專利名稱：一株抗銅細菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物領域，涉及一株抗銅細菌及其應用。
背景技術：
目前，土壤作為人類賴以生存的生態(tài)環(huán)境的重要組成部分，受重金屬污染日趨嚴 重。全世界平均每年排放Hg約I. 5萬噸，Cu 340萬噸，Pb 500萬噸，Mn 1500萬噸，NilOO 萬噸。我國土壤重金屬污染也相當嚴重，每年釋放到環(huán)境中的有毒重金屬高達數(shù)百萬噸，其 中 Pb 為 34. 6 萬噸，Cd 為 3. 9 萬噸(Nriagu 和 Pacyna, 1988)。土壤中的有害金屬的污染直接影響土壤質(zhì)量、水質(zhì)狀況、作物生長、農(nóng)業(yè)產(chǎn)量及 品質(zhì)等并通過食物鏈富集到人體和動物中，危害人畜健康，引發(fā)人類癌癥和其它疾病等 (Muchuweti等，2006)。例如，Pb的過量攝入會提高齲齒的發(fā)病率，導致貧血、高血壓、神經(jīng) 衰弱、心肌損傷等(Manaham, 1984)。Cd的過量攝入則能抑制人體生長,影響氨基酸脫羧酶、 組氨酸酶、淀粉酶、過氧化氫酶等酶系統(tǒng)的活力，干擾Cu、Co和Zn等微量元素的代謝，引起 一系列疾??；Cd還能與磷強烈結(jié)合使得骨質(zhì)磷酸鈣中的鈣過量排泄，導致骨質(zhì)疏松軟化、 變形、骨折和疼痛，發(fā)生“痛痛病”。另外，土壤的重金屬污染還間接導致生態(tài)環(huán)境的其他組成部分-大氣和水體的污 染。含污染物質(zhì)濃度較高的污染表土容易在風力和水力作用下分別進入到大氣和水體中， 導致大氣污染、地表水和地下水污染以及生態(tài)系統(tǒng)退化等其它次生生態(tài)環(huán)境問題。而且，土壤重金屬污染相比大氣污染和水體污染而言，具有長期性、隱蔽性、不可 逆性、易遷移以及不能完全被分解或消逝的特點，因此危害嚴重、治理困難。如何有效地防 治和解決土壤重金屬污染問題越來越受到世界各國的重視。土壤重金屬污染是一個極為重要的環(huán)境問題，傳統(tǒng)的治理主要采用物理或化學方 法，這些方法費用高、設備復雜，對大面積的污染效果差。與傳統(tǒng)措施相比，植物修復技術 是一種支持可持續(xù)性發(fā)展的環(huán)境修復技術，并以其高效、經(jīng)濟、清潔、美觀等優(yōu)勢解決了環(huán) 境中的持久性污染物問題，占領了世界重金屬污染土壤的修復市場，倍受人們青睞(萬云兵 等，2002 Marques等，2009)。但是隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)超積累植物往往植株矮小、生 物量較低、生長速度慢、生長周期長，而且受到土壤水分、鹽度、酸堿度的影響，對固定態(tài)和 沉淀態(tài)的重金屬不易吸收，難以在實際中應用。傳統(tǒng)的土壤重金屬污染治理主要采用物理或化學方法，這些方法費用高、設備復 雜，對大面積的污染效果差。與傳統(tǒng)措施相比，植物修復技術是一種支持可持續(xù)性發(fā)展的環(huán) 境修復技術，并以其高效、經(jīng)濟、清潔、美觀等優(yōu)勢解決了環(huán)境中的持久性污染物問題，占領 了世界重金屬污染土壤的修復市場，倍受人們青睞(萬云兵等，2002 ;MarqueS等，2009)。但 是隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)超積累植物往往植株矮小、生物量較低、生長速度慢、生長周 期長，而且受到土壤水分、鹽度、酸堿度的影響，對固定態(tài)和沉淀態(tài)的重金屬不易吸收，難以 在實際中應用。土壤細菌是環(huán)境中的一類重要微生物資源，具有分布廣泛、種類繁多、表面積巨大、帶電、繁殖快速和代謝旺盛等特點(Burd等，2000)o細菌在生長過程中會不斷向體外 分泌小分子有機酸、無機酸和大分子物質(zhì)。細菌本身及其產(chǎn)生的各種物質(zhì)廣泛參與水體、 土壤、礦渣和沉積物等環(huán)境中的物理、化學和生物化學反應，改變環(huán)境粘土礦物表面的物理 化學特性，分解礦物或者形成新的礦物等，進而影響多種礦物元素的遷移轉(zhuǎn)化。在重金屬 污染環(huán)境中，細菌種群結(jié)構(gòu)、生理代謝會產(chǎn)生各種變化以響應重金屬的脅迫，其可以通過對 重金屬的吸附富集、氧化還原、成礦沉淀、淋濾、協(xié)同植物吸收等作用修復重金屬污染土壤 (Gadd，2004)。微生物強化植物修復重金屬污染技術是利用與植物共生的真菌、細菌等微生物的 聯(lián)合作用降解污染物，達到修復的目的。目前研究發(fā)現(xiàn)，微生物主要通過促進植物生長，提 高植物的生物量及促進重金屬溶解，提高重金屬的生物有效性兩個方面提高植物修復重金 屬的效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的上述不足，提供一株抗銅細菌。本發(fā)明的另一目的是提供該細菌的應用。一株抗銅細菌DGS6,分類命名為假單胞菌(Pseudomonas sp.),于2010年4月29 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO. 4817。所述的保藏號為CGMCC NO. 4817的假單胞菌DGS6在促進植物生長中的應用。所述的植物優(yōu)選海洲香薷、玉米或油葵。所述的保藏號為CGMCC NO. 4817的假單胞菌DGS6在修復銅污染土壤中的應用。有益效果本發(fā)明采用傳統(tǒng)的微生物分離、純化方法，從Cu污染土壤中分離、篩選得到一株 抗高濃度Cu的細菌菌株DGS6 (CGMCC NO. 4817)。實驗結(jié)果表明，DGS6 (CGMCC NO. 4817) 不僅能夠溶解液體培養(yǎng)基中不溶性碳酸銅，而且能活化土壤中的Cu。根的伸長試驗表明， DGS6 (CGMCC NO. 4817)能夠有效的促進海洲香薷、玉米和油葵根系的伸長生長。盆栽實驗 表明DGS6 (CGMCC NO. 4817)能夠促進植物的生長，提高植物的生物量。實驗結(jié)果顯示與 對照相比，接入DGS6 (CGMCCN0. 4817)后，玉米的地上部和根系干重分別增加了 49%、35%，油 葵增加85%、42%。盡管該菌株對玉米和油葵體內(nèi)Cu含量沒有影響，但是能夠提高玉米與油 葵Cu吸收總量，從而達到提高植物修復效率的目的。


圖I菌株DGS6生長曲線。圖2DGS6在平板上的菌落形態(tài)。圖3接菌處理對Cu污染土壤中Cu可溶性的影響。圖4DGS6 (CGMCC NO. 4817)對不同Cu化合物的溶解試驗。圖OTGS6 (CGMCC NO. 4817)對海州香薷(A)、玉米(B)和油葵(C)根系伸長的影響 (圖中數(shù)據(jù)柱上所標字母a，b, c如相同，則表示兩個值在P < 0. 05水平上沒有差異;字母不 同，則表示兩個值在P < 0. 05水平上有顯著差異)。圖6不同處理下玉米和油葵的生物量，A :玉米地上部，B :油葵地上部，C :玉米根系，D :油葵根系(圖中數(shù)據(jù)柱上所標字母a，b如相同，則表示兩個值在P < 0. 05水平上沒有 差異；字母不同，則表示兩個值在P < 0. 05水平上有顯著差異)。生物材料保藏信息DGS6,分類命名為假單胞菌(Pseudomonas sp),保藏于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物 研究所，保藏號為CGMCC N0. 4817，保藏日期為2010年4月29日。
具體實施例方式實施例11. 1菌株分離純化土樣采自南京市湯山鎮(zhèn)伏牛山銅礦尾菜園土和安基山尾礦土、銅陵鳳凰山和銅官 山尾礦土的植物根際土。在一周內(nèi)將土樣采用稀釋平板涂布法(沈萍等，1999)和平板劃線 法進行菌株分離、純化。部分土樣風干保存，以進行土樣養(yǎng)分和重金屬元素分析，主要測定 土壤中水溶態(tài)Cu、可交換態(tài)Cu和總Cu含量。菌株分離純化的具體步驟如下( 1)倒平板將有氮培養(yǎng)基配制好，混合均勻，高壓蒸汽滅菌后倒平板。有氮培養(yǎng)基 配方為蔗糖 10g，(NH4)2S041. 0g，K2HP042. 0g，MgS04 7H20 0. 5g，NaCl 0. lg，酵母膏 0. 5g， 蒸餾水lOOOmL, pH值7. 2，瓊脂15g。(2)制備土壤稀釋液取lg 土樣放入盛99mL無菌水并裝有玻璃株的三角瓶中，置于 恒溫搖床中振蕩20min后，依次制成10_2、10_3、10_4、10_5等濃度的土壤稀釋液。(3)涂布取0. lmL不同濃度的土壤稀釋液分別涂布于固體有氮培養(yǎng)基上，每個濃 度分別設置三個重復。(4)培養(yǎng)將平板倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后進行菌落觀察和計數(shù)。(5)挑單菌落挑選適合稀釋度的平板(單菌落約幾個到30個)，選擇菌落清晰、生長 飽滿且形態(tài)不同的細菌菌落。(6)劃線純化將所選擇的不同單菌落在含銅的固體有氮培養(yǎng)基平板(Cu2+濃度 10mg L_S Cu2+在配制有氮培養(yǎng)基時以CuS04形式加入)上進行劃線，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)。(7)鏡檢將培養(yǎng)好的菌株進行簡單染色后鏡檢，觀察其是否已被純化。假如還含有 雜菌，則需繼續(xù)劃線分離采用稀釋平板涂布法和平板劃線法從采集于安徽銅陵鳳凰山、銅官山尾礦，南京 市湯山鎮(zhèn)伏牛山和安基山尾礦的Cu污染土壤和污染礦區(qū)植物根系樣品中分離得到形態(tài)不 同的細菌100多株。1. 2菌株對Cu的抗性(初篩)將分離所得到的菌株依次轉(zhuǎn)接到Cu濃度分別為20、30、50和100mg七1的固體有 氮培養(yǎng)基平板中(Cu2+在配制有氮培養(yǎng)基時以CuS04B式加入)，每組設置三個重復。將菌株 接種到含Cu培養(yǎng)基上后，大部分菌株因Cu的毒害作用無法生存。其中26株細菌對Cu的 抗性較強，能在含Cu量為100mg r1的固體平板上生長。將這些分離得到的Cu抗性約為 100mg L—1的菌株轉(zhuǎn)接到有氮培養(yǎng)基斜面中，4°C保存，用于后續(xù)試驗。1. 3抗Cu菌株對培養(yǎng)基中不溶性Cu的活化效果(復篩)
將細菌轉(zhuǎn)接到含難溶性Cu的液體有氮培養(yǎng)基中(總Cu濃度為200mg噸' Cu以沉 淀態(tài)的碳酸銅形式加入并混合均勻，有氮培養(yǎng)基配方(不加瓊脂)鹿糖I0g，(NH4)2S041. 0g， K2HP042. Og, MgS04 7H20 0. 5g, NaCl 0. lg，酵母膏 0. 5g，蒸餾水 lOOOmL, pH 值 7. 2。將細菌轉(zhuǎn)接到含難溶性Cu的液體有氮培養(yǎng)基中后，30°C，搖床中培養(yǎng)60h后， 10000r mirT1離心5min，測定上清液中的Cu含量及溶液pH值。與對照組相比，若溶液中 Cu含量升高，則說明所接菌株對難溶性Cu具有活化作用，Cu濃度越高說明活化效果越明 顯?？广~菌株對培養(yǎng)液中難溶性Cu的活化實驗結(jié)果表明，菌株SM2和DGS6能夠活化 培養(yǎng)液中部分沉淀態(tài)的Cu，與不接菌的對照相比，菌種SM2和DGS6使培養(yǎng)液中的Cu2+濃度 增加了 65%和72%。將菌株DGS6送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保 藏，保藏號為CGMCC N0. 4817。1. 4供試菌株生長曲線測定將菌株DGS6 (CGMCC N0. 4817)接種于有氮液體培養(yǎng)基中活化16h，取出2mL轉(zhuǎn)入盛 有100mL的有氮液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，三角瓶置于28°C搖床中振蕩(150r ^化―1)。 以未接種的有氮培養(yǎng)液作為空白對照，選擇600nm的波長，用紫外分光光度計測定不同培 養(yǎng)時間細菌懸浮液的0D6(l(lmi值，以0D6(l(lmi值為縱坐標、生長時間作橫坐標，繪制細菌的生長 曲線。如圖1所示，在有氮培養(yǎng)基中，以2%的接種量接入菌株時，DGS6 (CGMCC N0. 4817) 生長快速，延滯期很短，大約4h后就開始進入對數(shù)生長期，16h左右達到最高菌體濃度。1. 5菌株DGS6的菌體、菌落形態(tài)和生理生化特性菌株的菌落、菌體特征和生理生化特性是細菌鑒定的重要形態(tài)指標和生理指 標。DGS6(CGMCC NO. 4817)在有氮培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和顯微鏡下的菌體特征見圖2， DGS6 (CGMCC N0. 4817)為革蘭氏染色陰性菌，桿狀，有鞭毛，菌落為圓形，邊緣整齊，乳白色， 表面光滑、較平坦，有光澤。培養(yǎng)24h左右，菌落周圍形成乳白色混濁環(huán)，在斜射日光下或白 熾燈下可見。能水解淀粉，能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，氧化酶陽性，可以液化明膠。1. 6菌株鑒定采用SDS高鹽沉淀法提取菌體總DNA (Miller等，1988)。將提取的基因組DNA 稀釋十倍后，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測其質(zhì)量發(fā)現(xiàn)，所提取的基因組DNA濃度較高，純度較好，基 本上沒有RNA雜帶，稀釋十倍后溶液中DNA濃度大約為50ng y L'將原DNA溶液稀釋 100倍后，作為PCR擴增的模板DNA，進行16S rDNA的PCR擴增。擴增菌體16S rDNA的 引物為5 '端引物為 5 ' - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ' (SEQ ID NO. 1)，3 '端引物為 5' - TACCTTGTTACGACTT - 3' (SEQ ID N0. 2)。擴增反應體系為dNTP (20mmol .I71) 5 y L， lOXTaq聚合酶反應緩沖液5iiL，5 '端引物(25pmol ii L_0 2 ii L，3 '端引物 (25pmol u L :) 2 u L, Mg2+ (25mmol L 0 6 u L,菌體 DNA (約 50ng u L :) 1 u L, TaqDNA 聚合酶0. 5iiL (5U u L_1),H20 28. 5 L，反應體系總體積50ii L。反應條件為94°C，30s， 50°C，30s，72°C，lmin，32個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。結(jié)果獲得一條清晰的條帶，將該條 帶切膠回收后，直接送上海英駿生物技術有限公司測序。將DGS6(CGMCCNO. 4817)的 16S rDNA序列與Blast 得到的相似性較高的 16S rDNA 序列與其生理生化分類接近的屬的模式菌株的16S rDNA序列進行聚類分析，從16S rDNA聚類結(jié)果來看，DGS6 (CGMCC N0. 4817)屬于假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)。 實施例2菌株DGS6對Cu的活化作用2. 1 土樣采集土樣采自南京市湯山鎮(zhèn)伏牛山銅礦附近受污染的菜園中，土樣風干后，去除石頭 顆粒、植物根系等，過2_篩。以進行土樣養(yǎng)分和重金屬元素分析，主要測定土壤中水溶態(tài) Cu、可交換態(tài)Cu等。部分樣品在瑪瑙研缽中磨細，過100目篩用于總Cu含量測定。2. 2供試菌株對土壤中Cu的活化試驗50mL離心管中分別裝入滅菌、不滅菌處理的供試土壤3. 00g。供試菌株在液體有 氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h后，取對數(shù)生長期的DGS6菌液(CGMCC N0. 4817) 3. OmL倒入7mL離心 管中10000r mirT1離心3min，倒去上清，加無菌水清洗菌體2次。將清洗后的菌體加入裝 土樣離心管中，加入無菌的去離子水作為空白對照，每個處理設3個重復。將離心管置于搖 床中28°C、200r .mirT1振蕩24h，10000r mirT1離心lOmin，倒出上清液測定Cu2+含量及溶 液pH值。如圖3所示，在銅污染土壤中加入DGS6菌懸液處理后，顯著提高上清液中的Cu2+ 含量。但是隨DGS6(CGMCCN0. 4817)處理時間的延長，上清液中的Cu2+含量顯著減少。接菌 后，滅菌土壤中銅的活化效果要好于非滅菌土壤，其原因主要是非滅菌土壤中存在一定量 的土著微生物，接菌后，接入的供試菌株與已高度適應該土壤的土著微生物競爭，只有在供 試菌株具有高度競爭性的情況下，該菌株才能生存甚至變?yōu)閮?yōu)勢菌群。所以菌株在非滅菌 土壤中的生存能力一般低于滅菌土，導致活化效果也低于滅菌土。2. 3供試菌株對培養(yǎng)液中不同含銅化合物的活化作用在100mL有氮培養(yǎng)基中分別加入不同的含銅化合物(碳酸銅、氫氧化銅、草酸銅)。 使最終Cu濃度為100mg .L-1。假單胞菌屬DGS6 (CGMCC N0. 4817)預培養(yǎng)16h后，調(diào)節(jié)0D_ 值為0. 5，以4%的接種量接入培養(yǎng)基中。28°C,200r mirT1培養(yǎng)48h。10000r mirT1離心 lOmin，測定上清液Cu2+濃度及pH值。菌株對不同形態(tài)的Cu化合物的活化能力是不同的，由圖4可見，與對照相比， DGS6(CGMCCN0. 4817)對碳酸銅的活化能力較強。即土壤中重金屬的形態(tài)分布不同，菌株對 土壤中的重金屬的活化能力也會不一樣。實施例3菌株對植物生長和吸收Cu的影響3. 1菌株DGS6對海洲香薷、玉米和油葵根系伸長的影響將菌株DGS6 (CGMCC N0. 4817)在有氮培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，將純培養(yǎng)物進行4 °C 離心，棄去上清，無菌水洗滌兩次后，重懸浮于無菌水中，在600nm處調(diào)整菌懸液光密度 為0.5±0.02。將海洲香薷、玉米、油葵種子浸于70%酒精中l(wèi)min，再用1%次氯酸鈉消毒 lOmin，立即用無菌水充分洗滌5次以上。室溫下將種子置于菌懸液或無菌水中浸泡3h后， 再放置于培養(yǎng)皿中用無菌水、Cu溶液或菌液濕潤過的濾紙上，稍微傾斜(防止水淹及種子) 放置于28°C恒溫箱中，暗培養(yǎng)4d后測定根長(Belimov等，2001)。每皿20粒飽滿種子(海 洲香薷種子可多放些)，每個處理設置4個重復。由圖5可見，在無Cu毒害情況下，與不接種的對照相比，接種DGS6 (CGMCC N0. 4817)能夠明顯促進海洲香薷、玉米和油葵根系的伸長生長。根系是受重金屬影響最敏 感的部位。5mg -L^Cu處理下，與無菌對照相比，接種DGS6 (CGMCC N0. 4817)能夠降低Cu對海洲香薷和玉米根系伸長的抑制作用，但對油葵根系伸長無顯著緩解效果。3. 2菌株對盆栽玉米和油葵的生長和吸收金屬的影響3. 2. 1 土樣采集所用土壤是采自中國江蘇省南京市湯山鎮(zhèn)伏牛山銅礦(32° 03' N，118° 47' E) 附近的菜園表層0-15cm的土。該土的主要重金屬污染物為Cu。土壤中的水提態(tài)Cu含量為 0. 29mg kg—1，醋酸銨提取態(tài)Cu含量為2. 83mg kg—1，總Cu含量達1230mg kg-1 (見表1)， 嚴重超過國家二級標準。土壤其它理化性質(zhì)見表1。土樣風干、混勻后過2mm篩。以KH2P04的形式加入P (80mg P kg4風干土樣)和 K (lOOmg K kg—1風干土樣)到土樣中(Shen等，2002)。施肥過后，對土樣進行多個的干 濕循環(huán)，平衡大約40d后，按標準方法取少量土樣研磨，用于下一步的分析。土壤基本理 化性質(zhì)測定參考土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法(中國土壤學會，2000)測定。其中土壤pH值采用 O.Olmol L_1CaCl2(pH 6.0)浸提(土 :水=1 5)，用pH計測定。土壤質(zhì)地采用比重計法測 定，陽離子交換量(CEC)采用醋酸銨(pH 7. 0)交換法，有機質(zhì)含量采用重鉻酸鉀容重法測 定，全氮含量采用半微量凱氏法。土壤生物有效態(tài)重金屬含量采用醋酸銨提取法，即稱5. 0g 土壤樣品(<2mm)于50mL塑料瓶中，加25mL lmol I71的醋酸銨,經(jīng)恒溫(25°C )水浴搖床 水平振蕩(120r取出后，放在桌面上靜置10 - 15min，過濾取上清液，用原子吸收 分光光度計測定濾液中Cu的含量。土壤重金屬總量采用圓03與11(104 (V V=4 1)的 混合液消解法。稱2. 0g 土壤樣品(孔徑小于2mm)用10mL去離子水在室溫下水平振蕩2h， 離心，取上清液，測定土壤中水提取態(tài)Cu含量(魯如坤，2000)。表1.供試土壤的理化性質(zhì)
權利要求
1.抗銅細菌DGS6，分類命名為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，于2010年4月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO. 4817。
2.權利要求I所述的保藏號為CGMCCNO. 4817的抗銅細菌DGS6在促進植物生長中的應用。
3.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于所述的植物是海洲香薷、玉米或油葵。
4.權利要求I所述的保藏號為CGMCCNO. 4817的抗銅細菌DGS6在修復銅污染土壤中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株抗銅細菌及其應用。抗銅細菌DGS6，于2010年4月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.4817。菌株DGS6不僅能夠溶解液體培養(yǎng)基中不溶性碳酸銅，而且能活化土壤中的Cu。菌株DGS6能夠有效的促進海洲香薷、玉米和油葵根系的伸長生長。盆栽實驗表明DGS6能夠促進植物的生長，提高植物的生物量。實驗結(jié)果顯示與對照相比，接入菌株DGS6后，玉米的地上部和根系干重分別增加了49%、35%，油葵增加85%、42%。因此保藏號為CGMCC NO.4817的假單胞菌DGS6能在促進植物生長中應用。
文檔編號B09C1/10GK102660485SQ20121015780
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月18日 優(yōu)先權日2012年5月18日
發(fā)明者夏妍, 楊仁秀, 沈振國, 王桂萍, 陳亞華 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學