專利名稱：枯草芽孢桿菌ds3在降解皂素廢水有機(jī)污染物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)DS3在降解皂素廢水有機(jī)污染物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
皂素(如薯蕷皂素)生產(chǎn)廢水具有廢水量小、色度大、有機(jī)物濃度高、酸度大、溫度高等特點(diǎn)，可生化性差，是一種非常難處理的廢水。根據(jù)《皂素工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB20425-2006)中具體規(guī)定，自2009年起COD排放量應(yīng)低于300mg/L。目前皂素水解原液COD濃度達(dá)到20000-40000m g/L，綜合廢水COD濃度約為4000-12000mg/L。若直接排入水體，會(huì)導(dǎo)致水體的有機(jī)污染物濃度大幅度增力口，由此引起江河湖泊嚴(yán)重污染，不僅直接影響了人們的生存環(huán)境，也造成了國民經(jīng)濟(jì)的巨大損失。皂素廢水中含有大量有機(jī)污染物，其中部分毒性醛、酮、酚類物質(zhì)對(duì)污水處理系統(tǒng)里污泥中的微生物具有抑制作用，一般微生物不能正常生長。同時(shí)，皂素廢水中硫酸根濃度高，約為8000mg/L左右，在高鹽度廢水的生物處理系統(tǒng)中，由于鹽度的變化往往會(huì)破壞微生物的細(xì)胞膜和菌體內(nèi)的酶，致使污泥活性下降。同時(shí)，微生物對(duì)環(huán)境具有一定的適應(yīng)能力，在一定鹽度范圍內(nèi)微生物通過自身的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制平衡細(xì)胞內(nèi)的滲透壓或保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的原生質(zhì)，調(diào)節(jié)自身新陳代謝以適用鹽度的變化?；钚晕勰嘣诤}環(huán)境中經(jīng)過一段時(shí)間馴化后，將具有一定的耐鹽性。目前對(duì)皂素廢水的處理多采用物理或化學(xué)的方法，現(xiàn)有技術(shù)中還沒有微生物降解方法和用于降解皂素廢水有機(jī)污染物的菌株的報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種枯草芽孢桿菌DS3在降解皂素廢水有機(jī)污染物中的應(yīng)用。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為
枯草芽孢桿菌DS3在降解皂素廢水有機(jī)污染物中的應(yīng)用。上述方案中，挑取活化后的枯草芽孢桿菌DS3單菌落，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，按培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌DS3 :皂素廢水的體積比為O. 5-2 :100接種，30-35°C、pH值為6-8的條件下恒溫培養(yǎng)，反應(yīng)48-72小時(shí)。上述方案中，所述枯草芽孢桿菌DS3保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M 2010146。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明取得的有益效果是枯草芽孢桿菌DS3在高濃度硫酸根離子環(huán)境中具有較強(qiáng)的生長能力和良好的去除皂素廢水中有機(jī)污染物的能力，該菌株能在72小時(shí)之內(nèi)去除皂素廢水中的COD 2150mg/L，去除效率達(dá)到50. 71%。本發(fā)明為降解皂素廢水高濃度有機(jī)污染物提供了有用的菌源，拓寬了對(duì)枯草芽孢桿菌功能方面的應(yīng)用，具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為枯草芽孢桿菌DS3的PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖(左為Marker ;右為擴(kuò)增產(chǎn)物)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，當(dāng)然下述實(shí)施例不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。一、枯草芽孢桿菌DS3的篩選
(一)、材料準(zhǔn)備1、實(shí)驗(yàn)廢水和池底污泥取自湖北省十堰市某黃姜皂素生產(chǎn)廠生產(chǎn)排放廢水的生化處理系統(tǒng)。
2、培養(yǎng)基
篩選培養(yǎng)基3g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/L氯化鈉，20g/L瓊脂，pH6. 8。富集培養(yǎng)基(g/L) 30g/L磷酸氫二鉀，100mg/L無水硫酸鎂，10g/L磷酸二氫鉀，10mg/L四水硫酸猛,5g/L硝酸銨，10mg/L七水硫酸亞鐵，lg/L硫酸鈉,5mg/L氯化|丐，冰箱保存。使用時(shí)，稀釋10倍，加入10%葡萄糖，pH值7. O 7. 2。LB液體培養(yǎng)基蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化鈉10. 0g/L，蒸餾水IOOOmL, ρΗ7· O。LB固體培養(yǎng)基蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化鈉10.0g/L，蒸餾水IOOOmL,瓊脂 15g/L (固)，ρΗ7· O。LB斜面培養(yǎng)基蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化鈉10.0g/L，蒸餾水IOOOmL,瓊脂 20g/L (固)，ρΗ7· O。3、實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備
國華SHA-B恒溫振蕩器，
東器SPX生化培養(yǎng)箱，
立式壓力蒸汽滅菌器，
光學(xué)顯微鏡-----Olympus有限公司，
pH 計(jì)等-----sarporiusPD-10,
超凈工作臺(tái)，
PTC200 型 PCR 儀，
電泳儀及電泳槽，
UVP凝膠紫外觀測儀。(二 )、菌株的篩選分離與純化1.篩選分離
1)稱取2克黃姜皂素生產(chǎn)廠廢水處理系統(tǒng)中酸化池尾區(qū)的池底污泥樣品，加入事先滅菌好的裝有IOOmL無菌水的250mL的三角瓶內(nèi)，30°C恒溫振蕩200rpm，將菌膠團(tuán)打碎，得泥水混合物，備用；
2)將泥水混合物轉(zhuǎn)入裝有IOOmL篩選培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，30°C恒溫靜置培養(yǎng)至培養(yǎng)基渾濁，得到菌懸液A ;
3)取5 mL菌懸液A于裝100 mL新鮮的篩選培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中培養(yǎng)一周；將培養(yǎng)一周后的菌懸液取5 mL于裝100 mL新鮮的篩選培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中培養(yǎng)一周，重復(fù)操作5-6次，最后得到的菌懸液B ；
2.用無菌移液管吸取O. 5mL上述菌懸液B，稀釋涂布于固體培養(yǎng)基上。37°C左右恒溫培養(yǎng)3d，挑取在菌落特征上有明顯差異的單菌，在LB固體培養(yǎng)基上反復(fù)劃線培養(yǎng)三次直至獲得單一菌株，并于LB斜面培養(yǎng)基上保存，得到一株菌株DS3，即枯草芽孢桿菌DS3。二、枯草芽孢桿菌DS3的鑒定1、對(duì)枯草芽孢桿菌DS3的鑒定·
對(duì)枯草芽孢桿菌DS3進(jìn)行了生理生化的鑒定、16S rRNA分子的鑒定并結(jié)合Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)，從分子水平確定枯草芽孢桿菌DS3的種屬。16S rRNA序列分析主要按照以下步驟
I)細(xì)菌核DNA的提取
使用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。2) 16S rRNA 基因的 PCR 擴(kuò)增，
PCR 擴(kuò)增引物參照 Weisburg 等人(Weisburg W G, Barns S M, Pelletier D A. 16Sribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. J. Bacteriol, 1991,173: 697 - 703)的方法合成。P1:正向引物 5 ’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3 ’
P2 :反向引物 5’ GGTTACCTTGTTACGACTT3’
在50mL反應(yīng)體積中，加入ImL模板DNA (0.1mg), 0. 5mL Pl和P2 (終濃度為0. 5mM),ImLdNTP (每種 ΝΤΡ0. 2 禮)，0. 5mLTaq 聚合酶(2 U)和 5 mL 10XPCR 緩沖液。PCR 擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性5 min ;在94°C變性30s，61_65°C退火30s，72°C延伸lmin，循環(huán)30次;最后72 ° C終延伸10 min。3) PCR產(chǎn)物的回收
將PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放入1.5mL離心管中加2倍體積TE，65°C水浴10分鐘后加等體積水飽和酚抽提一次離心后取上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍體積的lOmol/L乙酸銨和2倍體積無水乙醇沉淀，離心，用濃度為70%乙醇洗沉淀一次，風(fēng)干后溶于適量滅菌雙蒸水。4) 16S rDNA的全序列測定和分析
PCR測序用正反向引物參照Hiraishi等人(Hiraishi A, Shin Y K, Ueda Y.Automated Sequencing of PCR-amplified 16S rDNA on ‘Hydrolink’ Gels[J]. J.Microbiol. Methods, 1994, 19: 145 — 154)方法合成。P-f CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC ；
P-r GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。加入ImL模板DNA (〈0· lmg)，PCR擴(kuò)增 30 個(gè)循環(huán)(94 °C I min, 55 °C 30s, 72 。C 2min)。采用ABI PRISM測序試劑盒中染料終止劑終止反應(yīng)。然后,在Applied Biosystem373 A DNA測序儀上測序。測得的16S rDNA序列采用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析，最終從分子水平上確定該菌的種屬。
2、16S rRNA 序列測定
本發(fā)明采用對(duì)16SrRNA序列測定和分析的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分子水平的鑒定。以細(xì)菌的核DNA為模板，以16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增的通用引物為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度為1437bp的擴(kuò)增帶(用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測)，如圖1所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，測定其全序列，其序列見SEQ ID NO:1。三、菌落形態(tài)特征以及生理生化特性
枯草芽孢桿菌DS3的菌落形態(tài)為菌落呈白色或淡黃色、不透明、圓形、表面粗糙，中間有皺起、邊緣不整齊；需氧，革蘭氏陽性芽孢桿菌。最適生長PH值6. 5 7. 5，最適生長溫度25-35 °C。不能在60 °C生長。 四、枯草芽孢桿菌DS3為新的菌株
采用BLAST分析法對(duì)菌株DS3的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析發(fā)現(xiàn)，菌株DS3與枯草芽孢桿菌心Subtilis)的同源性高達(dá)99. 0%。綜合菌株的生理生化以及分子鑒定結(jié)果，菌株DS3命名為枯草芽孢桿菌{Bacillus SubtHis)收 。查閱有關(guān)資料，尚無枯草芽孢桿菌屬有關(guān)降解皂素廢水能力研究的報(bào)道。枯草芽孢桿菌(feci77心為新的菌株，已于2010年6月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號(hào)CCTCC M 2010146。本發(fā)明從湖北省十堰市某黃姜皂素生產(chǎn)廠排放廢水的生化處理系統(tǒng)污泥中篩選分離出這一株細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)其有較好降解皂素廢水中有機(jī)污染物的功能。這拓寬了人們對(duì)枯草芽孢桿菌UaciBm Subtilis)在其功能方面的應(yīng)用研究思路，并為降解高濃度有機(jī)污染物黃姜皂素廢水及其他皂素廢水提供了有用的菌源和技術(shù)，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。五、枯草芽孢桿菌DS3的應(yīng)用
挑取活化后的枯草芽孢桿菌(Mcillus Subtilis) DS3單菌落，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，按培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌(feci77w5· Subtilis)!)^ :阜素廢水(即實(shí)驗(yàn)廢水,取自湖北省十堰市某黃姜皂素生產(chǎn)廠排放廢水的生化處理系統(tǒng))的體積比為O. 5-2 :100接種，30-35°C恒溫培養(yǎng)，pH值為6-8，反應(yīng)48-72小時(shí)。在本實(shí)施例中，具體的應(yīng)用方法為用接種環(huán)挑取單菌落DS3，于50mL LB液體培養(yǎng)基中30°C震蕩培養(yǎng)過夜；取ImL菌液接種于9mL皂素廢水(脫酸水初始COD 4700 mg/L左右、pHl.28)中；另取一支裝有9mL皂素廢水的試管，加入ImL LB液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)t匕。調(diào)節(jié)水樣pH值約為7. 0，置于35°C、150rpm振蕩培養(yǎng)3d，測定水樣的COD值，從而計(jì)算得到菌株對(duì)廢水的COD去除效率。該菌株能在72小時(shí)之內(nèi)去除皂素廢水中的C0D2150mg/L，去除效率達(dá)到50. 71%。需要說明的是，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.枯草芽孢桿菌DS3在降解皂素廢水有機(jī)污染物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，挑取活化后的枯草芽孢桿菌DS3單菌落，于 LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，按培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌DS3 :皂素廢水的體積比為O. 5-2 :100 接種，30-35°C、pH值為6-8的條件下恒溫培養(yǎng)，反應(yīng)48-72小時(shí)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌DS3保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M 2010146。
全文摘要
本發(fā)明提供一種枯草芽孢桿菌DS3在降解皂素廢水有機(jī)污染物中的應(yīng)用。該枯草芽孢桿菌DS3保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO:M2010146。該枯草芽孢桿菌DS3在高濃度硫酸根離子環(huán)境中具有較強(qiáng)的生長能力和良好的去除皂素廢水中有機(jī)污染物的能力，該菌株能在72小時(shí)之內(nèi)去除皂素廢水中的COD2150mg/L，去除效率達(dá)到50.71%。本發(fā)明為降解皂素廢水高濃度有機(jī)污染物提供了有用的菌源，拓寬了對(duì)枯草芽孢桿菌功能方面的應(yīng)用，具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C02F3/34GK103011424SQ201210538229
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者鄭丹, 鮑建國 申請(qǐng)人:中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)