本發(fā)明屬于生態(tài)環(huán)保領(lǐng)域，具體涉及一種鄰苯二甲酸酯污染土壤的修復(fù)方法。

背景技術(shù)：

鄰苯二甲酸酯(Phthalate esters,PAEs)是鄰苯二甲酸的酯化衍生物，是最常見的塑化劑，主要應(yīng)用于聚乙烯樹脂的合成、粘膠劑和塑料薄膜等的生產(chǎn)，所述的PAEs包括3種代表性的鄰苯二甲酸酯類(即鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸正二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)。近年來，由于PAEs的大量使用，這類化合物廣泛存在于大氣、水體和土壤等環(huán)境中，并通過食物鏈對人體健康造成影響。PAEs及其降解中間產(chǎn)物因被懷疑會引發(fā)癌癥并損害腎臟，而被美國環(huán)境保護(hù)局(EPA)列為重要污染物。作為環(huán)境雌激素，PAEs能夠擾亂內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能、干擾人體和其他動物的生長發(fā)育、導(dǎo)致出生缺陷和生殖能力下降等危害。因此，如何有效控制和消除環(huán)境內(nèi)PAEs引發(fā)的污染已成為當(dāng)務(wù)之急。

鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)降解方法主要有光催化氧化處理、生物降解、微波輻照處理、活性炭降解、臭氧氧化等方式，其中生物降解的作用占重要地位。生物修復(fù)包括植物修復(fù)和微生物修復(fù)。植物修復(fù)是利用植物及其根際微生物的共存體系來吸收、轉(zhuǎn)移、容納或轉(zhuǎn)化污染物使其對環(huán)境無害。作為一種原位綠色修復(fù)技術(shù)，植物修復(fù)在PAEs污染土壤的修復(fù)中具有極大的優(yōu)勢。但是隨著殘留時(shí)間的延長，土壤中的PAEs逐漸被土壤空隙吸附，使其生物有效性偏低，從而會導(dǎo)致植物對PAEs的降解和富集效率低。根際微生物對土壤中PAEs的降解有重要作用，同時(shí)植物根系分泌物能明顯強(qiáng)化微生物的降解功能。因而，植物與微生物的協(xié)同修復(fù)技術(shù)是土壤有機(jī)污染生物修復(fù)領(lǐng)域的一個(gè)發(fā)展方向。

由于植物根系發(fā)達(dá)，其在生長過程中對PAEs具有較強(qiáng)的吸收、揮發(fā)、根濾、降解、穩(wěn)定作用，可以凈化土壤中的PAEs等污染物。為進(jìn)一步提高植物對土壤中PAEs的修復(fù)效率，可采用生物修復(fù)技術(shù)中的植物修復(fù)和微生物強(qiáng)化技術(shù)相結(jié)合的方法。截至目前，利用微生物-植物聯(lián)合降解PAEs的報(bào)道較少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)際問題和需求，本發(fā)明提出降解土壤中PAEs的方法，以實(shí)現(xiàn)對鄰苯二甲酸酯污染土壤高效、快速地修復(fù)。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種鄰苯二甲酸酯污染土壤的修復(fù)方法，具體為以下三種方式中的任一種：(1)在污染土壤中種植綠豆；(2)在污染土壤中施加綠木霉F7；(3)在污染土壤中種植綠豆，并聯(lián)合施加綠木霉F7；所述綠木霉F7的分類命名為Trichoderma virens，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.3.17613。

進(jìn)一步地，保持污染土壤中含水量為最大田間持水量的60-80％，以便有利于植物生長。

進(jìn)一步地，綠豆種植及綠木霉F7聯(lián)合施加的方式為以下三者之一：(1)先在污染土壤中種植綠豆再施加綠木霉F7；(2)先施加綠木霉F7再種植綠豆；(3)用綠木霉F7菌液浸泡綠豆種子再播種。

進(jìn)一步地，所述種植的綠豆可以是直接將綠豆種子播種到污染土壤中，也可以將綠豆植株移栽至污染土壤中。

更進(jìn)一步地，所述種植的綠豆優(yōu)選直接將綠豆種子播種到污染土壤中，直接在原土壤中播種生長，避免移栽損傷根莖，無需緩苗過程，更利于綠豆的扎根生長，因此降解PAEs的速度更快。

更進(jìn)一步地，所述綠豆的種植密度為20-30株/m²土地，密度過低根系無法全面覆蓋污染土壤造成降解率低，密度過高綠豆的營養(yǎng)光照等條件跟不上、生長弱，也會降低對PAEs的降解率。

進(jìn)一步地，所述綠木霉F7的施加量為1×10¹⁰-9×10¹²個(gè)孢子數(shù)/m²土地，如果施加量過低，綠木霉F7無法在短期內(nèi)有效擴(kuò)增影響對PAEs的降解，施加量也不宜過高以有效控制成本。

進(jìn)一步地，所述綠木霉F7的施加形式為發(fā)酵液或固體制劑。

進(jìn)一步地，發(fā)酵液的制備方式為：將活化的綠木霉F7菌塊接種到含有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)斜面上，28±2℃黑暗條件下培養(yǎng)4-6d后，用無菌水沖洗下分生孢子，將孢子液稀釋到1×10⁵-9×10⁵個(gè)孢子/mL作為發(fā)酵接種的種子液；取種子液按照1％的接種量接種于PDA液體培養(yǎng)基中，28±2℃，150-200r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)4-6d，即得到綠木霉F7發(fā)酵液。

進(jìn)一步地，發(fā)酵液的施加方式為將綠木霉F7發(fā)酵液直接施加在綠豆根部。

進(jìn)一步地，發(fā)酵液在綠豆出苗后10d、20d和30d，分三次向植物根際部位接種，以加強(qiáng)接種效果。

進(jìn)一步地，固體制劑的制備方式為將綠木霉F7種子液(1×10⁵-9×10⁵個(gè)孢子/mL)，加入到麥麩培養(yǎng)基中，28±2℃培養(yǎng)3-5d至長出白色菌絲時(shí)，無菌條件下用玻璃棒將菌絲和培養(yǎng)基充分混勻，使綠木霉F7布滿整個(gè)培養(yǎng)基；隔1.5-3d后再次用玻璃棒將菌絲和培養(yǎng)基充分混勻，直至整個(gè)麥麩培養(yǎng)基都長滿綠色的綠木霉F7孢子，混勻計(jì)數(shù)孢子量為1×10⁹-9×10⁹個(gè)孢子/g，得到綠木霉F7固體制劑。固體制劑的施加方式為按土壤重量的4-6％將固體制劑拌入土壤中。

本發(fā)明修復(fù)鄰苯二甲酸酯污染土壤的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)綠木霉F7能夠利用鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)作為唯一碳源和能源生長繁殖，在純培養(yǎng)條件下，該菌5天就能將無機(jī)鹽培養(yǎng)基中300mg/L的DMP降解75.1％。該菌同時(shí)對鄰苯二甲酸正二丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)等均具有良好的利用能力；

(2)綠豆適應(yīng)性強(qiáng)，生長快，根系發(fā)達(dá)，生物量較大，能夠有效去除土壤中鄰苯二甲酸酯；

(3)綠豆根系與根際微生物綠木霉F7聯(lián)合，可進(jìn)一步促進(jìn)鄰苯二甲酸酯降解，使土壤中鄰苯二甲酸酯降解去除率最高達(dá)85％，實(shí)現(xiàn)高效去除鄰苯二甲酸酯。綠木霉F7聯(lián)合綠豆處理污染土壤，提高了鄰苯二甲酸酯污染土壤的修復(fù)效率，綠木霉F7與綠豆之間存在協(xié)同促進(jìn)修復(fù)效果的現(xiàn)象；

(4)本發(fā)明方法在土壤中鄰苯二甲酸酯濃度高達(dá)256mg/kg條件下仍可實(shí)現(xiàn)85％去除率，因此適用于大范圍鄰苯二甲酸酯中、低濃度污染土壤的修復(fù)。

附圖說明

圖1實(shí)施例1接種2.5％的綠木霉F7對不同濃度DMP、DBP、DEHP的降解率；

圖2實(shí)施例1接種10％的綠木霉F7對不同濃度DMP、DBP、DEHP的降解率；

圖3實(shí)施例2不同試驗(yàn)處理?xiàng)l件下DMP、DBP、DEHP的降解率；

圖4實(shí)施例3不同試驗(yàn)處理?xiàng)l件下DMP、DBP、DEHP的降解率。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例1：綠木霉F7對鄰苯二甲酸酯的降解

接種環(huán)挑取純化培養(yǎng)的綠木霉F7，接入5g/L的葡萄糖溶液，于28℃，180r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)36h，誘導(dǎo)孢子萌發(fā)和菌絲生長。分光光度計(jì)測定菌液在660nm處的OD值，適當(dāng)稀釋使其濃度一致(OD660≈0.8)，得到菌液。

配制基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基：MgSO₄·7H₂O 0.5g、KCl 0.5g、K₂HPO₄ 1.31g、NaNO₃ 3.0g、FeSO₄·7H₂O0.018g、補(bǔ)足蒸餾水至1000mL；pH 7.0，121℃，0.1MPa滅菌20min。向滅菌后的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中添加PAEs，得到PAEs培養(yǎng)基。設(shè)置4組不同的濃度梯度，3種PAEs濃度分別為0、25、50和100mg/L，PAEs總濃度分別為0、75、150和300mg/L。

設(shè)置2種接種量，分別以2.5％和10％(菌液與PAEs培養(yǎng)基的體積比)的接種量將菌液接入到上述PAEs培養(yǎng)基中，以不接種綠木霉F7的PAEs無機(jī)鹽培養(yǎng)基作為非生物降解對照，28℃、180r/min培養(yǎng)5d。每組設(shè)三個(gè)重復(fù)。所有操作均在無菌條件下進(jìn)行。5d后取樣分析培養(yǎng)液中PAEs含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1-2。

結(jié)果顯示，在不同濃度PAEs條件下，接種2.5％和10％的綠木霉F7對3種PAEs的降解率大小順序均為DMP＞DBP＞DEHP；在純培養(yǎng)5d內(nèi)，接種2.5％的綠木霉F7處理下，DMP、DBP和DEHP三種PAEs的混合體系總降解率為53.5％～58.1％，其中DMP的降解率為64.1％～67.9％，DBP的降解率為51.2％～59.1％，DEHP的降解率為48.3％～50.8％。接種10％的綠木霉F7處理下，DMP、DBP和DEHP三種PAEs的混合體系總降解率為60.0％～64.5％，其中DMP的降解率為71.3％～75.1％，DBP的降解率為57.6％～64.9％，DEHP的降解率為51.1％～63.6％。而未接菌的對照組DMP、DBP和DEHP三種PAEs的降解率僅為2.1％～4.4％。上述結(jié)果表明綠木霉F7對三種鄰苯二甲酸酯混合物具有較好的降解能力。

實(shí)施例2：綠木霉F7發(fā)酵液聯(lián)合綠豆修復(fù)鄰苯二甲酸酯污染土壤

試驗(yàn)土壤取自山東青島膠州市膠西鎮(zhèn)農(nóng)田耕作層，土壤pH 6.58(土水比1：2.5)，有機(jī)質(zhì)23.1g/kg，陽離子交換量13.2cmol/kg，全氮含量為1.25g/kg，速效磷和鉀含量分別為36.4mg/kg、197mg/kg。取得土壤經(jīng)風(fēng)干、碾碎后過2mm(10目)篩。

上述土壤經(jīng)進(jìn)一步碾碎過0.3mm篩。取少量經(jīng)過0.3mm篩的土壤，加入5g/L PAEs儲備液，使3種PAEs濃度均為1000mg/kg(總濃度為3000mg/kg)，待溶劑揮發(fā)后與未污染土混合，制成3種PAEs濃度均為50mg/kg(總濃度為150mg/kg)的人工污染土壤。

供試綠豆(Phaseolus radiatus L.)種子購自山東農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。

供試菌種為綠木霉(Trichoderma virens)菌株F7(保藏編號：CGMCC No.3.17613)。

試驗(yàn)設(shè)置四個(gè)處理，處理一：CK，自然降解對照；處理二：接種綠木霉F7發(fā)酵液；處理三：種植綠豆；處理四，種植綠豆+接種綠木霉F7發(fā)酵液。每處理做四次重復(fù)。將實(shí)驗(yàn)土壤裝入陶瓷盆中，每盆4kg土。在接種菌液和種植綠豆前采集土壤樣品，測定PAEs含量，見表1。

綠木霉F7發(fā)酵液的制備：將活化的綠木霉F7菌塊接種到含有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)斜面的克氏瓶中，28℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)5d后，用無菌水沖洗下分生孢子，將孢子液稀釋到5×10⁵個(gè)孢子/mL，作為發(fā)酵接種的種子液。取5mL孢子懸浮液接種于500mL的PDA液體培養(yǎng)基中，28℃，180r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，即為綠木霉F7發(fā)酵液。

選取飽滿的綠豆種子，用1％次氯酸鈉溶液浸泡種子10min，取出用去離子水清洗種子5次后，栽入育苗基質(zhì)中進(jìn)行育苗，出苗1周后移入裝有污染土壤的陶瓷盆(盆內(nèi)徑為36cm)中，每盆5株，待苗移栽成活后進(jìn)行一次間苗，每盆保留3株，相當(dāng)于29.5株/m²土地。

在綠豆出苗后10d，在植株根際施加100ml綠木霉F7發(fā)酵液。在修復(fù)過程中，保持土壤含水量為最大田間持水量的65％左右。在培養(yǎng)20d和30d時(shí)，分別向植物根際追加一次綠木霉F7發(fā)酵液，用量均為100ml，也即干土重的2.5％(體積質(zhì)量比)，相當(dāng)于9.83×10¹⁰(單次)/2.95×10¹¹(三次)孢子數(shù)/m²土地。

試驗(yàn)共進(jìn)行75d，常規(guī)田間管理。收獲時(shí)，采集土壤樣品，測定試驗(yàn)終止時(shí)土壤的PAEs。結(jié)果見表1和圖3。

從試驗(yàn)結(jié)果看，3種PAEs發(fā)生了自然降解作用，DMP、DBP和DEHP的降解率分別為64.2％，45.8％和41.7％，總PAEs降解率為50.8％。接種綠木霉F7和種植綠豆后PAEs的降解均有所提高，其中接種綠木霉F7處理下DMP、DBP和DEHP的降解率分別為69.7％，63.3％和58.2％，總PAEs降解率為64.0％；種植綠豆DMP、DBP和DEHP的降解率分別為74.8％，68.5％和64.7％，總PAEs降解率為69.5％。綠木霉F7聯(lián)合綠豆顯著提高了PAEs的降解，DMP、DBP和DEHP的降解率分別為88.3％，83.9％和82.0％，總PAEs降解率為84.9％。

本實(shí)例說明，綠木霉F7有效提高了土壤介質(zhì)中的DBP、BMP和DEHP的生物修復(fù)效率，綠木霉F7聯(lián)合綠豆處理污染土壤，提高了鄰苯二甲酸酯污染土壤的降解速率，綠木霉F7與綠豆之間存在協(xié)同促進(jìn)修復(fù)效果的現(xiàn)象。

表1實(shí)施例2不同試驗(yàn)處理?xiàng)l件下PAEs的降解率(mg/kg DW)

實(shí)施例3綠木霉F7固體制劑聯(lián)合綠豆修復(fù)鄰苯二甲酸酯污染土壤

所用土壤來源、性質(zhì)和基本類型、添加PAEs污染物的方式、綠豆種子同實(shí)施例2。實(shí)驗(yàn)所用人工污染土壤3種PAEs濃度均為100mg/kg(總濃度為300mg/kg)。

綠木霉F7固體制劑的制備：將活化的綠木霉F7菌塊接種到含有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)斜面的克氏瓶中，28℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)5d后，用無菌水沖洗下分生孢子，將孢子液稀釋到1×10⁵個(gè)孢子/mL，作為發(fā)酵接種的種子液。以麥麩為綠木霉F7繁殖的載體即培養(yǎng)基，將麥麩洗凈烘干粉碎后，調(diào)節(jié)其含水量為50wt％，分裝至培養(yǎng)皿中，121℃滅菌30min。無菌條件下，吸取木霉孢子種子液加入到麥麩培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)4d。待長出少量白色菌絲時(shí)，無菌條件下用玻璃棒將菌絲和培養(yǎng)基充分混勻，使綠木霉F7布滿整個(gè)培養(yǎng)基。隔2d后重復(fù)上述操作，直至整個(gè)麥麩培養(yǎng)基都長滿綠色的綠木霉F7孢子，混勻計(jì)數(shù)孢子量為4.5×10⁹個(gè)孢子/g，得到綠木霉F7固體制劑。

試驗(yàn)設(shè)置四個(gè)處理，處理一：CK，自然降解對照；處理二：施加綠木霉F7固體制劑；處理三：種植綠豆；處理四，種植綠豆+施加綠木霉F7固體制劑。每處理做四次重復(fù)。每盆裝5.0kg土，對于處理二和處理四按土壤重量的5％將固體制劑(0.25kg)拌入土壤中，相當(dāng)于8.96×10¹²個(gè)孢子數(shù)/m²土地，表層覆土平衡7d后播種。

選取飽滿的綠豆種子，用1％次氯酸鈉溶液浸泡種子10min，取出用去離子水清洗種子7次后，在盆里的污染土壤中事先挖好深度一致的穴，均勻播種6顆種子。然后將土覆蓋在種子上，噴灑去離子水。待綠豆長出2片真葉時(shí)，間苗。保證每盆3棵綠豆，盆內(nèi)徑為40cm，相當(dāng)于23.9株/m²土地。在修復(fù)過程中，保持土壤含水量為最大田間持水量的75％左右。

試驗(yàn)共進(jìn)行75d，常規(guī)田間管理。收獲時(shí)，采集土壤樣品，測定試驗(yàn)終止時(shí)土壤的PAEs。結(jié)果見表2和圖4。

從試驗(yàn)結(jié)果看，3種PAEs發(fā)生了自然降解作用，DMP、DBP和DEHP的降解率分別為64.4％，48.8％和45.1％，總PAEs降解率為52.3％。施加綠木霉F7固體制劑和種植綠豆后PAEs的降解均有所提高，其中施加綠木霉F7固體制劑處理下DMP、DBP和DEHP的降解率分別為69.8％，63.9％和60.6％，總PAEs降解率為64.6％，種植綠豆DMP、DBP和DEHP的降解率分別為74.6％，68.9％和66.7％，總PAEs降解率為69.9％。綠木霉F7固體制劑聯(lián)合綠豆顯著提高了PAEs的降解，DMP、DBP和DEHP的降解率分別為85.0％，84.2％和83.1％，總PAEs降解率為85.1％。

本實(shí)例說明，綠木霉F7有效提高了土壤介質(zhì)中的DBP、BMP和DEHP的生物修復(fù)效率，綠木霉F7固體制劑聯(lián)合綠豆處理污染土壤，提高了鄰苯二甲酸酯污染土壤的降解速率，綠木霉F7與綠豆之間存在協(xié)同促進(jìn)修復(fù)效果的現(xiàn)象。

表2實(shí)施例3不同試驗(yàn)處理?xiàng)l件下PAEs的降解率(mg/kg DW)