本發(fā)明涉及土壤修復(fù)領(lǐng)域，具體地涉及一種植物微生物聯(lián)修復(fù)重金屬污染土壤的方法。

背景技術(shù)：

土壤重金屬污染具有污染物在土壤中移動性差、滯留時間長、自然降解慢的特點，并可經(jīng)水、植物等介質(zhì)最終影響人類健康。歷史上發(fā)生的“骨痛病”和“水俁病”就是由于重金屬污染而致病的典型案例。鎳污染是由鎳或其化合物所引起的環(huán)境污染，鎳元素可以在土壤中富集，土壤中的鎳主要來源于大氣降塵、含鎳廢水、農(nóng)田施肥、植物和動物殘體的腐爛等。含鎳化合物有潛在致癌風(fēng)險，并對農(nóng)作物生長有一定抑制作用。

日前針對土壤重金屬污染的修復(fù)方法主要有物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)、農(nóng)業(yè)生態(tài)修復(fù)等。物理修復(fù)主要包括電動修復(fù)以及電熱修復(fù)，化學(xué)修復(fù)主要為土壤熱淋，由于物理修復(fù)及化學(xué)修復(fù)方法均有一定缺陷，植物修復(fù)及植物-微生物聯(lián)合修復(fù)成為重金屬污染土壤修復(fù)方法的研究熱點。

植物根分泌物包括溢泌物、分泌物、粘膠質(zhì)、分解物和脫落物，從組分上包括各種糖類、有機酸和氨基酸等。根分泌物主要通過改變根際環(huán)境ph值和氧化還原電位以及重金屬的化學(xué)性質(zhì)，改變污染土壤中金屬元素的形態(tài)和活性或者鰲合、吸附、包埋根際中某些游離重金屬離子，降低重金屬污染物在土壤中的流動性。

本發(fā)明提供一種植物與微生物聯(lián)合修復(fù)系統(tǒng)，通過所選植物與微生物復(fù)合菌劑的相互配合，組成穩(wěn)定的生態(tài)修復(fù)系統(tǒng)，利用牧草及其根際環(huán)境微生物體系的吸收、轉(zhuǎn)化的作用，能夠有效降解或富集污染土壤中的鎳，實現(xiàn)對土壤的有效修復(fù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種植物微生物聯(lián)修復(fù)重金屬污染土壤的方法。

本發(fā)明是以如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種植物微生物聯(lián)合修復(fù)土壤污染的方法，所述方法包括在鎳污染土壤上種植牧草，像牧草根部注射復(fù)合微生物菌劑。

進一步地，所述方法包括：

步驟1、在鎳污染土壤上種植牧草，所述牧草優(yōu)選地為黑麥草；

步驟2、向黑麥草根部均勻注射所述復(fù)合微生物菌劑，待黑麥草生長的平均株高距地面5～8cm后，再次向黑麥草土壤際根注射復(fù)合微生物菌劑；

步驟3、所述復(fù)合微生物菌劑中各菌種的接種量以百分比計為：球形紅細菌4.5％，類黃氫噬胞菌10％，中華屈撓桿菌6.7％，脫硫弧菌9％，小單孢菌2％、木薯菌1.5％、假單胞菌3.2％。

步驟4、所述復(fù)合微生物菌劑的制備步驟為：將球形紅細菌、類黃氫噬胞菌、中華屈撓桿菌、脫硫弧菌、小單孢菌、木薯菌、假單胞菌分別進行振蕩培養(yǎng)，將上述菌株接種到液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)對數(shù)生長期，將菌液轉(zhuǎn)移至無菌離心瓶中離心，收集菌體，并用去離子水反復(fù)清洗，最終將離心出的菌體用無菌去離子水洗凈后稀釋至od600≈1.0，將菌體按照微生物復(fù)合菌的配比方式進行混合，得到復(fù)合微生物菌劑。

更進一步地，所述復(fù)合微生物菌劑中各菌種的接種量以百分比計為：球形紅細菌15.5％、類黃氫噬胞菌9％、中華屈撓桿菌3.1％、脫硫弧菌5％、小單孢菌1.5％、木薯菌8.5％、假單胞菌2.5％。

進一步地，所述菌種按照以下方法活化：

步驟1、安瓿管開封：用浸過70％酒精的脫脂棉擦凈安瓿管；用火焰將安瓿管頂端加熱；滴無菌水至加熱的安瓿管頂端使玻璃開裂；用銼刀或鑷子敲下已開裂的安瓿管的頂端。

步驟2、菌株恢復(fù)培養(yǎng)：用無菌吸管，吸取0.3-0.4ml適宜的液體培養(yǎng)基，滴入安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀；取約0.2ml菌體懸浮液，移植于指定的瓊脂斜面培養(yǎng)基上，剩余的菌液，注入指定的液體培養(yǎng)基內(nèi)(3-4ml)，然后在建議的溫度下培養(yǎng)。

步驟3、注意事項：菌種活化前，請將安瓿管保存在5-10℃的環(huán)境下；厭氧菌的培養(yǎng)，如無特別說明，自開封至接種完成，均需以無氧氣體充填，以保持厭氧狀態(tài)；某些菌種經(jīng)過冷凍干燥保存后，延遲期較長，需連續(xù)兩次繼代培養(yǎng)才能正常生長。

優(yōu)選地，所述牧草選自麥草、冬牧、黑麥草、苦荬菜、白三葉、雞腳草、菊苣、魯梅克斯、紫花苜蓿、蕪菁甘藍。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明提供一種植物-微生物聯(lián)修復(fù)重金屬污染土壤的方法，通過所選植物與復(fù)合微生物菌劑的相互配合，組成穩(wěn)定的生態(tài)修復(fù)系統(tǒng)，利用牧草及其根際環(huán)境微生物體系的吸收、轉(zhuǎn)化的作用，有效降解和富集污染土壤中的鎳，以實現(xiàn)對土壤的有效修復(fù)。

附圖說明

圖1是黑麥草與復(fù)合微生物菌劑降解土壤鎳污染示意圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步地詳細描述。

實施例1：具有降解功能的微生物的選取

球形紅細菌rhodobactersphaeroides屬于光合細菌紫色非硫菌群的紅細菌屬，球形紅細菌是具有原始光能合成體系的原核微生物，兼性厭氧細菌，可以隨著生存環(huán)境靈活地改變代謝類型，中國普通微生物菌種保藏管理中心可以提供，購買號cgmcc.14736。

類黃氫噬胞菌hydrogenophagaflava產(chǎn)生非水溶性黃色素，好氧，兼性嗜氫自養(yǎng)菌，以氧為末端電子受體的氧化型的糖代謝，具有厭氧硝酸鹽呼吸，具反硝化作用。能在含有機酸、氨基酸或蛋白胨的培養(yǎng)基上良好生長，但很少利用碳水化合物，中國普通微生物菌種保藏管理中心可以提供，購買號cgmcc.58473。

中華屈撓桿菌flexibacterchinenses，細胞有時聚集成團，兼性厭氧，革蘭氏陰性，無內(nèi)生芽孢及其它形式的休眠細胞，滑行運動，能利用多種糖類作為碳源但不分解瓊脂、幾丁質(zhì)和纖維素。對固氮藍藻營養(yǎng)細胞有溶解能力。對四環(huán)素以外的多種抗菌素均具有相當(dāng)強的耐受性，模式株fca中國科學(xué)院水生生物研究所可提供，購買號cgmcc.75673。

脫硫弧菌desulfovibriodesulfuricans，革蘭氏陰性，專性厭氧，不產(chǎn)芽孢，彎曲或螺旋桿狀。存在于土壤中，可還原態(tài)硫化物進行厭氧呼吸。中國普通微生物菌種保藏管理中心可以提供，購買號cgmcc.36984。

除上述細菌外，還添加小單孢菌、木薯菌、假單胞菌(市售菌株)。

實施例2：微生物復(fù)合菌劑的制備

用下列方法恢復(fù)培養(yǎng)cgmcc冷凍干燥的菌種：

a.安瓿管開封：用浸過70％酒精的脫脂棉擦凈安瓿管；用火焰將安瓿管頂端加熱；滴無菌水至加熱的安瓿管頂端使玻璃開裂；用銼刀或鑷子敲下已開裂的安瓿管的頂端。

b.菌株恢復(fù)培養(yǎng)：用無菌吸管，吸取0.3-0.4ml適宜的液體培養(yǎng)基，滴入安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀；取約0.2ml菌體懸浮液，移植于指定的瓊脂斜面培養(yǎng)基上，剩余的菌液，注入指定的液體培養(yǎng)基內(nèi)(3-4ml)，然后在建議的溫度下培養(yǎng)。

c.注意事項：菌種活化前，請將安瓿管保存在5-10℃的環(huán)境下；厭氧菌的培養(yǎng)，如無特別說明，自開封至接種完成，均需以無氧氣體充填，以保持厭氧狀態(tài)；某些菌種經(jīng)過冷凍干燥保存后，延遲期較長，需連續(xù)兩次繼代培養(yǎng)才能正常生長。

所述微生物復(fù)合菌劑中各菌種的接種量以百分比計為：球形紅細菌4.5％，類黃氫噬胞菌10％、中華屈撓桿菌6.7％、脫硫弧菌9％、小單孢菌2％、木薯菌1.5％、假單胞菌3.2％，余量由生理鹽水或lb液體培養(yǎng)基補足?；蛩鑫⑸飶?fù)合菌中各菌種的接種量以百分比計為：球形紅細菌15.5％、類黃氫噬胞菌9％、中華屈撓桿菌3.1％、脫硫弧菌5％、小單孢菌1.5％、木薯菌8.5％、假單胞菌2.5％，余量由生理鹽水或lb液體培養(yǎng)基補足。

將上述菌種分別進行振蕩培養(yǎng)，菌株接種到液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)對數(shù)生長期，將菌液轉(zhuǎn)移至無菌離心瓶中離心，收集菌體，并用去離子水反復(fù)清洗，最終將離心出的菌體用無菌去離子水洗凈后稀釋至od600≈1.0，將菌體按照復(fù)合微生物菌的配比方式進行混合，得到復(fù)合微生物菌劑。

實施例3：植物-微生物降解系統(tǒng)的構(gòu)建

在鎳污染土壤中播種黑麥草，待黑麥草出苗后，向黑麥草根部均勻注射實施例1所述復(fù)合菌微生物菌劑，待牧草生長的平均株高距地面5～8cm后，再次向土壤際根均勻注射復(fù)合微生物菌劑(采用五點法分孔注射微生物復(fù)合菌)。通過牧草與微生物復(fù)合菌的聯(lián)合作用，實現(xiàn)對鎳污染土壤的修復(fù)工作。微生物群落可以加強牧草對環(huán)境脅迫的抗性，提高黑麥草的生物量，同時還能通過生理代謝產(chǎn)生小分子物質(zhì)來活化土壤中重金屬，提高重金屬的生物有效性，而黑麥草可以分泌營養(yǎng)物質(zhì)或小分子物質(zhì)促進微生物生長，從而使得植物-微生物系統(tǒng)聯(lián)合修復(fù)土壤重金屬污染效果顯著提升。

實施例4：植物-微生物降解系統(tǒng)的降解效果檢測

取放置有鎳污染土壤1000g的花盆10個，編號為q1-q9號，剩余一個為ck，檢測初始鎳濃度并記錄，向花盆中分別接種黑麥草5株，q1-q9號盆按實施例2所述方法注射復(fù)合微生物菌劑，培養(yǎng)90天，第30天檢測q1-q3號盆的鎳濃度，取平均值；第60檢測q4-q6號盆的鎳濃度，取平均值；第90檢測q7-q9號盆的鎳濃度，取平均值；檢測結(jié)果如表1及圖1所示，檢測結(jié)果表明，黑麥草與復(fù)合微生物菌劑的聯(lián)合使用可以有效降解或富集土壤中的鎳元素。

表1黑麥草與復(fù)合微生物菌劑降解效果測試結(jié)果

以上所揭露的僅為本發(fā)明較佳實施例而已，當(dāng)然不能以此來限定本發(fā)明之權(quán)利范圍，因此依本發(fā)明權(quán)利要求所作的等同變化，仍屬本發(fā)明所涵蓋的范圍。