專利名稱：短小芽孢桿菌及其在防控水產(chǎn)霍亂弧菌中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株短小芽孢桿菌、其制劑及其在防控水產(chǎn)霍亂弧菌中的應(yīng)用，屬于漁業(yè)生態(tài)安全和水產(chǎn)品衛(wèi)生安全領(lǐng)域，用于改善漁業(yè)水質(zhì)，抑殺水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中的霍亂弧菌。
背景技術(shù)：
霍亂弧菌(VC)是引起人烈性傳染 病霍亂的病原體，在我國(guó)被列為甲類傳染病，國(guó)際上被列為檢疫傳染病?；魜y弧菌的自然棲息地是水體生態(tài)系統(tǒng)，它是在水環(huán)境中土生土長(zhǎng)的，是水生動(dòng)物、浮游生物的共棲體。它以水生動(dòng)物的甲殼質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，具嗜溫、嗜堿、嗜營(yíng)養(yǎng)鹽的特性，能產(chǎn)生毒素使人致霍亂病；能分泌甲殼質(zhì)酶腐蝕某些水生動(dòng)物(甲魚、蝦、蟹、貝及浮游甲殼類等)的甲殼，破壞其保護(hù)層，引發(fā)疾??；能轉(zhuǎn)化硝酸鹽為有毒的亞硝酸鹽使水質(zhì)敗壞，危害養(yǎng)殖對(duì)象。人類霍亂是經(jīng)口感染的腸道傳染病，主要經(jīng)水、食物等而傳播，正常人食入霍亂弧菌量超過(guò)108—9均可發(fā)??；霍亂自流行區(qū)向外擴(kuò)散，主是通過(guò)水體與食品的污染以及病人與帶菌者的擴(kuò)散而實(shí)現(xiàn)，隨著安全飲用水的普及，食物型(主要是水產(chǎn)品，尤其是甲魚產(chǎn)品)傳播日趨突出。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)甲魚等水產(chǎn)品攜帶霍亂弧菌的防疫尚處于對(duì)其苗種和產(chǎn)品檢疫防疫階段，但往往防不勝防。因?yàn)槠漯B(yǎng)殖水體中滋生的病菌，不僅污染水產(chǎn)品，也對(duì)周圍環(huán)境造成污染，擴(kuò)大傳播途徑，增加霍亂流行風(fēng)險(xiǎn)。而且，一旦發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖水體或水產(chǎn)品霍亂弧菌檢測(cè)陽(yáng)性，政府需要立即采取緊急措施予以控制，一般采用化學(xué)藥物對(duì)染疫水體及周邊環(huán)境進(jìn)行全面徹底消毒，撲殺、銷毀染疫水體中所有水產(chǎn)品，同時(shí)需支付巨額疫病防控補(bǔ)償。這樣不僅造成極大的經(jīng)濟(jì)損失，也會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的藥物污染或次生災(zāi)害。因此，能否在水產(chǎn)品上市之前，通過(guò)無(wú)公害的生物預(yù)防方法，在養(yǎng)殖生產(chǎn)環(huán)節(jié)使霍亂弧菌得到消除，切斷其傳播源，是杜絕水產(chǎn)品衛(wèi)生安全隱患的關(guān)鍵所在和理想途徑，也是國(guó)內(nèi)外亟需攻克的重要課題。通過(guò)尋求拮抗菌以消除水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中的霍亂弧菌，目前國(guó)內(nèi)外尚未見有關(guān)研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種短小芽孢桿菌AB3 (Bacillus pumilus AB3),該菌株可以以拮抗菌的作用有效的消除水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中的霍亂弧菌，解決了現(xiàn)有技術(shù)中水產(chǎn)品攜帶霍亂弧菌的防疫問(wèn)題。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種短小芽孢桿菌 AB3 (Bacillus pumilus AB3)，其保藏編號(hào)為 CGMCCN0:6408，其具有抑制霍亂弧菌生長(zhǎng)或繁殖的能力。本發(fā)明的另一目的在于提供一種霍亂弧菌拮抗菌制劑，其特征在于所述制劑包括藥學(xué)上有效量的所述的短小芽孢桿菌AB3 (Bacillus pumilus AB3)。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種所述的微生態(tài)霍亂弧菌抑菌制劑在水產(chǎn)品養(yǎng)殖系統(tǒng)中霍亂弧菌抑制方面的應(yīng)用。所述的霍亂弧菌選自人類霍亂以及甲魚、蝦類、蟹類和貝類的甲殼腐爛癥的病原菌。使用的微生物使用的短小芽孢桿菌菌株，自市場(chǎng)購(gòu)買的漁用微生態(tài)制劑，經(jīng)分離培養(yǎng)和抑菌篩選得到，菌株代號(hào)為AB3。此菌經(jīng)鑒定,其屬于短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的成員，命名為短小芽孢桿菌AB3 (Bacillus pumilus AB3),簡(jiǎn)稱BPAB3,現(xiàn)在已經(jīng)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCC N0:6408，保藏日期為2012年8月10日，為霍亂弧菌拮抗菌菌株。短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)是一種飼用微生物菌種,適用于豬、禽類、反芻動(dòng)物和魚、奸等水產(chǎn)動(dòng)物，可用于防治小麥根腐病、草莓灰霉病。
短小芽孢桿菌AB3 (Bacillus pumilus AB3)的生物學(xué)特性短小芽孢桿菌AB3 (Bacillus pumilus AB3),菌體呈桿狀，圓末端,單個(gè)或呈短鏈排列，寬X長(zhǎng)為(0.6、.7) X (3-4)微米。能運(yùn)動(dòng)，革蘭氏陽(yáng)性，芽孢橢圓形，中生或次端生。該菌存在半透明型和不透明型兩種不同的菌落形態(tài)，對(duì)兩種菌落分別進(jìn)行傳代，半透明菌落能產(chǎn)生半透明和不透明型菌落，且基本各占一半。而不透明菌落在傳代過(guò)程中只產(chǎn)生少許的半透明菌落，且傳至第4代時(shí)半透明型菌落消失。該菌能水解淀粉，降解甘露聚糖、木聚糖、纖維素等。微生物的培養(yǎng)篩選方法通過(guò)在瓊脂培養(yǎng)基上打孔抑菌試驗(yàn)，從分離菌株中篩選出對(duì)霍亂弧菌抑制作用較強(qiáng)的拮抗菌。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明的目的在于提供一種霍亂弧菌拮抗菌制劑及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用技術(shù)。該霍亂弧菌拮抗菌制劑可作為替代化學(xué)消毒劑的有益微生物制劑，用于改善漁業(yè)水質(zhì)，清除水產(chǎn)品養(yǎng)殖系統(tǒng)中的霍亂弧菌，從而預(yù)防霍亂弧菌對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象的危害，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展；避免水產(chǎn)品攜帶霍亂弧菌，保障人類健康安全。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。實(shí)施例1霍亂弧菌拮抗菌尋找、篩選、鑒定(I)霍亂弧菌拮抗菌尋找、篩選A)原料霍亂弧菌菌種從溫室甲魚養(yǎng)殖水體分離獲得，經(jīng)鑒定確定為霍亂弧菌，其血清型為 0139。漁用微生態(tài)制劑選用光合細(xì)菌類、芽孢桿菌類、乳酸菌類、硝化細(xì)菌類、酵母菌類、復(fù)合菌類六大類，共計(jì)28個(gè)品種，從漁藥店市售采購(gòu)。培養(yǎng)基試劑包括胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，從試劑公司米購(gòu)。胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)的制備稱取42g，溶于IOOOml蒸餾水的三角瓶中，攪拌溶解后，121°C高壓蒸汽滅菌15min，然后在培養(yǎng)皿中傾注平板，4°C保存?zhèn)溆谩I(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)的制備稱取18g，溶于IOOOml蒸餾水的三角瓶中，攪拌溶解后，用試管分裝，121°C高壓蒸汽滅菌15min，4°C保存?zhèn)溆?。B)霍亂弧菌液的制備通過(guò)無(wú)菌操作，用接種環(huán)將霍亂弧菌接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管中，放于36°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-20h,4°C保存?zhèn)溆谩)霍亂弧菌拮抗菌分離篩選 I)細(xì)菌分離通過(guò)無(wú)菌操作，用無(wú)菌生理水將28種漁用微生態(tài)制劑分別稀釋成菌胞濃度為1000-3000cfu/ml,然后分別取各種稀釋菌液O.1ml,各加入到一個(gè)胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中，并用無(wú)菌三角玻璃棒將各種菌液平鋪于瓊脂培養(yǎng)基表面,再將培養(yǎng)皿置于36°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。根據(jù)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)菌落的大小、形狀、顏色、光澤等培養(yǎng)特征,將菌落區(qū)分為若干類。用接種環(huán)分別挑取每一類的單個(gè)菌落接種在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管中，36°C下培養(yǎng)48h，制成若干種單個(gè)分離菌株的純培養(yǎng)液，并通過(guò)比濁儀測(cè)試，用無(wú)菌生理鹽水將各種細(xì)菌純培養(yǎng)液的含菌量調(diào)整到基本相同。通過(guò)細(xì)菌分離培養(yǎng),根據(jù)培養(yǎng)皿中胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌落的大小、形狀、顏色、光澤等培養(yǎng)特征，從28種漁用微生物制劑中分離出36類菌株，并通過(guò)純培養(yǎng)和濃度調(diào)試，獲得36種含菌量相同的細(xì)菌純培養(yǎng)液。2)拮抗菌的篩選通過(guò)無(wú)菌操作，在若干培養(yǎng)皿胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基表面均勻涂抹霍亂弧菌液，之后用打孔器在每個(gè)培養(yǎng)皿瓊脂培養(yǎng)基上均勻打4個(gè)直徑為9_左右的園孔，然后分別吸取若干種分離菌的純培養(yǎng)液各O.1ml,各入到一個(gè)瓊脂培養(yǎng)基的孔中，其培養(yǎng)皿于36°C下培養(yǎng)24h，觀察瓊脂培養(yǎng)基打孔周圍抑菌圈的大小，檢驗(yàn)每一類菌落的純培養(yǎng)物對(duì)霍亂弧菌的抑制效果。通過(guò)在胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上打孔抑菌試驗(yàn)，從36種分離細(xì)菌純培養(yǎng)液中找到3對(duì)霍亂弧菌有抑制作用的拮抗菌株，取代號(hào)為AB3、AB21、AB32，其中AB3純培養(yǎng)液對(duì)霍亂弧菌的抑制效果最明顯。拮抗菌AB3、AB21、AB32的培養(yǎng)特征及其對(duì)霍亂弧菌的抑制效果見表I。表1AB3、AB2UAB32培養(yǎng)特征及其對(duì)霍亂弧菌的抑制
菌株號(hào)菌體大小菌體形態(tài)菌落大小菌落顏色培養(yǎng)液pH 抑菌效果 (寬 μηι X 長(zhǎng)mm
__μπι)______
"ΑΒ3(0.6-0.7) X 桿狀SI 42非常顯著~
__(3-4)______
4B21 (0.6-0.7) X 桿狀 2^5 ^ KM _ (3-5)______
權(quán)利要求
1.一種短小芽孢桿菌AB3,該菌株保藏名稱為Bacillus pumilus AB3,其保藏編號(hào)為 CGMCC NO:6408，其具有抑制霍亂弧菌生長(zhǎng)或繁殖的能力。
2.一種霍亂弧菌抑菌制劑，其特征在于，所述制劑包括藥學(xué)上有效量的權(quán)利要求1所述的短小芽抱桿菌AB3 (Bacillus pumilus AB3)。
3.—種權(quán)利要求2所述的霍亂弧菌抑菌制劑在抑制水產(chǎn)品養(yǎng)殖系統(tǒng)中霍亂弧菌方面的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的霍亂弧菌選自人類霍亂以及甲魚、 蝦類、蟹類和貝類的甲殼腐爛癥的病原菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種短小芽孢桿菌AB3，該菌株保藏名稱為Bacillus pumilus AB3，其保藏編號(hào)為CGMCC NO.6408，其具有抑制霍亂弧菌生長(zhǎng)或繁殖的能力。該菌作為霍亂弧菌拮抗菌可以制成抗菌制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中進(jìn)行應(yīng)用，可作為替代化學(xué)消毒劑的有益微生物制劑，用于改善漁業(yè)水質(zhì)，清除水產(chǎn)品養(yǎng)殖系統(tǒng)中的霍亂弧菌，從而預(yù)防霍亂弧菌對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象的危害，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展；避免水產(chǎn)品攜帶霍亂弧菌，保障人類健康安全。
文檔編號(hào)C02F3/34GK102994417SQ20121039369
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者陳文怡, 張?jiān)?申請(qǐng)人:蘇州市水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心