶聯(lián)的非磁性顆粒上。一些適合的熒光染料的例子包括但不限于，單甲川染料、三甲川染料、五甲川染料、喹啉染料、方酸基染料等等。嘧啶類的單甲川染料典型地能發(fā)出藍色或綠色的熒光，而喹啉類典型地能發(fā)出綠色或黃綠色熒光。三甲川染料基本上漂移至紅光波長，而五甲川染料漂移的更遠，常呈現(xiàn)紅外熒光輻射。這種熒光染料的特例包括單不限于酞菁、2，3-萘肽菁、方酸菁(squaraine)以及克酮酸衍生物。相信其它合適的熒光磁性顆粒記載在Luotola等人的第4731337號、Chandler等人的第6268222號美國專利中。在此出于各種目的對其進行全文引用作為參考。
當檢測探針41和/或校正探針43是如上所述的顆粒時，一般來說根據(jù)諸如所選顆粒的類型、膜上孔大小以及膜組分之類的因素，顆粒的平均直徑可隨需要而變化。例如在一些實施方式中，顆粒探針的平均直徑范圍可以從大約0.01微米到大約1000微米，一些實施方式中從大約0.01微米到大約100微米，而在一些實施方式中從大約0.01微米到大約10微米。在一個特別的實施方式中，顆粒探針具有的平均直徑從大約1至大約2微米。一般來說，顆?；旧蠟榍蛐?，但是在本發(fā)明中也適合使用其它的形狀，包括但不限于，盤狀、桿狀、棒狀、不規(guī)則形狀等等。本領域技術人員來應明白，顆粒的組成、形狀、尺寸和/或密度可以有很大范圍的變化。
檢測探針41和/或校正探針43能夠與分析物結合(共價或非共價地)或者物理吸附。然而通常需要以一些方式對探針進行修飾，以便其更易于與分析物結合。在這種情況下，檢測探針41和/或校正探針43可用某些特異性結合組分90a和/或90b(參見圖2)進行修飾，所述特異性結合組分連接其上形成探針配合物。
特異性結合組分一般來說涉及特異性的結合對組分，即兩個不同的分子，其中一個分子與第二個分子化學和/或物理結合。例如，免疫反應性特異性結合組分包括抗原、半抗原、寡核苷酸配基(aptamer)、抗體及其復合物，包括通過重組DNA方法或者肽合成法而制成的?？贵w可以是單克隆或者多克隆抗體，重組蛋白或其混合物或片段，以及抗體和其它特異性結合組分的混合物。這類抗體的制備方法以及其作為特異性結合組分的適用性的詳細內容對本領域技術人員來說是已知的。
其它常規(guī)的特異性結合對包括但不限于，生物素與抗生物素蛋白，碳水化合物與凝集素，互補核苷酸序列(包括DNA雜交試驗中用來檢測目標核酸序列的探針和捕獲核酸序列)，互補肽序列包括那些通過重組方法獲得的序列，效應物與受體分子，激素與激素結合蛋白，輔酶與酶，酶抑制劑與酶等等。此外，特異性結合對還可包括原特異性結合組分的類似物組分。例如，還可以采用分析物的衍生物或者片段，即分析物類似物，只要其具有至少一個與分析物相同的抗原表位。
通常利用各種已知技術中的任何一種就能使特異性結合組分90a和/或90b聯(lián)接至探針41和/或43上。例如，利用羧基、氨基、醛基、溴化乙?；⒌饣阴；?、硫醇基、環(huán)氧基以及其它反應性或聯(lián)接官能團，以及自由基殘基和自由基正離子可以實現(xiàn)特異性結合組分90a和/或90b與探針41和/或43的共價聯(lián)接，通過其能夠完成蛋白質的偶聯(lián)反應。也可以引入表面官能團作為功能化的共聚單體，這是因為微粒的表面可以含有較高濃度的極性基團。而且，盡管微粒探針通常在合成后進行功能化，但在諸如聚(苯硫酚)這類的情況下，微粒能夠與蛋白質直接共價聯(lián)接而不需要進一步修飾。例如，參見圖6，其表示了本發(fā)明一個實施方式中共價結合探針的過程。如圖所示，結合過程的第一步為利用碳化二亞胺在探針表面上活化羧基。第二步，活化的羧酸基團與抗體的氨基反應形成酰胺鍵。所述活化作用和/或抗體偶聯(lián)可在緩沖液中進行，例如磷酸鹽緩沖液(PBS)(如pH值7.2)或2-(N-嗎啉)乙基磺酸(MES)(如pH值5.3)。如圖所示，得到的探針可以再被例如乙醇胺所阻斷，從而形成探針復合物。除了共價聯(lián)接，其它聯(lián)接技術如吸附作用也可用于本發(fā)明。
再參見圖1，首先將含有分析物的試樣加至到反應腔室12中，在這里分析物與檢測探針41和/或校正探針43混合。根據(jù)所選的探針類型，分析物可與檢測探針41和/或校正探針43結合形成復合物49(參見圖2)。例如，在一個實施方式中，含有分析物的試樣與(1)和第一結合組分90a結合的熒光非磁性顆粒41以及(2)和第二結合組分90b結合的熒光磁性顆粒43混合。在該實施方式中，分析物與熒光非磁性顆粒41和熒光磁性顆粒43形成夾層復合物49。
盡管不必要，但通常希望試樣可在反應腔室12內保持足夠的時間使復合物49充分地形成。因此在一個實施方式中，可在反應腔室12和流體通道14之間設置隔離物70。該隔離物70可以以多種方式控制液體從反應腔室12向流體通道14的流動。例如在一些實施方式中，隔離物70由在一定時間后基本溶解在溶液中的材料構成。這種可用于構成隔離物70的可溶性材料的例子包括但不限于，碳水化合物(例如蔗糖、葡萄糖等)，鹽(氯化鈉等)等等。另外，隔離物70還可以是在一段時間后能夠斷裂或以其它方式破裂的物理性隔離物。這類物理性隔離物的例子包括但不限于，隔膜、隔片、薄硅膠片等等。不管是被溶解還是物理斷裂，隔離物70的消失速度通常取決于所選擇的材料以及該隔離物70的幾何形狀。例如，在一些實施方式中，隔離物70在x-軸向上的長度范圍可以從大約1微米到大約1厘米，而在一些實施方式中，從大約10微米到大約1毫米。
也可以使用其它技術來控制試樣停留在反應腔室12中的時間。例如，在一些實施方式中，隔離物70可以由通常為疏水性的物質構成以便對水溶液產生排斥，但是經(jīng)過一定的時間后還能使其具有足夠的親水性以便允許水溶液通過。例如隔離物70可包括疏水性表面，如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、硅彈性體等等。在一個實施方式中，反應腔室12內探針和/或分析物的結合使疏水性隔離物改變至相對親水性的區(qū)域。親水性表面的產生使得試樣從反應腔室12流到流體通道14中。這樣，一旦隔離物70變成親水性時，經(jīng)過裝置20剩余部分的液體流動并不受到影響。這種疏水/親水性隔離物的例子記載在Buechler的第5885527號美國專利中，在此出于各種目的對其進行全文引用作為參考。除了上述的延時性裝置外，也可以使用多種其它的用于延遲液流的裝置，在Columbus的第4426451號，Zuk等人的4435504號，Valkirs等人的4727019號，Ullman等人的4857453號，Devaney，Jr.等人的4877586號，Brown III等人的4916056號，以及Hillman等人的4963498號美國專利中有所記載。
在腔室12內反應足夠的時間后，接著可將復合物49和任何未結合的探針41和/或43通過流體通道14移入檢測區(qū)31。如果需要，可以選擇流體通道14的幾何形狀，這樣毛細作用力有助于試樣從反應腔室12流動到流體通道14。例如，在一些實施方式中，流體通道14在y-軸向上的寬度范圍可從大約1微米到大約5厘米，而在一些實施方式中，從大約50微米到大約500微米。另外，流體通道14在x-軸向上的長度范圍可從大約1毫米到大約50厘米，而在一些實施方式中，從大約10毫米到大約50毫米。另外，流體通道14在z-軸向上的高度范圍可從大約0.1微米到大約50毫米，而在一些實施方式中，從大約5微米到大約500微米。
在檢測區(qū)31，接著將復合物49與任何未結合的復合熒光磁性顆粒43通過磁性裝置60捕獲，并采用常規(guī)技術從剩余樣品中分離。例如，可用磁場發(fā)生器產生磁場引起磁感應性探針的感應。合適的磁場發(fā)生器包括但不限于，永磁體和電磁體。典型的磁分離過程包括在液體介質中將樣品與磁性顆?；旌贤ㄟ^親和反應結合分析物，再通過施加磁場將未結合的磁性顆粒與分析物復合物從樣品介質中分離。如果不是全部的磁性顆粒，則大多數(shù)磁性顆粒會及時沉淀下來，除了那些膠體顆粒。因而，可以攪拌該液體介質從而使顆粒懸浮足夠長的時間以便發(fā)生生物親和性結合反應。已知的攪拌方法例子包括晃動、渦流、搖動、旋轉或類似操作于部分填充的容器。一些商業(yè)上使用的合適的磁性分離裝置包括紐約成功湖的Dynal公司生產的Dynal MPC系列分離器，其中在容器的外部設置永磁體，所述容器用于容納測試介質，該裝置僅僅用于分離。單獨對測試介質中的磁性顆粒進行混合從而進行親和結合反應。此外，其它用于捕獲磁性顆粒的方法在Liberti等人的5200084號，Tuunanen等人的5647994號，Wang等人的5795470號，以及Siddiqi的6033574號美國專利中有所記載，在此出于各種目的對其全文引用作為參考。
一旦被捕獲，復合的和未復合的熒光磁性顆粒43以及復合物49的熒光信號可以用常規(guī)的技術測得。例如，在一個實施方式中，顆粒43和復合物49可被相同的外部源激發(fā)。在該實施方式中，該激發(fā)源提供了激發(fā)波長的輻射，從而引起顆粒43發(fā)光，其波長與復合物49發(fā)出的波長不同。這就可以分別測得復合物49與顆粒41的存在。或者，也可以使用分別的外部源來分別測量顆粒43與復合物49。
一般來說，熒光是特定熒光化合物發(fā)生的三步過程的結果。第一步中，外部源諸如白熾燈或激光提供能量并被熒光化合物所吸收，形成激發(fā)電子單重態(tài)。第二步中，激發(fā)態(tài)存在有限的時間，在此期間熒光化合物經(jīng)歷了構象變化并與其分子環(huán)境發(fā)生多種可能的交互作用。在此期間，激發(fā)態(tài)能量部分消耗，形成弛豫態(tài)，由此產生熒光發(fā)射。第三步是熒光發(fā)射階段，其中能量被釋放，熒光化合物回到其基態(tài)。發(fā)射的能量低于其激發(fā)能量(光或者激光)因而波長較長。這種能量或者波長的偏移或者區(qū)別使得發(fā)射能量可被檢測得到并且可與激發(fā)能量相區(qū)別。
一般來說，熒光檢測利用波長過濾從激發(fā)光子中分離發(fā)射光子，以及利用檢測器記錄發(fā)射光子并產生可記錄的輸出，所述輸出通常是電信號或者攝影圖像。通常有四種類型的公知檢測器熒光分光光度計與微板讀數(shù)器，熒光顯微鏡，熒光掃描儀以及流式細胞儀。本發(fā)明使用的一種適合的熒光檢測器為新澤西Edison的SPEX工業(yè)公司銷售的FluoroLogIII熒光分光光度計。
盡管不需要，但特別理想的檢測和校正探針對的選擇標準包括(1)吸收光譜或者或熒光光譜沒有或者很少有光譜重疊，這樣才能分別地測量發(fā)射強度；(2)當相互接近時檢測和校正探針之間沒有顯著的熒光能量傳遞，這樣它們能夠獨立地發(fā)光；以及(3)相對較長的發(fā)射波長(例如大于約600nm)，這樣生物液體的自身熒光對該熒光測量中的影響很小。例如圖7表示了激發(fā)光譜具有很少重疊的校正探針和檢測探針的例子，這樣它們能夠分別地被激發(fā)。
另外如果需要，已知的“時間分辨熒光檢測”技術也可用于本發(fā)明。時間分辨熒光檢測的設計是利用一定熒光材料，如銪((III))和鋱((III))的鑭系螯合物的熒光特性，減少來自于發(fā)射源或者散射過程(激發(fā)輻射的散射引起)的背景信號。當在較短波長處激發(fā)螯合物后，這些螯合物顯示出強烈的紅色飄移、窄帶、長壽命的發(fā)射。典型地是，由于生色基團在分子中離鑭系元素位置很近，該螯合物具有強烈的紫外吸收帶。在生色基團吸收了光之后，激發(fā)能量可從該激發(fā)的生色基團傳遞到鑭系元素。接著該鑭系元素具有了熒光發(fā)射特性。采用脈沖式激發(fā)和按時選通的檢測，以及窄帶發(fā)射濾波器，可以僅僅對來自鑭系元素螯合物的熒光進行特定檢測，而排除樣品中存在的其它物質的發(fā)射，這些發(fā)射光通常壽命較短或者是具有較小波長的發(fā)射。測量熒光的其它時間分辨技術在Davidson的5585276號和Hemmila等人的5637509號美國專利中有所記載，在此出于各種目的對其進行全文引用作為參考。
不考慮測量熒光的技術，通過比較捕獲的熒光非磁性顆粒41與捕獲的熒光磁性顆粒43的熒光信號可以確定分析物的絕對量?？蓪Σ东@的熒光非磁性顆粒41的熒光強度Is與捕獲的熒光磁性顆粒43的熒光強度Ic進行比較。捕獲的熒光磁性顆粒43的總量為預定和已知的，因而可以作校正目的使用。例如，在一個實施方式中，分析物的量與Is與Ic的比率成正比。根據(jù)檢測區(qū)31的強度范圍，可以確定分析物大致的濃度范圍。結果，校正和樣品測試可在大致相同的條件下同時操作，這樣就提供了可靠的定量或半定量的結果，靈敏度也有所提高。
如果需要，可以在已知的分析物濃度范圍內對Is與Ic的比率和分析物濃度進行作圖從而得到校正曲線。為了測得未知試樣中分析物的量，根據(jù)該校正曲線可將該信號比轉換成分析物濃度。值得注意的是，對于任意給定樣品，復合的和未復合的熒光磁性顆粒的捕獲效率通常是相同的。因此，并不認為捕獲效率的改變會顯著干擾樣品與樣品之間的結果，這是因為用熒光強度比率(即Is/Ic)代替了絕對的熒光。還應注意的是，也可以就Is與Ic的其它數(shù)學關系對分析物濃度進行作圖從而得到校正曲線。例如，在一個實施方式中，可以就Is/(Is與Ic)的值對分析物濃度進行作圖從而得到校正曲線。
再參見圖1，任何在檢測區(qū)31中未結合的探針或復合物繼續(xù)沿流動通道14流動直到它們到達吸收墊28并在其上聚集。盡管并不是必要的，但該吸收墊28可有助于增加毛細作用和并促進液體流過裝置20。可用于構成吸收墊28的合適的材料包括但不限于硝酸纖維素、纖維素、多孔聚乙烯墊，以及玻璃纖維濾紙。
根據(jù)本發(fā)明也可設計其它各種實施方式。例如，參見圖3，上述的和圖1所示的裝置20也可變?yōu)閵A層測定的另一種形式。例如在一個實施方式中，先將含有分析物的試樣與(1)結合了第一結合組分190a的熒光非磁性顆粒141a，(2)熒光磁性顆粒143，以及(3)結合了第二結合組分190b的熒光磁性顆粒141b混合。在該特別實施方式中，熒光磁性顆粒143可被諸如β-酪蛋白的阻斷劑阻斷，以防止與分析物的非特異性結合，從而使這些顆粒143僅僅用作校正探針。此外，第一特異性結合組分190a和第二特異性結合組分190b可以為分析物類似物。
術語“阻斷劑”意思是連接到探針表面使之“阻斷”或防止非分析物質與該表面結合的試劑。阻斷劑可包括但不限于，β-酪蛋白，白蛋白如牛血清白蛋白，pluronic或其他表面活性劑、聚乙二醇、聚乙烯醇，或者上述化合物的硫衍生物，以及其它本領域普通技術人員公知的阻斷材料。
參見圖3，分析物與復合的熒光非磁性顆粒141a和復合的非熒光磁性顆粒141b形成夾層復合物149。復合物149可以從反應腔室12移動到流體通道14內的檢測區(qū)31。在檢測區(qū)31，接著復合物149以及任何未結合的顆粒143和/或141b被磁性裝置60所捕獲并從剩余樣品中分離。如上所述，通過比較捕獲的熒光非磁性顆粒141a的熒光強度Is與捕獲的熒光磁性顆粒143的熒光強度Ic，可以確定分析物的絕對量。特別是捕獲的熒光磁性顆粒143的總量是預定和已知的，因而可以作校正目的使用。因此，在該實施方式中分析物的量與Is和Ic的比例成正比。
另外，參見圖4，上述的和圖1所示的裝置20也可變?yōu)楦偁幮詼y定。例如在一個實施方式中，先將含有分析物的試樣與(1)結合了第一結合組分290a的熒光非磁性顆粒241，以及(2)結合了第二結合組分290b的熒光磁性顆粒243混合。在該特別實施方式中，第一結合組分290a可與分析物相同，而第二結合組分290b可以為分析物類似物。
混合之后，分析物與復合的熒光非磁性顆粒241競爭復合的熒光磁性顆粒243，這樣形成了分析物與熒光磁性顆粒243的復合物249a以及熒光磁性顆粒243與熒光非磁性顆粒241的復合物249b。復合物249a和249b可從反應腔室12中移動到流體通道14中的檢測區(qū)31。在檢測區(qū)31，接著復合物249a和249b以及任何未結合的顆粒243被磁性裝置60所捕獲并從剩余樣品中分離。如上所述，通過比較捕獲的熒光非磁性顆粒241的熒光強度Is與捕獲的、復合或未復合的熒光磁性顆粒243的熒光強度Ic，可以確定分析物的絕對量。特別是捕獲的熒光磁性顆粒243的總量是預定和已知的，因而可以作校正目的使用。因此，在該實施方式中分析物的量與Is和Ic的比率成反比。
參見圖5，上述的和圖1所示的裝置20也可變?yōu)榱硪环N競爭性測定形式。例如在一個實施方式中，先將含有分析物的試樣與(1)結合了第一結合組分390a的熒光非磁性顆粒341a，(2)熒光磁性顆粒343，以及(3)結合了第二結合組分390b的非熒光磁性顆粒341b混合。在該特別實施方式中，第一結合組分390a可與分析物相同，而第二結合組分390b可以為分析物類似物。此外，熒光磁性顆粒343可被諸如β-酪蛋白的阻斷劑阻斷，以防止與分析物的非特異性結合，從而這些顆粒只用作校正探針。
混合之后，分析物與復合的熒光非磁性顆粒341a競爭復合的非熒光磁性顆粒341b，這樣形成了分析物與非熒光磁性顆粒341b的復合物349a以及非熒光磁性顆粒341b與熒光非磁性顆粒341a的復合物349b。復合物349a和349b可從反應腔室12中移動到流體通道14中的檢測區(qū)31。在檢測區(qū)31，接著復合物349a和349b以及任何未復合的顆粒343和/或341b被磁性裝置60所捕獲并從剩余樣品中分離。如上所述，通過比較捕獲的熒光非磁性顆粒341a的熒光強度Is與捕獲的熒光磁性顆粒343的熒光強度Ic，可以確定分析物的絕對量。特別是捕獲的熒光磁性顆粒343的總量是預定和已知的，因而可以作校正目的使用。因此，在該實施方式中分析物的量與Is和Ic的比率成反比。
盡管上面描述了該裝置構造的多種實施方式，但應當明白的是，一般來說裝置20可以具有任何想要的構造。例如，裝置20可含有多個流體通道14和/或反應腔室12。在這種情況下，利用裝置20可以實現(xiàn)更多數(shù)量的分析物的同時檢測。此外，裝置20還可使用不同的測定形式。例如，可以形成如圖4所示和上面所描述的競爭性測定，除了顆粒241是熒光磁性顆粒而顆粒243是熒光非磁性顆粒。同樣，可以形成如圖5所示和上面所描述的競爭性測定，除了顆粒341a是非熒光磁性顆粒而顆粒341b是熒光非磁性顆粒。其它多種裝置構造和/或測定形式在Cottingham的4596695號，Cox等人的5145784號，Lambotte等人的5395754號，Jou等人的5670381號以及Malick等人的6194220號美國專利中有所記載，在此出于各種目的對其全文引用作為參考。
另外，盡管上面描述了多種實施方式，特別地涉及將熒光用作校正和檢測機制，但其它已知的檢測機制也同樣可應用于本發(fā)明。例如，在一些實施方式中，檢測和/或校正探針可為化學發(fā)光或者磷光化合物。例如化學發(fā)光探針可以通過使用本領域已知的適當?shù)姆磻锛ぐl(fā)。根據(jù)本發(fā)明還可以設計出其它的實施方式和構造。
發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的基于流控技術的測定裝置可用于控制磁性探針并建立分析物的分離和檢測。特別是將磁性分離和檢測技術(例如熒光)結合在一完整系統(tǒng)中。而且，該系統(tǒng)是自校正的從而消除了使用常規(guī)的外部校正技術時對對照校正樣品的需要。在一個實施方式中，通過使用熒光磁性探針實現(xiàn)自校正。熒光磁性探針以及熒光非磁性探針發(fā)出的熒光可以在同一樣品中分別被檢測到。因為磁性顆粒的數(shù)量是預定的，當確定被捕獲的熒光非磁性探針的量并隨后確定分析物的量時，系統(tǒng)進行自校正。另外，由于校正和檢測探針的熒光是在同樣條件下同時測量的，可以避免諸如溫度和儀器不穩(wěn)定性等許多變化可能造成的干擾，從而提高檢測可靠性和穩(wěn)定性。
參考以下實施例，可以更好地理解本發(fā)明。
實施例1證明了利用如圖3所示的夾層測定法可檢測分析物存在的能力。首先將下列組分加入6個Eppendorf管中(1)25微升共價結合的非熒光磁性顆粒(PBS緩沖液中3毫克每毫升)；(2)15微升共價結合的熒光非磁性顆粒(PBS緩沖液中2毫克每毫升)；(3)10微升用β-酪蛋白(PBS緩沖液中3毫克每毫升)阻斷的熒光磁性顆粒；以及(4)促黃體生成激素(LH)分析物，范圍從0，10微升(1微克每毫升)，20微升(1微克每毫升)，40微升(1微克每毫升)，40微升(2微克每毫升)，到80微升(2微克每毫升)。
向每個Eppendorf管加入適量的PBS緩沖液至最終體積為150微升。在室溫下孵化并輕輕搖動該試樣10分鐘。再通過Dynal公司的磁性分離器將磁性顆粒分離。棄去每個管的上清液再將磁性顆粒重新懸浮于1.5毫升的PBS中。每次熒光測量使用300微升該熒光磁性顆粒懸浮液。用N.J.Edison SPEX工業(yè)公司的“Fluorolog III熒光分光光度計”采用直角模式測量樣品的熒光。對于熒光磁性顆粒，采用470納米的激發(fā)波長和560納米的發(fā)射波長，對于熒光非磁性顆粒，采用570納米的激發(fā)波長和605納米的發(fā)射波長。積分時間為0.2秒。
圖8顯示了作為每個樣品中LH量的函數(shù)的標準化和校正后的熒光強度。將測量的樣品的熒光強度除以對照樣品的熒光強度得到標準化強度。對照樣品為不含分析物的樣品。
實施例1中所用的顆粒形成如下非熒光磁性顆粒通過磁分離器將125微升10％的經(jīng)羧基修飾的順磁性顆粒(0.35微米，Estapor超順磁性微球，來自Bang’s Laboratories公司)用1.5毫升碳酸鹽緩沖液洗滌一次，PBS洗滌兩次。再將洗滌后的顆粒重新懸浮于0.6毫升的PBS和15毫克的碳二亞胺(來自Polysciences公司)中。在振蕩器上使該混合物在室溫下(RT)反應30分鐘。再將活化的顆粒用硼酸鹽緩沖液洗滌兩次。將該活化的顆粒再次重懸浮于1.2毫升的硼酸鹽緩沖液中。之后，將30微升LHβ-單克隆抗體(9.8mg/ml，購自Fitzgerald國際工業(yè)公司)加入該活化的顆粒中。室溫下讓反應混合物在振蕩器上反應過夜。然后收集該活化的顆粒并在1毫升0.1摩的乙醇胺中孵化并輕搖15分鐘。再將該顆粒用PBS洗滌兩次并在4℃下儲存于含有0.1摩PBS，0.15摩NaCl，1％β-酪蛋白，5％甘油以及0.1％NaN3的緩沖液中。
熒光非磁性顆粒根據(jù)上述步驟將“熒光非磁性”顆粒共價結合，但是所述結合組分是LHα-單克隆抗體(9.8毫克每毫升，購自于Fitzgerald國際工業(yè)公司)，而不是LHβ-單克隆抗體。所用的該顆粒是購自于Molecular Probes公司的FluoSpheres羧基修飾微球。該顆粒尺寸為0.5微米，在580納米波長激發(fā)下發(fā)出紅色熒光，并且其發(fā)射波長為605納米。
熒光磁性顆粒在Eppendorf管中加入100微升2.76％熒光超順磁性顆粒的固體(購自于賓西法尼亞沃靈頓的Polysciences公司)懸浮液和1毫升硼酸鹽緩沖液(0.1摩，pH＝8.5)。這些顆粒平均直徑在1至2微米之間，并且確信為含鐵微球，其具有可以被動吸附的聚乙烯表面以及與蛋白質反應的官能團。通過購自于Dynal公司的磁性分離器分離該顆粒，并重懸于200微升的0.1摩硼酸鹽緩沖液中，該緩沖液中含有10毫克每毫升的β-酪蛋白。懸浮液孵化30分鐘并輕輕混勻。上述步驟重復兩次。所述分離的顆粒重懸于200微升PBS中并且4℃儲存。
促黃體生成激素(LH)“促黃體生成激素(LH)”購自于Fitzgerald國際工業(yè)公司。
實施例2證明了利用如圖2所示的夾層測定法可檢測分析物存在的能力。首先將下列組分加入6個Eppendorf管中(1)5微升共價結合的熒光非磁性顆粒(PBS緩沖液中2毫克每毫升)；(2)15微升物理吸附的結合熒光磁性顆粒(PBS緩沖液中3毫克每毫升)；以及(3)促黃體生成激素(LH)分析物范圍從0，5，10微升到20，40，100微升(2微克每毫升)。
向每個Eppendorf管加入適量的PBS緩沖液至最終體積為150微升。室溫下孵化并輕輕搖動該試樣25分鐘。再通過Dynal公司的磁性分離器將磁性顆粒分離。棄去每個管的上清液再將磁性顆粒重新懸浮于1.5毫升的PBS中。每次熒光測量使用300微升該熒光磁性顆粒懸浮液。用N.J.Edison SPEX工業(yè)公司的“Fluorolog III熒光分光光度計”采用直角模式測量樣品的熒光。對于熒光磁性顆粒，采用470納米的激發(fā)波長和560納米的發(fā)射波長，對于熒光非磁性顆粒，采用570納米的激發(fā)波長和605納米的發(fā)射波長。積分時間為0.2至1秒。
圖9顯示了作為每個樣品中LH量的函數(shù)的標準化和經(jīng)校正的熒光強度。
實施例2中所用的顆粒形成如下熒光非磁性顆粒“熒光非磁性”顆粒的形成如實施例1中所述。
熒光磁性顆粒將2.76毫克熒光超順磁性顆粒(2.5％固體水懸浮液)購自于賓西法尼亞沃靈頓的Polysciences公司。將該顆粒用硼酸鹽緩沖液洗滌三次，并通過購自于Dynal公司的磁分離器分離該顆粒。將洗滌后的顆粒重懸于200微升硼酸鹽緩沖液，并加入82微克β-促黃體生成激素(β-LH)單克隆抗體(1毫克每毫升，購自于Fitzgerald國際工業(yè)公司)。將該混合物在室溫下輕輕混勻過夜。再通過磁分離器收集該顆粒，并在200微升β-酪蛋白(硼酸鹽緩沖液中10毫克每毫升)中孵化30分鐘并輕輕混勻以阻斷非特異性的結合位點。被阻斷的顆粒用PBS洗滌兩次并儲存在0.1摩的PBS中。
促黃體生成激素(LH)“促黃體生成激素(LH)”購自于Fitzgerald國際工業(yè)公司。
實施例3自校正的磁性結合測定法與非校正性的磁性結合測定法比較。
沒有自校正首先將下列組分加入5個Eppendorf管中(表I中第2-6號管)(1)15微升共價結合的非熒光磁性顆粒(0.1摩PBS緩沖液中3毫克每毫升)；(2)15微升共價結合的熒光非磁性顆粒(PBS緩沖液中2毫克每毫升)；(3)20微升促黃體生成激素(LH)分析物(1微克每毫升)；以及(4)20微升PBS。
對照Eppendorf管中僅含有20微升PBS(表I中第1號管)。
室溫下孵化并輕輕搖動該樣品20分鐘。再通過Dynal公司的磁分離器將磁性顆粒分離。棄去每個管的上清液再將磁性顆粒重新懸浮于1.5毫升的PBS中。每次熒光測量使用300微升該熒光磁性顆粒懸浮液。用N.J.Edison SPEX工業(yè)公司的“Fluorolog III熒光分光光度計”采用直角模式測量樣品的熒光。在不同天，采用570納米的激發(fā)波長和605納米的發(fā)射波長，測量熒光。
表I列出了每天測得的相對熒光數(shù)據(jù)。
表I熒光檢測
具有自校正首先將下列組分加入5個Eppendorf管中(表II中第9-13號管)(1)15微升共價結合的非熒光磁性顆粒(0.1摩PBS緩沖液中3毫克每毫升)；(2)15微升共價結合的熒光非磁性顆粒(PBS緩沖液中2毫克每毫升)；(3)20微升被β-酪蛋白(PBS緩沖液中3毫克每毫升)阻斷的熒光磁性顆粒；以及(4)20微升促黃體生成激素(LH)分析物(1微克每毫升)；以及(5)20微升PBS。
對照Eppendorf管中僅含有20微升PBS(表II中第8號管)。
室溫下孵化并輕輕搖動該樣品20分鐘。再通過Dynal公司的磁性分離器將磁性顆粒分離。棄去每個管的上清液再將磁性顆粒重新懸浮于1.5毫升的PBS中。每次熒光測量使用300微升該熒光磁性顆粒懸浮液用“Fluorolog III熒光分光光度計”采用直角模式測量樣品的熒光。在不同天對于熒光磁性顆粒采用470納米的激發(fā)波長和560納米的發(fā)射波長，對于該熒光非磁性顆粒采用570納米的激發(fā)波長和605納米的發(fā)射波長。表II列出了每天測得的相對熒光數(shù)據(jù)。
表II熒光檢測
從兩種體系的每組樣品比較可以看出，甚至在小心控制的條件下，自校正系統(tǒng)的標準偏差(Std.Dev％)比沒用自校正時的標準偏差小得多。由于自校正系統(tǒng)很少受測量條件影響，所以可預計，當沒有對條件進行小心控制時，自校正系統(tǒng)的標準偏差仍將比沒有自校正的標準偏差更小。
實施例3中使用的顆粒形成如下非熒光磁性顆?！胺菬晒獯判浴鳖w粒的形成如上面實施例1中所述。
熒光非磁性顆?！盁晒夥谴判浴鳖w粒的形成如上面實施例1中所述。
熒光磁性顆?！盁晒獯判灶w粒”的形成如上面實施例2中所述。
促黃體生成激素(LH)“促黃體生成激素(LH)”購自于Fitzgerald國際工業(yè)公司。
實施例4證明了利用如圖3所示的夾層測定法可檢測分析物存在的能力。首先將下列組分加入6個Eppendorf管中(1)30微升共價結合的非熒光磁性顆粒(PBS緩沖液中2毫克每毫升)；(2)20微升共價結合的熒光非磁性顆粒(PBS緩沖液中2毫克每毫升)；(3)15微升用β-酪蛋白(PBS緩沖液中1毫克每毫升)阻斷的熒光磁性顆粒；以及
(4)C反應蛋白(CRP)分析物范圍從0，5，10，20，50到100微升(PBS中0.2微克每毫升)。
室溫下孵化并輕輕搖動該試樣20分鐘。再通過Dynal公司的磁性分離器將磁性顆粒分離。棄去每個管的上清液再將磁性顆粒重新懸浮于1.5毫升的PBS中。每次熒光測量使用300微升該熒光磁性顆粒懸浮液。用N.J.Edison SPEX工業(yè)公司的“Fluorolog III熒光分光光度計”采用直角模式測量樣品的熒光。對于熒光磁性顆粒，采用470納米的激發(fā)波長和560納米的發(fā)射波長，而對于熒光非磁性顆粒采用570納米的激發(fā)波長和605納米的發(fā)射波長。積分時間為0.2至1秒。圖10顯示了作為每個樣品中CRP劑量的函數(shù)的標準化熒光強度。
實施例4中所用的顆粒形成如下非熒光磁性顆粒通過磁分離器將125微升10％的經(jīng)羧基修飾的順磁性顆粒(0.35微米，Estapor超順磁性微球，來自Bang’s Laboratories公司)用1.5ml碳酸鹽緩沖液洗滌一次，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次。再將洗滌后的顆粒重新懸浮于0.6毫升的PBS和15毫克的碳二亞胺(來自Polysciences公司)中。在振蕩器上使該混合物在室溫下(RT)反應30分鐘。再將活化的顆粒用硼酸鹽緩沖液洗滌兩次。將該活化的顆粒再次重懸浮于1.2ml的硼酸鹽緩沖液中。之后，將30微升抗C反應蛋白(anti-CRP1)單克隆抗體(Mab A5804，2mg/ml，購自Biospacific公司)加入該活化的顆粒中。室溫下讓反應混合物在振蕩器上反應過夜。然后收集該活化的顆粒并在1毫升0.1摩的乙醇胺中孵化輕搖15分鐘。再將該顆粒用PBS洗滌兩次并在4℃下儲存于含有0.1摩PBS，0.15摩NaCl，1％β-酪蛋白，5％甘油以及0.1％NaN3的緩沖液中。
熒光非磁性顆粒根據(jù)上述步驟將“熒光非磁性”顆粒共價結合，除了該結合組分是用抗C反應蛋白(抗-CRP2)單克隆抗體(2mg/ml，購自Biospacific公司)代替抗-CRP1。所用的該顆粒是購自于Molecular Probes公司的FluoSpheres羧基修飾微球。該顆粒尺寸為0.5微米，在580納米波長激發(fā)下發(fā)出紅色熒光，并且其發(fā)射波長為605納米。
熒光磁性顆粒
100微升2.76％熒光超順磁性顆粒固體(購自于賓西法尼亞沃靈頓的Polysciences公司)的懸浮液。這些顆粒平均直徑在1至2微米之間并且確信為含鐵微球，其具有可以被動吸附的聚乙烯表面以及與蛋白質反應的官能團。再向Eppendorf管中的顆粒加入1毫升硼酸鹽緩沖液(0.1摩，pH＝8.5)。通過購自于Dynal公司的磁分離器分離該顆粒，并將顆粒重懸于0.1M硼酸鹽緩沖液中的200微升10mg/mlβ-酪蛋白溶液中。懸浮液保溫30分鐘并輕輕混勻。上述步驟重復兩次。所述分離的顆粒重懸于200微升PBS中并且4℃儲存。
C反應蛋白(CRP)所述“C反應蛋白(CRP)購自于BioPacific公司。
盡管已經(jīng)根據(jù)特定實施方式對本發(fā)明進行了詳細描述，但應當認識到，本領域技術人員根據(jù)對前文的理解，可以容易地設計出這些實施方式的替換物、變形物以及等價物。因此，本發(fā)明的保護范圍應當為以下權利要求及其等同物的范圍。
權利要求
1.一種用于檢測試樣中分析物的存在或者量的基于流控技術的測定裝置，所述裝置包括反應腔室，所述反應腔室能夠容納含有試樣，可產生檢測信號的檢測探針，以及可產生校正信號的磁性校正探針的溶液；與所述反應腔室流體連通的通道，所述通道界定了檢測區(qū)；以及設置在鄰近所述檢測區(qū)處的磁性裝置，所述磁性裝置能夠將所述檢測探針和所述校正探針從所述溶液中分離；其中所述試樣中分析物的量與所述檢測區(qū)由所述分離的檢測探針產生的檢測信號強度成比例，所述檢測信號經(jīng)所述檢測區(qū)中由所述分離的校正探針產生的校正信號強度校正。
2.如權利要求1所述的裝置，其中所述通道有助于所述試樣的毛細流動。
3.如權利要求1所述的裝置，還包括設置在所述反應腔室和所述通道之間的隔離物，所述隔離物能夠將所述溶液保持在所述反應腔室中一段時間。
4.如權利要求3所述的裝置，其中所述隔離物能夠被所述溶液基本上溶解。
5.如權利要求4所述的裝置，其中所述隔離物包含的材料選自于包括以下物質的組碳水化合物、鹽及其組合。
6.如權利要求3所述的裝置，其中所述隔離物能夠在所述一段時間后發(fā)生物理斷裂。
7.如權利要求1所述的裝置，其中所述檢測探針和所述校正探針為熒光化合物、化學發(fā)光化合物、磷光化合物或其組合。
8.如權利要求1所述的裝置，其中所述檢測探針為熒光非磁性化合物。
9.如權利要求1所述的裝置，其中所述校正探針為熒光磁性顆粒。
10.如權利要求1所述的裝置，其中所述檢測探針能夠與分析物結合。
11.如權利要求1所述的裝置，還包括非熒光磁性顆粒。
12.如權利要求11所述的裝置，其中所述非熒光磁性顆粒能夠與分析物結合。
13.如權利要求1所述的裝置，其中所述分離的檢測探針包括由所述檢測探針形成的復合物。
14.如權利要求1所述的裝置，其中所述分離的校正探針包括由所述校正探針形成的復合物。
15.如權利要求1所述的裝置，其中所述試樣中分析物的量與在所述檢測區(qū)由所述分離檢測探針產生的檢測信號強度和在所述檢測區(qū)由所述分離校正探針產生的校正信號強度的商成比例。
16.一種用于檢測試樣中分析物的存在或者量的毛細流動測定裝置，所述裝置包括反應腔室，所述反應腔室能夠容納含有試樣，可產生檢測信號的檢測探針，以及可產生校正信號的磁性校正探針的溶液；與所述反應腔室流體連通的毛細管通道，所述流控毛細管通道界定了檢測區(qū)；設置在所述反應腔室和所述毛細管通道之間的隔離物，所述隔離物能夠將所述溶液保持在所述反應腔室中一段時間；以及設置在鄰近所述檢測區(qū)處的磁性裝置，所述磁性裝置能夠將所述檢測探針和所述校正探針從所述溶液中分離；其中所述試樣中分析物的量與在所述檢測區(qū)由所述分離的檢測探針產生的檢測信號強度成比例，所述檢測信號經(jīng)所述檢測區(qū)中由所述分離的校正探針產生的校正信號強度校正。
17.如權利要求16所述的裝置，其中所述隔離物能夠被所述溶液基本上溶解。
18.如權利要求17所述的裝置，其中所述隔離物包含的材料選自于包括以下物質的組碳水化合物、鹽及其組合。
19.如權利要求16所述的裝置，其中所述隔離物能夠在所述一段時間后發(fā)生物理斷裂。
20.如權利要求16所述的裝置，其中所述檢測探針和所述校正探針為熒光化合物。
21.如權利要求16所述的裝置，其中所述檢測探針為熒光非磁性化合物。
22.如權利要求16所述的裝置，其中所述校正探針為熒光磁性顆粒。
23.如權利要求16所述的裝置，其中所述分離的檢測探針包括由所述檢測探針形成的復合物。
24.如權利要求16所述的裝置，其中所述分離的校正探針包括由所述校正探針形成的復合物。
25.如權利要求16所述的裝置，其中所述試樣中分析物的量與在所述檢測區(qū)由所述分離檢測探針產生的檢測信號強度和在所述檢測區(qū)由所述分離校正探針產生的校正信號強度的商成比例。
26.一種用于檢測試樣中分析物的存在或者量的方法，所述方法包括i)提供基于流控技術的裝置，所述裝置包括a)含有能夠產生檢測信號的檢測探針以及能夠產生校正信號的磁性校正探針的反應腔室；b)與反應腔室流體連通的通道，所述通道界定了檢測區(qū)；以及c)設置在鄰近所述檢測區(qū)處的磁性裝置；ii)將含有分析物的試樣施加于所述反應腔室中形成溶液；iii)使所述溶液從所述反應腔室流到所述通道的檢測區(qū)；iv)利用所述磁性裝置在所述檢測區(qū)從所述溶液中分離所述檢測探針和所述校正探針；v)激發(fā)所述分離的檢測探針以及所述分離的校正探針，其中所述激發(fā)引起所述分離的檢測探針發(fā)出所述檢測信號，以及使所述分離的校正探針發(fā)出所述校正信號；vi)在第一發(fā)射波長處測量所述檢測信號的強度以及在第二發(fā)射波長處測量所述校正信號的強度；以及vii)比較所述檢測信號和所述校正信號的強度，其中所述試樣中分析物的量與經(jīng)校正信號強度校正的檢測信號的強度值成比例。
27.如權利要求26所述的方法，還包括通過在所述反應腔室和所述通道之間的隔離物，使所述溶液保持在所述反應腔室中一段時間。
28.如權利要求26所述的方法，其中所述檢測和校正探針是熒光的。
29.如權利要求26所述的方法，其中所述檢測和校正探針是化學發(fā)光的。
30.如權利要求26所述的方法，其中所述檢測和校正探針是磷光的。
31.如權利要求26所述的方法，其中所述檢測和校正探針是非磁性的。
32.如權利要求26所述的方法，所述分離的檢測探針包括由所述檢測探針形成的復合物。
33.如權利要求29所述的方法，其中所述復合物是與分析物形成的。
34.如權利要求26所述的方法，所述分離的校正探針包括由所述校正探針形成的復合物。
35.如權利要求31所述的方法，其中所述復合物是與分析物形成的。
36.如權利要求26所述的方法，其中所述第一發(fā)射波長與所述第二發(fā)射波長不同。
37.如權利要求26所述的方法，所述方法還包括為多種預定的分析物濃度就經(jīng)所述校正信號強度值校正的所述檢測信號強度值進行作圖，從而得到校正曲線。
38.如權利要求26所述的方法，其中所述分離的檢測探針與所述分離的校正探針同時被激發(fā)。
39.如權利要求26所述的方法，其中所述分離的檢測探針與所述分離的校正探針分別被激發(fā)。
40.如權利要求26所述的方法，其中同時測量所述檢測信號和所述校正信號的強度。
41.如權利要求26所述的方法，其中分別測量所述檢測信號和所述校正信號的強度。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測試樣中分析物的存在或量的基于流控技術的測定裝置。該裝置利用自校正的磁性結合測定形式(例如夾層測定，競爭性測定等等)，包括能產生檢測信號的檢測探針(例如熒光非磁性顆粒)以及能產生校正信號的校正探針(例如熒光磁性顆粒)。試樣中分析物的量與經(jīng)校正信號強度值校正的檢測信號強度值成比例(例如正比或者反比)。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的基于流控技術的裝置能提供精確、廉價、并且易于控制的方法用于測定試樣中分析物的存在。
文檔編號B01L3/00GK1675546SQ03819392
公開日2005年9月28日 申請日期2003年8月8日 優(yōu)先權日2002年8月27日
發(fā)明者宋旭東, R·凱洛, S·費斯特, 楊開元 申請人:金伯利-克拉克環(huán)球有限公司