專利名稱：一株鄰苯二甲酸二丁酯降解菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物強化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株鄰苯二甲酸二丁酯降解菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)是一種重要的增塑劑，廣泛應(yīng)用于電線電纜、家具、汽車、服裝、化妝品等行業(yè)。DBP為環(huán)境激素類物質(zhì)，能干擾動物及人類的生殖系統(tǒng)和發(fā)育，具有發(fā)育和胚胎毒性。因此美國環(huán)保局、歐盟和中國國家環(huán)境監(jiān)測中心均將DBP列為優(yōu)先控制污染物。 鄰苯二甲酸二丁酯類增塑劑易通過不同途徑擴散到自然環(huán)境中，且DBP在自然環(huán)境中非常穩(wěn)定，水解和光解的速率均非常緩慢，其水解半衰期長達20年之久，因此生物降解成為環(huán)境中DBP礦化的主要手段。生物法降解DBP具有成本低，條件溫和，不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點，符合構(gòu)建環(huán)境友好型及資源節(jié)約型社會的要求與發(fā)展趨勢。目前，國內(nèi)外已有部分學(xué)者針對DBP篩選出具有良好降解性能的菌株，如乙酸隹丐不動桿菌{Calcium acetate Acinetobacter)> 乳桿菌(XactobaciIlus、、深紅紅球菌iRhodococcus ruber)、突光假單胞菌iPseudomorms fluorescens)、銅綠假單胞菌(.Pseudomonas aeruginosa)等。Elizabethkingia sp.是最近新建的一個屬，由以前屬于黃桿菌屬中的6個種所組成，目前尚未見其降解鄰苯二甲酸二丁酯的報道。煉油廢水、農(nóng)藥廢水、啤酒廠廢水和焦化廢水中含有一定濃度的DBP，而DBP屬于難生化降解有機物，因此僅靠生物處理裝置中的普通微生物很難實現(xiàn)對DBP的有效降解。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在解決普通微生物對鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)降解效率低的問題，目的是提供一株DBP降解菌，實現(xiàn)其對煉油廢水、農(nóng)藥廢水、啤酒廢水和焦化廢水的生物強化處理。本發(fā)明所提供的DBP降解菌D8源于中國石油化工股份有限公司武漢分公司污水處理裝置中的活性污泥。該菌是以DBP作為唯一碳源和能源進行生長繁殖，在DBP無機鹽培養(yǎng)基中對活性污泥中的菌群進行馴化培養(yǎng)，并通過平板劃線分離純化得到。其中，DBP無機鹽培養(yǎng)基成分是K2HP0412H20 為 I. 0g, KH2PO4 為 I. 0g, NH4Cl 為O. 8g，NaCl 為 I. 0g，MgSO4 ·7Η20 為 O. 5g, CaCl2 為 O. 006g, FeSO4 ·7Η20 為 O. 02g，2mL 微量元素儲備液，補足蒸懼水至IOOOmL ;所述微量元素儲備液(g/L)的組分是MnS04 -H2O為O. Ig,ZnSO4 · 7H20 為 O. 12g ；H3BO3 為 O. 07g !Na2MoO4H2O 為 O. 04g ；CuSO4 · 5H20 為 O. 02g ；CoCl2 為
O.04g。按固體培養(yǎng)基I. 5wt% 2wt%添加瓊脂。該菌為革蘭氏陰性菌，經(jīng)16S 鑒定為Elizabethkingia sp，編號D8，16S rDNA的GenBank登錄號為JQ673498，于2012年3月23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué))，保藏編號為CCTCC N0:M2012088，該菌的產(chǎn)硫化氫試驗、吲哚試驗、淀粉水解試驗、V-P試驗和硝酸鹽還原試驗均為陽性，甲基紅試驗和尿酶測定試驗為陰性，能利用鄰苯二甲酸二丁酯作為唯一碳源和能源進行生長繁殖。該菌菌落為黃色，呈圓形，光滑濕潤，邊緣整齊。較優(yōu)培養(yǎng)條件為溫度35°C，初始pH= 7，接種量7vol%，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。本發(fā)明還涉及所述sp. D8在DBP降解中的應(yīng)用，應(yīng)用于生物降解工業(yè)廢水中的DBP ;工業(yè)廢水為煉油廢水、農(nóng)藥廢水、啤酒廢水和焦化廢水中的一種。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比sp. D8能以DBP作為唯一碳源和能源進行生長繁殖，60 h內(nèi)能將無機鹽培養(yǎng)基中400 mg/L的DBP完全降解，并且能與原活性污泥中的土著微生物協(xié)同發(fā)揮高效降解作用，對煉油廢水、農(nóng)藥廢水、啤酒廢水和焦化廢水中的DBP具有良好的生物強化效果，具有良好的應(yīng)用前景。


圖I為本發(fā)明的菌株D8生長與DBP降解效果關(guān)系 圖2為培養(yǎng)溫度對本發(fā)明的菌株D8降解DBP的影響 圖3為初始pH值對本發(fā)明的菌株D8降解DBP的影響 圖4為接種量對本發(fā)明的菌株D8降解DBP的影響圖； 圖5為搖床轉(zhuǎn)速對本發(fā)明的菌株D8降解DBP的影響 圖6為本發(fā)明的菌株D8對添加較高濃度DBP煉油廢水的處理效果 圖7為本發(fā)明的菌株D8對添加較高濃度DBP農(nóng)藥廢水的處理效果 圖8為本發(fā)明的菌株D8對添加較高濃度DBP啤酒廠廢水的處理效果 圖9為本發(fā)明的菌株D8對添加較高濃度DBP焦化廢水的處理效果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明做進一步描述，并非對其保護范圍的限制。實施例I : Elizabethkingia sp. D8的分離與純化、鑒定及其對DBP的降解特性 I、菌株的分離與純化
(I)菌種來源
菌源來自中國石油化工股份有限公司武漢分公司污水處理裝置中的活性污泥。(2)菌株的分離與純化
將采集的樣本置于4°C冰箱靜置，取上清液I mL接種于100 mL已滅菌的LB培養(yǎng)基(蛋白胨lwt%，氯化鈉lwt%，酵母抽提物O. 5wt%)中，30°C、150r/min活化培養(yǎng)過夜。然后將ImL菌液轉(zhuǎn)接至含DBP為200mg/L的無機鹽培養(yǎng)基中，同樣條件下馴化培養(yǎng)2 d，逐步增大DBP濃度(400 mg/L,600 mg/L,800 mg/L、1000 mg/L,2000 mg/L)。馴化結(jié)束，將菌液分別按10_5、10_6、10_7、10_8體積比稀釋，涂布于含DBP的無機鹽平板上，30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周。挑取單個菌落，反復(fù)劃線純化，得到單菌落。進行降解試驗，確定各菌株的降解能力，以LB斜面保藏降解性能好的菌株。2、菌株的鑒定
(I)DBP降解菌株D8的菌落形態(tài)特征及生理生化特性菌株D8的菌落為黃色，邊緣整齊，呈圓形，光滑濕潤，中心凸起。該菌的產(chǎn)硫化氫試驗、吲哚試驗、淀粉水解試驗、V-P試驗和硝酸鹽還原試驗均為陽性，甲基紅試驗和尿酶測定試驗為陰性，能利用鄰苯二甲酸二丁酯作為唯一碳源和能源進行生長繁殖。(2)菌株 D8 的 16S rDNA 鑒定
對菌株D8的16S rDNA基因進行克隆、測序，然后在GenB ank中進行Blast比對。結(jié)果顯示，與其序列相似性達到99%的均為Elizabethkingia sp,其16S rDNA序列見序列表。結(jié)合菌株的生理生化特性，將其歸屬為sp.,編號為D8。3、菌株D8的生長及其對DBP降解效果
(I)菌懸液的制備
用接種環(huán)從試管斜面挑取一環(huán)菌接種于LB培養(yǎng)基，300C、150 r/min培養(yǎng)24h，取2 mL轉(zhuǎn)接于新鮮LB培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)12 h (細菌處于對數(shù)生長期)，取菌液于4000 r/min條件下離心5 min收集菌體，再用已滅絕的DBP無機鹽培養(yǎng)基(pH 7. O)洗滌2次，然后采用DBP無機鹽培養(yǎng)基重懸菌體，調(diào)節(jié)細胞密度至0D_ 1，4°C保存?zhèn)溆谩?2)菌株D8的生長與降解曲線
將菌株D8接種于含400 mg/L DBP的無機鹽培養(yǎng)基中，于35°C、150 r/min和初始pH=7. O的條件下培養(yǎng)，測定細胞的生物量(0D_)和DBP的殘留濃度，結(jié)果如圖I所示菌株D8對DBP的降解與其生長趨勢相一致，表明該菌能利用DBP作為唯一碳源和能源來供給自身生長，并對DBP有良好的降解效果。(Γ8 h，菌液0D_緩慢增加，DBP濃度相應(yīng)下降，此時菌株處于適應(yīng)期；8飛6 h，細菌對DBP的降解作用顯著加強，降解速率加快，同時菌液的吸光值也有明顯的提高，此階段細菌處于對數(shù)生長期，經(jīng)過此階段，大部分DBP被去除；56飛O h，細菌的生長和死亡數(shù)量達到平衡，對DBP的降解速速率也緩慢下降，此階段為穩(wěn)定期；60 h后，DBP已經(jīng)完全被降解，降解率達到100%，細菌處于衰亡期。實施例2 :環(huán)境條件對sp. D8降解能力的影響
I、培養(yǎng)溫度的影響
在pH為7. O、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min和接種量為2 vol %時，溫度對DBP降解的影響如圖2所示在2(T40°C范圍內(nèi)，菌株D8對DBP具有較好的降解效果，表明該菌對溫度有較寬的適應(yīng)范圍。在2(T35°C之間時，隨著溫度的升高，底物的降解率隨之增大；但當(dāng)溫度達到40°C時，菌株D8對底物的降解率反而低于35°C時降解率。表明Elizabethkingia sp. D8的最適溫度為35°C。2、初始pH的影響
在溫度為30°C、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min和接種量為2 vol%時，pH對DBP降解的影響如圖3所示在初始pH為6飛.5條件下，DBP的降解效果比初始pH為7、條件下的差，說明菌株D8適合在中性或偏堿性條件下生長；在？!1=7. O時，菌株D8對底物的降解能力最好，60h時降解率達到64. 66%，表明該菌的最適pH為7. O。3、搖床轉(zhuǎn)速的影響
在pH為7. O、培養(yǎng)溫度為30°C和接種量為2 V01%時，搖床轉(zhuǎn)速對DBP降解的影響如圖4所示菌株D8對DBP的降解速率大小依次為150r/min>200 r/min>100 r/min，其中150r/min時的降解率最高，60 h的降解率達到54. 7%。4、接種量的影響
在pH=7. O、培養(yǎng)溫度30°C和搖床轉(zhuǎn)速150 r/min時，接種量對DBP降解的影響如圖5所示隨著接種量的增大，培養(yǎng)基中活細菌的數(shù)量增多，對底物DBP的降解率也隨之升高。當(dāng)接種量為10 vol%時，24 h以后的降解率卻低于接種量為7 vol %的降解率，表明適宜的接種量為7 vo 1%ο實施例3 Elizabethkingia sp. D8對添加較高濃度DBP的煉油廢水的強化處理 于錐形瓶中，將菌株D8投加到武漢石化的活性污泥中，設(shè)置3組實驗考察其對DBP的 去除效果
(a)30mL的煉油廢水+33mL的DBP無機鹽培養(yǎng)基+400mg/L的DBP+30mL的活性污泥+7 vo 1%的D8菌懸液；
(b)30mL的煉油廢水+33mL的DBP無機鹽培養(yǎng)基+400mg/L的DBP+30mL高壓滅菌后的活性污泥+7 vol %的D8菌懸液；
(c)30mL的煉油廢水+40mL的DBP無機鹽培養(yǎng)基+400mg/L的DBP+30mL的活性污泥。于35°C和150 rpm搖床培養(yǎng)。間隔一定時間，測定培養(yǎng)液中DBP的殘留濃度如圖6所示，結(jié)果表明Elizabethkingia sp. D8的活性污泥對廢水中的DBP降解緩慢,投加Elizabethkingia sp. D8則顯著提高了活性污泥對DBP的降解能力，并在48 h內(nèi)將含約400 mg/L的DBP的煉油廢水中的DBP完全去除。實施例4: Elizabethkingia sp. D8對添加較高濃度DBP的農(nóng)藥廢水的強化處理 于錐形瓶中，將菌株D8投加到農(nóng)藥廢水的活性污泥中，設(shè)置3組實驗考察其對DBP的
去除效果
(a)30mL的農(nóng)藥廢水+33mL的DBP無機鹽培養(yǎng)基+400mg/L的DBP+30mL的活性污泥+7 vo 1%的D8菌懸液；
(b)3OmL的農(nóng)藥廢水+33mL的DBP無機鹽培養(yǎng)基+400mg/L的DBP+30mL高壓滅菌后的活性污泥+7 vol %的D8菌懸液；
(c)30mL的農(nóng)藥廢水+40mL的DBP無機鹽培養(yǎng)基+400mg/L的DBP+30mL的活性污泥。于35°C和150 rpm搖床培養(yǎng)。間隔一定時間，測定培養(yǎng)液中DBP的殘留濃度，結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明菌株D8能較好的與處理農(nóng)藥廢水的活性污泥中的其它菌株共存，并起到了明顯的生物強化效果，在56 h內(nèi)將添加含400 mg/L的DBP農(nóng)藥廢水中的DBP完全去除。實施例5: Elizabethkingia sp. D8對添加較高濃度DBP的啤酒廢水的強化處理 于錐形瓶中，將D8投加到某啤酒廢水的活性污泥中，設(shè)置3組實驗考察其對DBP的去
除效果
(a)30mL的啤酒廠廢水+33mL的DBP無機鹽培養(yǎng)基+400mg/L的DBP+30mL的活性污泥+7 vol %的D8菌懸液；
(b)30mL的啤酒廠廢水+33mL的DBP無機鹽培養(yǎng)基+400mg/L的DBP+30mL高壓滅菌后的活性污泥+7vol %的D8菌懸液；
(c)30mL的啤酒廠廢水+40mL的DBP無機鹽培養(yǎng)基+400mg/L的DBP+30mL的活性污泥。于35°C和150 rpm搖床培養(yǎng)。間隔一定時間測定培養(yǎng)液中DBP的殘留濃度，結(jié)果如圖8所示菌株D8能較好的與處理啤酒廠廢水的活性污泥中的其它菌株共存，并起到了明顯的生物強化效果，在56 h內(nèi)將含約400 mg/L DBP的啤酒廢水中的DBP完全去除。絮施妙\ b .,Elizabethkingia sp. D8對添加較高濃度DBP的焦化廢水的強化處理 于錐形瓶中，將D8投加到某焦化廢水的活性污泥中，設(shè)置3組實驗考察其對DBP的去
除效果
(a)30 mL的焦化廢水+33mL的DBP無機鹽培養(yǎng)基+400mg/L的DBP+30mL的活性污泥+7 vo I %的D8菌懸液；
(b)30mL的焦化廢水+33mL的DBP無機鹽培養(yǎng)基+400mg/L的DBP+30mL高壓滅菌后的活性污泥+7 vol %的D8菌懸液；
(c)30mL的焦化廢水+40mL的DBP無機鹽培養(yǎng)基+400mg/L的DBP+30mL的活性污泥。 于35°C和150 rpm搖床培養(yǎng)。連續(xù)測定培養(yǎng)液中DBP的殘留濃度，結(jié)果如圖9所示菌株D8能較好的與處理焦化廢水的活性污泥中的其它菌株共存，并起到了明顯的生物強化效果，在56 h內(nèi)將含約400 mg/L的DBP的焦化廢水中的DBP完全去除。本具體實施方式
為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合和簡化，均應(yīng)為等效的。本具體實施方式
與現(xiàn)有技術(shù)相比sp. D8能以DBP作為唯一碳源和能源進行生長繁殖，60 h內(nèi)能將無機鹽培養(yǎng)基中400 mg/L的DBP完全降解，并且能與原活性污泥中的土著微生物協(xié)同發(fā)揮高效降解作用，對煉油廢水、農(nóng)藥廢水、啤酒廢水和焦化廢水中的DBP具有良好的生物強化效果，具有良好的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一株鄰苯二甲酸二丁酯降解菌,經(jīng)鑒定為sp,編號為D8,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2012年3月23日，保藏編號為CCTCC N0:M2012088，菌株16S rDNA的GenBank登錄號為JQ673498，其特征在于菌株D8為革蘭氏陰性菌，菌落為黃色，呈圓形，光滑濕潤，邊緣整齊；該菌的產(chǎn)硫化氫試驗、吲哚試驗、淀粉水解試驗、V-P試驗和硝酸鹽還原試驗均為陽性，甲基紅試驗和尿酶測定試驗為陰性，能利用鄰苯二甲酸二丁酯為唯一碳源和能源進行生長繁殖。
2.如權(quán)利要求I所述鄰苯二甲酸二丁酯降解菌的應(yīng)用，其特征在于所述菌株D8用于降解工業(yè)廢水中的鄰苯二甲酸二丁酯。
3.如權(quán)利要求2所述鄰苯二甲酸二丁酯降解菌的應(yīng)用，其特征在于所述工業(yè)廢水為煉油廢水、農(nóng)藥廢水、啤酒廢水和焦化廢水中的一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株鄰苯二甲酸二丁酯降解菌及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的一株鄰苯二甲酸二丁酯降解菌D8屬于Elizabethkingiasp，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2012年3月23日，保藏編號為CCTCCNO:M2012088，菌株16SrDNA的GenBank登錄號為JQ673498。該菌為革蘭氏陰性菌，菌落為黃色，邊緣整齊，呈圓形，光滑濕潤，中心凸起。該菌利用鄰苯二甲酸二丁酯作為唯一碳源和能源進行生長繁殖。該菌純培養(yǎng)時，在60h能將400mg/L的DBP降解完全。菌株D8能耐受濃度高達2000mg/L的DBP，對較高濃度DBP工業(yè)廢水具有優(yōu)良的降解效果，該菌應(yīng)用于煉油廢水、農(nóng)藥廢水、啤酒廢水和焦化廢水的生物強化處理，具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號C02F101/34GK102703347SQ201210165900
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者游海, 王巧鳳, 許龍龍, 顏家保, 魏鑫 申請人:武漢科技大學(xué)