專利名稱：一株應(yīng)用于城市污泥生物瀝浸處理的耐酸性異養(yǎng)菌d13的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株應(yīng)用于城市污泥生物浙浸處理的耐酸性異養(yǎng)菌D13，是一項利用異養(yǎng)菌與自養(yǎng)菌互作進行污泥生物浙浸處理的技術(shù)，屬于環(huán)境工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國每年產(chǎn)生大量的、亟待處置的各類城市污泥和工業(yè)污泥等。目前僅城市污泥每年就產(chǎn)生約700萬噸(干物質(zhì)計)，工業(yè)污泥的數(shù)量也十分巨大，污泥處理處置運行成本在污水處理廠中占到30% -50%，而且這些污泥在我國目前都沒有很好的處置途徑。一方面污泥難濃縮脫水，且脫水污泥含水量很高(多數(shù)在80% -85% )，因此影響到諸如焚燒、填埋等處置，若采用堆肥方法，則需要大量的調(diào)理劑調(diào)節(jié)水分，十分不便。另一方面雖然污泥土地利用多年來一直被認(rèn)為是處置費用低廉，并能實現(xiàn)污泥資源化利用的途徑，但由于許多污泥都存在濃度不等種類不同的有毒重金屬(特別是在我國許多工業(yè)園區(qū)的城市污水處理廠或接納部分工業(yè)廢水的城市污水處理廠，以及一些工業(yè)企業(yè)污水處理廠所產(chǎn)生的污泥尤其較多)，因此，在很大程度上制約了污泥的土地利用。因此，實現(xiàn)污泥高干度脫水和從污泥中去除重金屬，是實現(xiàn)污泥合理處置和資源化利用的重要前提，也是化解污泥處置難題的重要技術(shù)措施。近年來，研究發(fā)現(xiàn)利用生物浙浸技術(shù)(Bioleaching，以前也稱為生物淋濾或生物浙濾)預(yù)處理液態(tài)污泥具有促進污泥脫水和溶出重金屬的功效。本課題組自1998年開始已將該技術(shù)逐漸從實驗室小試推動到生產(chǎn)性試驗，現(xiàn)日處理污泥100多噸，相當(dāng)于一個日處理5萬噸污水的城市污水處理廠所產(chǎn)生的污泥，技術(shù)與規(guī)模已處于國際領(lǐng)先地位。本課題組曾公開了兩種高效作用于污泥的自養(yǎng)型生物浙浸微生物的專利 (ZL02112924. X，ZL02137921. 1)，即嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌LX5和氧化硫硫桿菌TS6。但在實際運行中，效果不穩(wěn)定，尤其在長期處理時微生物活性會變低。這是因為氧化亞鐵硫桿菌和氧化硫硫桿菌都是專性化能自養(yǎng)菌，對水溶性有機物有一定的敏感性，而污泥中水溶性有機物含量往往超過了它的致毒水平。因此，在以單一的硫桿菌為主導(dǎo)的系統(tǒng)中，往往難于保證效果的穩(wěn)定。隨后，本課題組于2004年5月31日發(fā)明了一種耐酸性紅酵母菌及其用于污泥中重金屬的生物脫除的方法的專利(ZL200410044843. 8)，通過在污泥中同時接種以水溶性有機物為能量來源和碳源的紅酵母菌R30，以大幅度降低這些有毒的小分子在污泥中的濃度，大大提高了硫桿菌在污泥生物浙浸中的活性，使污泥生物浙浸處理效率和穩(wěn)定性得到進一步提高。這說明在污泥生物浙浸系統(tǒng)中，耐酸性異養(yǎng)菌的加入是非常有益的。但 R30菌株最多只能在pH3的酸性環(huán)境下才能正常生長，因此，當(dāng)生物浙浸系統(tǒng)PH小于3時會對該菌有抑制，會影響其穩(wěn)定性。尋找更高效的耐更低PH的異養(yǎng)菌，使污泥生物浙浸系統(tǒng)的微生物多樣性更豐富，必然有利于系統(tǒng)的穩(wěn)定，對生物浙浸的工程化應(yīng)用非常重要。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種耐酸性異養(yǎng)菌以消除污泥生物浙浸處理中對硫桿菌生長有影響的小分子有機物，并能為硫桿菌生長提供更豐富的可溶性二氧化碳 (自養(yǎng)菌的碳源)，從而提高生物浙浸效率和長期運行的穩(wěn)定性。技術(shù)方案下面為本發(fā)明的主要內(nèi)容本發(fā)明提供的一株在污泥生物浙浸中耐酸性的異養(yǎng)菌菌株D13，分離自生物浙浸酸化污泥，經(jīng)過鑒定確認(rèn)為畢赤酵母(Pichia spartinae)D130該菌株于2009年4月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(中國科學(xué)院微生物研究所，中國北京)，其保藏編號為CGMCC No. 3035。菌株經(jīng)PCR擴增后，其^S rRNA序列在GenBank的登錄號為FJ850047。上述菌株D13經(jīng)鑒定，具有如下生物學(xué)特征(1)菌株的形態(tài)特征單細(xì)胞呈卵圓形，直徑4. 5 5.5 μ m，一端芽殖，不產(chǎn)生子囊孢子，缺氧條件下生長可形成假菌絲，有莢膜。菌落菌落呈粘質(zhì)樣，白色，表面褶皺，邊緣整齊，液體培養(yǎng)渾濁，沉淀物疏松。(2)菌株的生理生化特征該菌株在25 35°C條件下生長良好，易于常溫下培養(yǎng)， 其最適生長溫度為30°C。在pHl 9均能生長，最適pH為2 5. 5，當(dāng)pH > 5. 5時生長受到一定影響，當(dāng)pH < 2時生長受較大抑制。試驗發(fā)現(xiàn)在污泥生物浙浸的后期pH達到2. 0 1. 5時，仍能夠檢測到菌株D13，說明它對酸性環(huán)境的耐受能力很強。菌株D13能發(fā)酵葡萄糖而不發(fā)酵乳糖和蔗糖，能同化KNO3和(NH4) 2S04，不能利用肌醇作為唯一碳源，不形成類淀粉化合物，脲酶測試和DBB測試均成陰性。(3)菌株的分子生物鑒定結(jié)果菌株rRNA的D1/D2區(qū)共測出611個堿基對，在核酸數(shù)據(jù)庫 GenBank(NCBI) (http//www. ncbi. nlm. nih. gov/)登錄號為 FJ850047。 26SrRNA的序列如下gcatatcaat aagcggagga aaagaaac ca acagggattg ccttagtaac ggcgagtgaagcggcaaaag ctcaaatttg aaatctggca tcttcggtgt ccgagttgta atttgaagaa ggtaactttggagttggctc ttgtctatgt tccttggaac aggacgtcac agagggtgag aatcccgtgc gatgagatgccaattctatg taaagtgctt tcgaagagtc gagttgtttg ggaatgcagc tctaagtggg tggtaaattccatctaaagc taaatattgg cgagagaccg atagcgaaca agtacagtga tggaaagatg aaaagaactttgaaaagaga gtgaaaaagt acgtgaaatt gttgaaaggg aagggtttaa gatcagactt ggtattttgtatggcttcct ttcggggtgg tcctctacgt tttaccgggc tagcatcagt ttggatggta ggataatggcattggaatgt gacattgctt cggtgatgtg ttatagcctt tgttgatact gcctatctag actgaggactgcgtctttga ctaggatgct ggcataatga tcttcaaccg cccgtcttga aacacggaac a菌株D13與畢赤酵母(Pichia spartinae)相似性最高，同源性達到99%以上，因此，鑒定為畢赤酵母D13。有益效果該菌株與已有的同類菌株相比具有明顯優(yōu)點在污泥生物浙浸系統(tǒng)中，能耐受pHl的酸性環(huán)境，在pH2時能很好生長，因此，在生物浙浸中能保持較長久的活力而不需要經(jīng)常添加。該菌能快速利用污泥生物浙浸系統(tǒng)中溶解性有機物(DOM)，消除DOM對硫桿菌的該菌在利用污泥中DOM或小分子有機酸時，會迅速產(chǎn)生較高濃度的溶解性CO2，大
4大促進以(X)2為碳源的硫桿菌生長。因此，在污泥生物浙浸中，接種畢赤酵母D13可使污泥生物浙浸時間縮短到2天， 處理后污泥脫水性提高10多倍，重金屬溶出率達到90%左右，具有明顯的促進作用。
四具體實施方式
下面敘述本發(fā)明的實施例。1、菌株D13的分離與擴大培養(yǎng)配制PDA培養(yǎng)基，成分馬鈴薯200g，蔗糖或葡萄糖20g，水lOOOmL，pH自然， 12rC,30min滅菌。用于分離耐酸性異養(yǎng)菌的樣品取自于先前完成的城市污泥生物浙浸處理后的酸化污泥(PH值為2.0左右)。用接種環(huán)取酸化污泥液一環(huán)，在PDA平板上劃線分離，將上述接種污泥懸液的平板于下倒置培養(yǎng)3 4d，至生長出菌落。在PDA平板上分離生長較好的有代表性的單菌落做涂布鏡檢，若有不純，則進一步挑取此菌落反復(fù)劃線， 直至獲得目的菌株的純菌，并轉(zhuǎn)移斜面保存?zhèn)溆?。液體培養(yǎng)條件從斜面上取D13菌苔，接種于PDA液體培養(yǎng)基中，28-300C，于ISOrpm往復(fù)式搖床培養(yǎng)2天，菌數(shù)達IO8個/mL。形態(tài)觀察和顯微鏡檢發(fā)現(xiàn)，該菌株單細(xì)胞呈卵圓形，直徑4. 5 5. 5 μ m，一端芽殖，不產(chǎn)生子囊孢子，缺氧條件下生長可形成假菌絲，有莢膜。菌落菌落呈粘質(zhì)樣，白色，表面褶皺，邊緣整齊。菌株進一步經(jīng)生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定后確定為畢赤酵母D13。2、D13最適生長的pH測定將一定體積的PDA液體培養(yǎng)基按照每瓶50mL分裝于一系列250mL三角瓶中。用 4NH2S04將培養(yǎng)基pH值分別調(diào)節(jié)至1. 0，1. 5，2. 0，3. 0，4. 0，5. 0，6. 0和7. 0的8個梯度，隨后于121°C下滅菌15min。待冷卻后分別取一環(huán)畢赤酵母D13斜面菌苔接種于上述培養(yǎng)基中，置于轉(zhuǎn)速為180r/min搖床中恒溫培養(yǎng)36h。酵母菌的生長用培養(yǎng)液在600nm處的吸光值(OD)來表征，每個pH處理均設(shè)3個重復(fù)，結(jié)果見表1。表1畢赤酵母D13在不同pH培養(yǎng)基中生長狀況
PH1.01.52.03.04.05.06.07.08.09.0OD0. 1230. 6202. 1232. 1912. 1942.221.6231.621.6081.601結(jié)果表明，畢赤酵母D13能耐受pH 1. 0的極端酸性環(huán)境，在該環(huán)境下仍有少量的生長。當(dāng)PH達到2.0時，該菌就能很好生長，但到pH大于6.0時，生長受影響。目前能在如此低的PH下生長的異養(yǎng)菌并不多見。先前報道的專利(ZL200410044843. 8)涉及的紅酵母R30，僅在pH 3.0或以上才能很好生長。3、D13對污泥DOM的利用及在生物浙浸溶液中(X)2濃度的測定取5L污泥DOM (預(yù)先調(diào)節(jié)pH為5)，高溫濕熱滅菌后，冷卻，接種酵母菌D13菌苔一環(huán)，置于7L的生物發(fā)酵罐中，于下培養(yǎng)48h。并設(shè)置不接種酵母菌D13的對照處理， 其他條件完全相同。用TOC儀測定發(fā)酵前后DOM濃度變化，用溶液CO2探頭測定溶液中CO2 濃度，結(jié)果見表2。 表2畢赤酵母對污泥DOM的利用率及溶液中(X)2濃度
DOM利用率(％)溶液CO2濃度(mg/L)接種D13831.05對照處理2.30.30
結(jié)果表明，D13在4 內(nèi)對污泥在DOM的利用率高達83%，而對照處理僅不到3%， 說明D13可通過利用DOM而迅速將其分解，從而減少了 DOM對硫桿菌的毒害。如此同時，D13 在利用DOM時可產(chǎn)生大量的CO2,因此又促進了以(X)2為碳源的硫桿菌的生長。4、D13在污泥生物浙浸中的作用效果硫桿菌HiicAaciIlus sp.，主要為本實驗室分離的菌株ThicAacillus thiooxidans TS6 (CGMCC NO. 0759)。在本課題組發(fā)明的生物反應(yīng)器(專利號 ZL200520072316. 8)中加入含水率為97%的液態(tài)城市污泥20L和0. 3 10g/L單質(zhì)硫，并接種3% 7%的硫桿菌，于下，進行馴化培養(yǎng)，至污泥pH約為3時正式開始進行試驗。 此時，采用連續(xù)進泥，連續(xù)排泥方式處理，即泵入新的城市污泥，并同時按一天處理污泥重量的5%—次性接種D13液體發(fā)酵菌液(以后不在添加)，污泥停留時間(SRT)為2天，穩(wěn)定運行1周后，采集排出的生物浙浸處理污泥，測定重金屬(Cu，Zn, Cd，Cr)溶出率和污泥脫水性能，同時做不加D13的對照處理，污泥脫水性能采用測定污泥比阻(Y )來衡量，比阻值越大污泥越難脫水，測定結(jié)果見表3。表3在接種與不接種D13的情況下污泥生物浙浸處理效果效果
權(quán)利要求
1.一株應(yīng)用于城市污泥生物浙浸處理的耐酸性異養(yǎng)菌D13，命名畢赤酵母 D13 (Pichiaspartinae D13)，2009年4月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 3035。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用于城市污泥生物浙浸處理的耐酸性異養(yǎng)菌D13，其特征在于所述的畢赤酵母D13可在pH = 2的極端酸性環(huán)境中正常生長。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用于城市污泥生物浙浸處理的耐酸性異養(yǎng)菌D13，其特征在于所述的畢赤酵母D13的GenBank注冊號為FJ850047，它的^S rRNA序列如下gcatatcaat aagcggagga aaagaaacca acagggattg ccttagtaac ggcgagtgaa gcggcaaaagctcaaatttg aaatctggca tcttcggtgt ccgagttgta atttgaagaa ggtaactttg gagttggctcttgtctatgt tccttggaac aggacgtcac agagggtgag aatcccgtgc gatgagatgc caattctatgtaaagtgctt tcgaagagtc gagttgtttg ggaatgcagc tctaagtggg tggtaaattc catctaaagctaaatattgg cgagagaccg atagcgaaca agtacagtga tggaaagatg aaaagaactt tgaaaagagagtgaaaaagt acgtgaaatt gttgaaaggg aagggtttaa gatcagactt ggtattttgt atggcttcctttcggggtgg tcctctacgt tttaccgggc tagcatcagt ttggatggta ggataatggc attggaatgtgacattgctt cggtgatgtg ttatagcctt tgttgatact gcctatctag actgaggact gcgtctttgactaggatgct ggcataatga tcttcaaccg cccgtcttga aacacggaac 已。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用于城市污泥生物浙浸處理的耐酸性異養(yǎng)菌D13，其特征在于所述的畢赤酵母D13接種在污泥生物浙浸系統(tǒng)中反應(yīng)2天可使污泥脫水性提高10倍以上，重金屬溶出率提高到90%以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株應(yīng)用于城市污泥生物瀝浸處理的耐酸性異養(yǎng)菌D13，屬于環(huán)境工程技術(shù)領(lǐng)域。該菌株單細(xì)胞呈卵圓形，直徑4.5～5.5μm，一端芽殖，不產(chǎn)生子囊孢子，有莢膜。菌落菌落呈粘質(zhì)樣，白色，表面褶皺，邊緣整齊，能在pH＝2的極端酸性環(huán)境下正常生長，經(jīng)形態(tài)、生理生化特性以及分子生物學(xué)鑒定，該菌株屬于畢赤酵母菌(Pichia spartinae)，保藏編號為CGMCC No.3035。該菌株在污泥生物瀝浸環(huán)境中可快速利用污泥中水溶性小分子有機物或簡單有機酸作碳源和能源，并使生物瀝浸溶液中CO2大幅升高，從而促進了污泥生物瀝浸效率，使污泥重金屬脫出率達到90％以上，污泥脫水性提高10多倍。
文檔編號C02F11/02GK102250779SQ20111015871
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月14日
發(fā)明者周立祥, 鄭冠宇 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)