專利名稱：一株烷烴降解菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物強化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株烷烴降解菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著石油工業(yè)的發(fā)展，石油開采、運輸及煉制加工過程中，大量石油通過各種途徑進(jìn)入大氣、水體及土壤，已造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。據(jù)美國環(huán)境保護(hù)署(EPA)估計，在美國約有3飛百萬個地下化學(xué)物質(zhì)和石油儲存?zhèn)}庫，每年平均約有I %的倉庫會發(fā)生泄漏，嚴(yán)重影響地表水和地下水的質(zhì)量,對人的身體健康帶來極大危害。我國約有11萬座加油站,加油站如此密布在城市的大街小巷，一旦出現(xiàn)問題，對地下水將會造成巨大的危害。生物強化技術(shù)因其針對性強、效率高和成本低等優(yōu)點，被認(rèn)為是目前最有生命力的治理環(huán)境污染的新技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于廢水與土壤的治理和修復(fù)，成為近年來的研究重點和熱點。高效菌技術(shù)的核心是針對目標(biāo)污染物篩選出具有優(yōu)異降解能力的菌種。石油及 其產(chǎn)品是由正構(gòu)烷烴、直鏈烷烴、芳烴、脂環(huán)烴及少量的其他有機(jī)物組成的混合物，其中以烷烴的含量最高。目前，已報道降解石油的菌種多為細(xì)菌類，其中主要有假單胞菌屬、黃桿菌屬、棒狀菌屬、無色桿菌屬、節(jié)桿菌屬和不動桿菌屬等，真菌類對石油類具有良好降解效果的主要為白腐真菌，放線菌中的紅球菌對石油也有很好的降解能力。迄今為止，國內(nèi)外將冢村氏菌用于處理水體中的烷烴或用于修復(fù)土壤中石油類污染則更是未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有石油類污染物存在的問題，目的是提供一種烷烴降解菌及其應(yīng)用，該菌種能高效地降解石油類污染物中的烷烴組分。本發(fā)明所提供的冢村氏菌sp. )C20來源于中國石油化工股份有限公司武漢分公司污水處理站內(nèi)受污染的土壤，經(jīng)人工富集、平板劃線分離純化所得到。該菌為W^_iTsukainureUa sp.)編號為C20，革蘭氏陽性菌，菌落呈菊黃色，邊緣整齊，呈圓形，表面干燥，中心凸起，顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)為短桿狀，呈鏈狀排列，沒有莢膜。過氧化氫酶實驗、V-P實驗和吲哚實驗均為陽性。該降解菌16S rDNA的GeneBank的登錄號為JQ806393，于2012年3月23日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué))保藏，保藏編號為CCTCC NO: M2012089。該菌能以正十六烷為唯一碳源和能源進(jìn)行生長繁殖，能在48 h內(nèi)將濃度為1000mg/L的正十六烷降解至20mg/L，降解率達(dá)98. 0%。該菌對石油類中的烷烴具有高效降解能力，當(dāng)以柴油為唯一碳源時，該菌能對柴油中的中長鏈烷烴(C12 C24)高效地降解，用于煉油廢水、受石油類污染水體和受石油類污染土壤的治理與修復(fù)。本發(fā)明提供的冢村氏菌sp. ) C20為放線菌,不僅對石油中的燒烴具有良好的降解作用，而且在降解過程中還會產(chǎn)生生物乳化劑，由于生物乳化劑屬于表面活性物質(zhì)，分子由疏水和親水兩部分構(gòu)成，同時具有親脂和親水的性質(zhì)，因此可增加油水的接觸面積，從而促進(jìn)微生物對石油類污染物的生物降解效果。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的冢村氏菌sp. ) C20能以正十六燒為唯一碳源和能源進(jìn)行生長繁殖，對石油類污染物有較強的降解能力，并且在降解烷烴組分的同時還可產(chǎn)生生物乳化劑，能夠提高烷烴和石油類污染物在水中的溶解度，更有利于煉油廢水的生物強化處理，亦利于水體和土壤中石油類污染物的治理與生物修復(fù)。


圖I為冢村氏菌(TiwAa皿reJ7a sp. ) C20降解正十六燒的效果 圖2為冢村氏菌sp. ) C20對柴油降解前后的氣相色譜 圖3為冢村氏菌sp. )C20對添加較高濃度正十六烷的煉油廢水強化處
理效果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明做進(jìn)一步描述，并非對其保護(hù)范圍的限制。實施例I :冢村氏菌sp. )C20的分離、鑒定及其對燒烴的降解性能 菌源采自中國石油化工股份公司武漢分公司污水處理站內(nèi)受污染的土壤，距表層2
4 cm油泥混合物，呈黑褐色。將采集的土樣2g加入到100 mL含200 mg/L正十六烷的LB培養(yǎng)基(蛋白胨Iwt%，氯化鈉Iwt %，酵母抽提物O. 5 wt%)中，加入15 20顆滅菌的玻璃珠，在30°C和150 r/min條件下活化培養(yǎng)24 h。靜置10 min，取2 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至100 mL正十六烷無機(jī)鹽培養(yǎng)集中，相同條件馴化培養(yǎng)I 2 d，梯度轉(zhuǎn)接4次，其中正十六烷濃度分別為200、500、1000、2000 mg/L。將含正十六烷2000 mg/L的培養(yǎng)液梯度稀釋，并涂布于無機(jī)鹽平板上，30°C培養(yǎng)24 h后，挑選邊緣清晰的菌落，經(jīng)LB平板劃線純化至獲得單菌落，分別進(jìn)行正十六烷降解試驗。正十六烷含量采用高壓氣相色譜方法測定。無機(jī)鹽培養(yǎng)基的組成如下(g/L) =(NH4)2S04 為 Ig ；Κ2ΗΡ04 · 3H20 為 O. 5g ；KH2PO4 · H2O 為 O. 5g ；NaCl 為 Ig ；MgS04 · 7H20 為 0. 2g ;FeSO4 · 7H20 為 0. 03g ；CaCl2 · 2H20 為 0. 002g ;去離子水為 I L ;自然 pH。烷烴降解菌C20為革蘭氏陽性菌，菌落呈橘黃色，邊緣整齊，呈圓形，表面干燥，中心凸起；過氧化氫酶實驗、V-P實驗和吲哚實驗均為陽性。將烷烴降解菌C20接種于LB培養(yǎng)集中，于37°C搖床(150 r/min)培養(yǎng)14 h，離心收集菌體，重懸，加溶菌酶和SDS破壁，用酚-氯仿法提取基因組DNA，并采用正向引物27f(5，-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物 1492R (5，-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，對其基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增引物進(jìn)行測序。16S rDNA基因序列長為1419 bp，然后在GenBank中進(jìn)行Blast比對。結(jié)果顯示,與其序列相似性達(dá)到99%的均為Tsukamurel 13 sp,選取其中相似序列，采用Clustal X(l. 83)對所獲得的核苷酸序列進(jìn)行比對分析，得到序列之間的相似度值，并用MEGA 2. O計算出序列的系統(tǒng)進(jìn)化距離，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹顯示，與其相似度最高的菌株都為sp.菌株,其16S rDNA序列如序列表所示。結(jié)合菌株的生理生化特性和16S rDNA的測定結(jié)果,將其歸屬為冢村氏菌屬iJsukamurelL·sp.)，編號為C20。
將冢村氏菌(TiwAafiM/reJJa sp. ) C20的懸菌液接種到含正十六燒1000 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別測定不同時間剩余的正十六烷濃度，測定結(jié)果如圖I所示，菌株在前8h內(nèi)處于生長延滯期，8 h后降解菌適應(yīng)環(huán)境，降解速率逐漸提升，在8 24 h為快速降解期，36 h時剩余正十六烷的濃度降低到200 mg/L。36 48 h期間降解速率減慢，在培養(yǎng)48 h時，殘留正十六烷濃度僅為20 mg/L，表現(xiàn)出很好的降解性能。實施例2 :pH對冢村氏菌(TiwAaffitfrejUa sp. ) C20降解性能的影響
向無機(jī)鹽培養(yǎng)基接種2vol%的冢村氏菌iTsukamurella sp. ) C20菌懸液,調(diào)節(jié)無機(jī)鹽培養(yǎng)基為不同的pH值(5.0 8.0)，在起始正十六烷濃度為1000mg/L的條件下，培養(yǎng)36 h，測定pH值對C20降解正十六烷的影響，結(jié)果見表I。由表I表明，在pH為5. (T 7.0范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)基中PH的升高，菌株C20降解烷烴能力增加，pH為7時，降解能力最強，降解率達(dá)79. 4 % ;pH為8. 0時，降解率下降至54. 2%，而pH為6. 0時的降解率卻達(dá)到了 65. 1%， 說明菌株C20在中性或弱偏酸性環(huán)境中對烷烴的降解能力較強。表I pH對菌株C20降解正十六烷性能的影響
初始卩爿降解率(％)
5 0 23. 1%
5 5 45. 7%
6 0 65. 1%
6 5 78.9%
TTo 79.4%
ITl TL 2%
87o~ 154. 2%
本實施例說明冢村氏菌(sp. ) C20在中性和弱偏酸性的pH范圍內(nèi)均具有較強的降解能力，堿性條件下該降解菌的活性會受到一定的抑制。實施例3 :冢村氏菌(TiwAaffitfreJrJa sp. ) C20對柴油的降解
將2vol%的冢村氏菌(TiwAafiM/reJJa sp. ) C20接種于添加有800mg/L柴油的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于37°C和150r/min的搖床培養(yǎng)，分別培養(yǎng)8、12、18和23 h，取樣，氣相色譜法分析菌株對柴油的降解率，同時以不加菌的樣品為對照。從表2和圖2看出，雖然在初始的
12h內(nèi)，柴油組分揮發(fā)損失達(dá)14. 2%,但加入菌株TiwAaffitfreJJa sp. C20的降解率已達(dá)到58. 1%，表明該菌能降解柴油中的大部分烷烴。從圖2看出，該菌對烷烴組分(C12 C24)有很好的降解效果。表2菌株C20對柴油的降解效果
不Ml錮菌
SBJ31J
ISMA剛
23Mj6711
本實施例說明冢村氏菌(Tsukamurella sp. ) C20不僅可以降解正十六焼，對柴油中的C12 C24中長鏈烷烴組分也具有很好的降解性能，為該菌對煉油廢水的生物強化處理和對受石油類污染的土壤的生物修復(fù)提供了依據(jù)。實施例4 :冢村氏菌皿re77a sp. ) C20所產(chǎn)生的生物乳化劑的提取
將2vol%的冢村氏菌sp. ) C20接種于含500 mg/L的正十六燒無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，37 1搖床培養(yǎng)(150 r/min) 3 d，取出培養(yǎng)液，用紗布脫脂棉過濾、離心和去菌體(菌體于45°C烘箱烘干)，取一定量上清液，調(diào)pH為2，置于冰箱過夜，將上清液加入等體積的氯仿/甲醇提取，蒸干，干燥后的晶體再用氯仿洗滌，再蒸干，得到白色生物表面活性劑。將5 mL培養(yǎng)液與5 mL石蠟混合，超聲波震蕩20 min,靜置I h，乳化指數(shù)達(dá)63%，表明冢村氏菌(Tsukamurella sp. ) C20產(chǎn)生的乳化劑具有較好的乳化性能。本實施例說明冢村氏菌sp. )C20不僅能利用正十六燒為唯一碳源和能源進(jìn)行生長繁殖，而且在降解過程中還能產(chǎn)生具有表面活性作用的生物乳化劑，為其促進(jìn)石油類污染物的生物修復(fù)提供了理論依據(jù)。
實施例5sp. ) C20對添加較高濃度正十六烷的煉油廢水的強化處理
在錐形瓶中，將冢村氏菌sp. )C20投加到中石化的活性污泥中，設(shè)置3組實驗考察其對正十六烷的去除效果。(a) 32 mL的煉油廢水+33 mL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基+500 mg/L的正十六燒+30 mL的活性污泥+5 vol %的C20菌懸液；
(b)32 mL的煉油廢水+33 mL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基+500 mg/L的正十六燒+30 mL高壓滅菌后的活性污泥+5 vol %的C20菌懸液；
(c)32 mL的煉油廢水+38 mL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基+500 mg/L的正十六烷+30 mL活性污泥。于37°C搖床(150 r/min)培養(yǎng)。間隔一定時間，取樣測定培養(yǎng)液中正十六烷的殘留濃度，結(jié)果如圖3所示冢村氏M ^Tsukamure113 sp. ) C20起到了明顯的生物強化作用，并在24 h內(nèi)將添加500 mg/L正十六烷的煉油廢水中的正十六烷完全去除。本具體實施方式
為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的。本具體實施方式
的冢村氏菌sp. )C20能以正十六燒為唯一碳源和能源進(jìn)行生長繁殖，對石油類污染物有較強的降解能力，并且在降解烷烴組分的同時還可產(chǎn)生生物乳化劑，能夠提高烷烴和石油類污染物在水中的溶解度，更有利于煉油廢水的生物強化處理，亦利于水體和土壤中石油類污染物的治理與生物修復(fù)。
權(quán)利要求
1.一株燒烴降解菌，經(jīng)鑒定為冢村氏菌sp.),編號為C20,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2012年3月23日，保藏編號為CCTCC NO: M2012089，菌株.16S rDNA 的 GenBank 登錄號為 JQ806393，其特征在于冢村氏菌(sp. ) C20為革蘭氏陽性菌，菌落呈菊黃色，邊緣整齊，呈圓形，表面干燥，中心凸起，顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)為短桿狀，呈鏈狀排列，沒有莢膜；該菌的過氧化氫酶實驗、V-P實驗和吲哚實驗均為陽性，能利用正十六烷作為唯一碳源和能源進(jìn)行生長繁殖。
2.如權(quán)利要求I所述燒烴降解菌的應(yīng)用，其特征在于所述冢村氏菌sp. )C20以正十六烷為唯一碳源和能源進(jìn)行生長，用于煉油廢水、受石油類污染水體和土壤的治理與修復(fù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述烷烴降解菌的應(yīng)用，其特征在于所述的石油類為烷烴中的C12-C24 組分。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株烷烴降解菌及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的一株烷烴降解菌C20屬于冢村氏菌(Tsukamurellasp.)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2012年3月23日，保藏編號為CCTCC NO:M 2012089，菌株16SrDNA的GenBank登錄號為JQ806393。該菌為革蘭氏陽性菌，菌落呈菊黃色，邊緣整齊，呈圓形，表面干燥，中心凸起，顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)為短桿狀，呈鏈狀排列，沒有莢膜。該菌48h內(nèi)對濃度為1000mg/L的正十六烷降解率高達(dá)98%，能高效降解柴油中的中長鏈烷烴(C12-C24)，并代謝產(chǎn)生能促進(jìn)油類溶解的生物乳化劑。該菌應(yīng)用于煉油廢水、受石油類污染水體和土壤的生物強化處理與修復(fù)，應(yīng)用前景良好。
文檔編號B09C1/10GK102703348SQ20121016594
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者姚嫚, 游海, 王巧鳳, 許龍龍, 顏家保, 魏鑫 申請人:武漢科技大學(xué)