專利名稱：一種耐冷紅掌的轉(zhuǎn)基因培育方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種耐冷紅掌的轉(zhuǎn)基因培育方法。
背景技術(shù)：
紅掌系天南星科花燭屬多年生草本植物，在許多熱帶國家和地區(qū)被列為主 要切花品種，是僅次于熱帶蘭的第二大宗熱帶花卉商品。紅掌既是最受歡迎的
io種切花之一，又是最受歡迎的IO種盆栽植物之一，其銷售額僅次于蝴蝶蘭，
是所有切花品種中增長最快的。
我國的紅掌產(chǎn)業(yè)經(jīng)歷20多年的發(fā)展，在生產(chǎn)規(guī)模和研發(fā)力量等方面取得了 較大進步，但總體的研發(fā)與銷售與國際水平相距甚遠。盡管很多地方均有生產(chǎn)， 卻仍無具有自主知識產(chǎn)權(quán)的紅掌新品種，其種苗主要來自國外。與此同時，由 于我國冬季低溫的原因?qū)е录t掌在我國紅掌難以自然環(huán)境種植，必須人工溫室 條件下加溫控制種植，不僅大幅度提高生產(chǎn)成本，而且低溫凍害也顯著降低了 紅掌的觀賞和商用品質(zhì)。
CBF基因是幾年前發(fā)現(xiàn)的一類耐逆相關基因，其所編碼的轉(zhuǎn)錄激活因子能 與CRT/DRE的DNA調(diào)控元件特異結(jié)合，促進啟動子中含有這一調(diào)控元件的多 個冷誘導基因的表達，從而引起植株耐冷性的增強。正是在該背景下，本發(fā)明 提出一種耐冷紅掌的培育方法，旨在培育出耐冷紅掌新品種，顯著降低紅掌的 生產(chǎn)成本，提高觀賞和商用品質(zhì)，對提高我國紅掌產(chǎn)業(yè)的競爭力和經(jīng)濟效益具 有重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種耐冷紅掌的轉(zhuǎn)基因培育方法，以獲得更適合冬 季低溫種植的紅掌新品種。
耐冷紅掌的轉(zhuǎn)基因培育方法，包括以下步驟
1) 取主栽紅掌品種的頂芽為外植體，接種至誘導培養(yǎng)基，誘導愈傷組織；
2) 取誘導形成2周的愈傷組織，轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)至愈傷組織 進入快速增殖期；
3) 取快速增殖的愈傷組織，在25"C黑暗條件下進行受體愈傷組織預培養(yǎng)3
天；
4) 取預培養(yǎng)的愈傷組織，在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡15分鐘，之后棄去菌液， 用無菌濾紙吸干，接種于共培養(yǎng)基上，在23"C黑暗條件下共培養(yǎng)3天；5) 取共培養(yǎng)愈傷組織，洗凈、晾干后，轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基，在25'C黑暗條 件下培養(yǎng)4周，收集新長出的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)移至新的篩選培養(yǎng)基上，再進 行連續(xù)3輪繼代篩選，每隔4周轉(zhuǎn)繼1次；
6) 取4輪篩選后的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基，誘導分化成苗，對 抗性植株進行葡糖苷酸酶基因組織化學染色和潮霉素基因分子檢測，選取含目 的基因的分化小苗，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基長成幼苗；
7) 取入選的轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)移至溫度0'C下進行耐冷性鑒定4周，選留不 受凍凍危害的轉(zhuǎn)基因植株；
8) 繼續(xù)種植步驟7)篩選的轉(zhuǎn)基因紅掌株系，室內(nèi)外評價驗證耐冷的表達 穩(wěn)定性，對穩(wěn)定的優(yōu)良株系進行繁殖，培育出轉(zhuǎn)基因耐冷紅掌。
上述的穩(wěn)定性是指入選紅掌的耐冷性可在不同年份間(2年及以上)、季節(jié) 間(2季及以上)以及地點間(2個地點及以上)表達一致，特性不受年份、季 節(jié)以及地點的顯著影響。
本發(fā)明中，所說的誘導培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基添加2，4-D 0.6mg、 6-BA 0.5mg、蔗糖30g、瓊脂粉6.8g， pH滅菌前5.8。
本發(fā)明中，所說的繼代培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加2，4-D 0.6mg、 6-BA 2mg、蔗糖30g、瓊脂粉6.8g， pH滅菌前5.8。
本發(fā)明中，所說的共培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基添加ABA 5mg/L、 2,4-D 0.6mg、 6-BA2mg、蔗糖30g、瓊脂粉6.8g， pH滅菌前5.8。
本發(fā)明中，所說的共培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基添加潮霉素100mg、 ABA 5mg/L、 2,4-D0.6mg、 6-BA2mg、蔗糖30g、瓊脂粉6.8g， pH滅菌前5.8。
本發(fā)明中，所說的分化培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加KT lmg、 NAA 0.2mg、 蔗糖30g、瓊脂粉6.8g， pH滅菌前5.8。
本發(fā)明中，所說的生根培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加NAA0.5mg、蔗糖30g、 瓊脂粉6.8g， pH滅菌前5.8。
上述的MS基本培養(yǎng)基為大量元素(NH4N03 650mg、 KN03 900mg、 CaCl2.2H20 440mg、 MgS04.7H20 370mg、 KH2PO4700mg)、微量元素(KI0.83 mg、 H3B036.2mg、 MnS04.4H20 22.3mg、 ZnS04.7H20 8.6mg、 Na2Mn04.2H20 0.25mg、 CuS04.5H20 0.025mg、 CoCl2.6H20 0.025mg 、 FeS04.7H20 27.8mg Na2-EDTA'2H20 37.3mg)和有機成分(肌醇100mg、煙酸0.5mg、維生素B6 0.5mg、維生素B10.5mg、甘氨酸2mg)。
本發(fā)明中，所說的農(nóng)桿菌的菌株為超毒力型EHA105， 含質(zhì)粒pCMD。pCMD的T-DNA區(qū)攜帶有擬南芥耐逆相關CBF1基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 和葡糖苷酸酶基因。CBFl基因長642bp，與CaMV35S啟動子和胭脂堿合成酶 終止子共同構(gòu)成表達框架。菌株EHA105可方便購買或贈送獲得，在一般植物 基因工程實驗室均有保存，參見文獻吳關庭等，中國農(nóng)業(yè)科學，2005， 38(12): 2395-240。
本發(fā)明中，所說的葡糖苷酸酶基因組織化學染色方法參見Rueb和Hensgens. Rice Genetics Newsletter, 1989， (6): 168-169，潮霉素基因分子檢測方法參見吳 關庭等，中國農(nóng)業(yè)科學，2005， 38(12): 2395-240。
本發(fā)明具有以下幾方面的有益效果
培育的轉(zhuǎn)基因耐冷紅掌新品種，比普通紅掌品種能抗低溫凍害能力，顯著 降低紅掌的生產(chǎn)成本，提高觀賞和商用品質(zhì)，有利于提升品質(zhì)、節(jié)約成本推動 紅掌的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。
具體實施例方式
以下通過具體實例進一步說明本發(fā)明。
實施例1:
以紅掌品種"火焰"的頂芽為外植體，接種至誘導培養(yǎng)基，誘導愈傷組織； 取誘導形成2周的愈傷組織，轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)至愈傷組織進入快 速增殖期；取快速增殖的愈傷組織，在25i:黑暗條件下進行受體愈傷組織預培 養(yǎng)3天；取預培養(yǎng)的愈傷組織(約2000個培養(yǎng)皿，含20000塊以上的愈傷組織)， 在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡15分鐘，之后棄去菌液，用無菌濾紙吸干，接種于共培 養(yǎng)基上，在23t:黑暗條件下共培養(yǎng)3天；取共培養(yǎng)愈傷組織，洗凈、晾干后， 轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基，在25t黑暗條件下培養(yǎng)4周，收集長出的抗性愈傷組織(約 300塊)，轉(zhuǎn)移至新的篩選培養(yǎng)基上，再進行連續(xù)3輪繼代篩選，每隔4周轉(zhuǎn)繼 l次；取4輪篩選后的抗性愈傷組織(39塊)，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基，誘導分化 成苗35株，對抗性植株進行葡糖苷酸酶基因組織化學染色和潮霉素基因分子檢 測，選取含目的基因的分化小苗16株，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基長成正常幼苗12株； 取入選的轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)移至溫度(TC下進行耐冷性鑒定4周，選留不受凍凍危 害的轉(zhuǎn)基因植株3株；繼續(xù)種植入選的轉(zhuǎn)基因紅掌株系，在2007-2008年室內(nèi)外 評價模擬評價耐冷的表達穩(wěn)定性，獲得抗低溫凍害的轉(zhuǎn)基因耐冷紅掌株系1個， 即TCT-Aa-l，可經(jīng)受(TC低溫冷害。
權(quán)利要求
1.一種耐冷紅掌的轉(zhuǎn)基因培育方法，其特征在于包括以下步驟1)取主栽紅掌品種的頂芽為外植體，接種至誘導培養(yǎng)基，誘導愈傷組織；2)取誘導形成2周的愈傷組織，轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)至愈傷組織進入快速增殖期；3)取快速增殖的愈傷組織，在25℃黑暗條件下進行受體愈傷組織預培養(yǎng)3天；4)取預培養(yǎng)的愈傷組織，在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡15分鐘，之后棄去菌液，用無菌濾紙吸干，接種于共培養(yǎng)基上，在23℃黑暗條件下共培養(yǎng)3天；5)取共培養(yǎng)愈傷組織，洗凈、晾干后，轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基，在25℃黑暗條件下培養(yǎng)4周，收集新長出的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)移至新的篩選培養(yǎng)基上，再進行連續(xù)3輪繼代篩選，每隔4周轉(zhuǎn)繼1次；6)取4輪篩選后的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基，誘導分化成苗，對抗性植株進行葡糖苷酸酶基因組織化學染色和分子檢測，選取含目的基因的分化小苗，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基長成幼苗；7)取入選的轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)移至溫度0℃下進行耐冷性鑒定4周，選留不受凍凍危害的轉(zhuǎn)基因植株；8)繼續(xù)種植步驟7)篩選的轉(zhuǎn)基因紅掌株系，室內(nèi)外評價驗證耐冷的表達穩(wěn)定性，對穩(wěn)定的優(yōu)良株系進行繁殖，培育出轉(zhuǎn)基因耐冷紅掌。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐冷紅掌的轉(zhuǎn)基因培育方法，其特征在于所說的誘 導培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基添加2,4-D 0.6mg、 6-BA 0.5mg、蔗糖30g、瓊脂 粉6.8g， pH滅菌前5.8。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐冷紅掌的轉(zhuǎn)基因培育方法，其特征在于所說的繼 代培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加2,4-D 0.6mg、6-BA 2mg、蔗糖30g、瓊脂粉6.8g， pH滅菌前5.8。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐冷紅掌的轉(zhuǎn)基因培育方法，其特征在于所說的共 培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基添加ABA 5mg/L、 2，4-D 0.6mg、 6-BA 2mg、蔗糖 30g、瓊脂粉6.8g， pH滅菌前5.8。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐冷紅掌的轉(zhuǎn)基因培育方法，其特征在于所說的篩 選培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基添加潮霉素100mg、 ABA5mg/L、 2，4-D 0.6mg、 6-BA2mg、蔗糖30g、瓊脂粉6.8g， pH滅菌前5.8。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐冷紅掌的轉(zhuǎn)基因培育方法，其特征在于所說的分化培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加KT lmg、 NAA0.2mg、蔗糖30g、瓊脂粉6.8g， pH滅菌前5.8。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐冷紅掌的轉(zhuǎn)基因培育方法，其特征在于所說的生 根培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加NAA 0.5mg、蔗糖30g、瓊脂粉6.8g， pH滅菌 前5.8。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2-7中任一所述的耐冷紅掌的轉(zhuǎn)基因培育方法，其特征在于 所說的MS基本培養(yǎng)基為NHUNOs 650mg、 KN03 900mg、 CaCl2'2H20 440mg、 MgS047H20370mg、 KH2PO4700mg、 KI 0.83 mg、 H3B03 6.2mg、 MnS04'4H20 22.3mg、 ZnS04'7H20 8.6mg、 Na2Mn04.2H20 0.25mg、 CuS04.5H20 0.025mg、 CoCl2.6H20 0.025mg、 FeS04.7H20 27.8mg Na2-EDTA.2H20 37.3mg 、肌醇 lOOmg、煙酸0.5mg、維生素B6 0.5mg、維生素Bl 0.5mg和甘氨酸2mg。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種耐冷紅掌的轉(zhuǎn)基因培育方法，包括以下步驟取主栽紅掌品種的頂芽為外植體，誘導愈傷組織，繼代培養(yǎng)至快速增殖期，暗條件預培養(yǎng)，進行農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基進行4輪篩選，取抗性愈傷組織誘導分化成苗，對抗性植株進行組織化學染色和分子檢測，鑒定含目的基因的分化小苗，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基長成正常幼苗，對入選的轉(zhuǎn)基因植株進行耐冷性鑒定，選留不受凍凍危害的轉(zhuǎn)基因植株，繼續(xù)種植入選的轉(zhuǎn)基因紅掌株系，評價驗證耐冷性的表達穩(wěn)定性，對穩(wěn)定的優(yōu)良株系進行繁殖，培育抗低溫凍害的轉(zhuǎn)基因耐冷紅掌。
文檔編號C12N15/82GK101643747SQ20091010207
公開日2010年2月10日 申請日期2009年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月25日
發(fā)明者葉紅霞, 吳殿星, 周志丹, 田丹青, 舒小麗, 葛亞英 申請人:浙江大學