專利名稱：高堿性紡織工業(yè)廢水的生物中和的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及細菌分離株-庫特氏菌(Kurthia sp..)(MTCC 5181)，保藏在布達佩斯條約認可的IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度。更具體地，本發(fā)明涉及制備細菌分離株-庫特氏菌(MTCC 5181)的方法，所述菌株用于中和紡織工業(yè)的堿性廢水(pH-12.00-11.5)，并且保藏在布達佩斯條約認可得國際保藏機構IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度。本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明的細菌分離株中和高堿性紡織工業(yè)廢水的方法。
背景和現(xiàn)有技術嚴格的法律和權威機構頻繁的檢查反映了目前社會對環(huán)境的日益關注。因此，例如，當排除到接收水道或污水系統(tǒng)中時，最低限度僅允許工業(yè)如紡織工業(yè)廢水的pH偏離中性點。
取決于應用，可獲得各種化學品來中和高堿性的紡織工業(yè)廢水。在多數(shù)情形中，使用硫酸(H2SO4)。終端使用者必須考慮使用的濃度，必須仔細分析涉及的所有化學反應，必須閱讀制造商的警示和說明，并且必須考慮關于危險液體的公共安全措施。
用化學品處理廢水的方法包括使用酸或堿，或加入廢水中時能夠形成酸或堿的物質。取決于應用，可獲得各種化學品用于工業(yè)中和，不論是中和酸性溶液或堿性溶液。
用于酸性或堿性中和的最常使用的中和化學品是98％硫酸和50％氫氧化鈉。在很多情形中，它們是非常好的選擇，然而，在選擇化學品時需要進行許多考慮，并且它們可能并非常常是最佳選擇。選擇用于中和酸或堿的化學品常常與設計中和體系一樣重要。下面列出了一些選擇化學品考慮的重點·健康和安全性。
·成本和便利性。
·中和化學品的物理性能。
·存儲環(huán)境。
化學品選擇標準的一個說明如下健康和安全性混合化學品可導致極度的危險/有害反應。例如，向具有氰化物的溶液中添加酸導致釋放致死的HCN氣體。
成本和便利性大多數(shù)應用中酸和堿發(fā)揮作用。例如，硫酸(H2SO4)是低成本的，并且比硝酸更有效。在評估成本時濃度也是一個重要的考慮因素。例如，可以接近0％-98％的濃度范圍來購買H2SO4。濃度越高，通?；ㄙM越小。
物理性能必須仔細考慮所選擇試劑的物理性能。例如，50％氫氧化鈉(NaOH)在低于60的溫度下開始結冰。將濃度降低至25％完全消除了這一顧慮。例如，鹽酸(HCl)嚴重除氣(out gasses)。該氣體非常具有腐蝕性，并且侵蝕所有金屬物品。因此，如果使用HCl，必須是適當通風，或在氣體可容易消散的室外使用。
存儲環(huán)境關注存儲問題如罐的類型和可利用的次級污染，操作者對處理危險化學品的熟練度，再填滿存儲容器或從大容積罐中轉移程序的危險性。
最常使用的中和化學品如下·酸硫酸，鹽酸，硝酸，磷酸和在水中形成碳酸的二氧化碳。
·堿氫氧化鈉(苛性鈉)，氫氧化鈣，碳酸鈣(石灰或石灰石)，氫氧化銨。
用酸中和世界上最廣泛使用和生產的化學品是硫酸?？色@得的濃度范圍是0％-98％，在所有和普遍用于中和反應的酸中，硫酸是最經濟的。它比使用HCl或HNO3更容易和更安全，并且除了磷酸以外，它比其它所有酸更有效。硫酸的典型使用濃度范圍是25％-96％。然而，通常推薦使用30％-50％濃度的硫酸。
鹽酸(HCl)，也已知為muriatic acid，是在工業(yè)上第二個最常使用的酸，硫酸是主要的選擇，原因在于硫酸更有效并且相對廉價。在最大可獲得濃度37％時，HCl的有效性約是硫酸的1/3，因此使得它使用起來相對更昂貴。取決于溫度和攪拌，10％濃度以上的HCl變?yōu)槁然瘹湔魵?，其與空氣中存在的水蒸汽結合。由此形成的氣體具有高度的腐蝕性，并且侵蝕所有的金屬物品，包括建筑物結構，噴頭，銅線，不銹鋼等。因此，必須是適當通風，或在氣體可容易消散的室外使用。
硝酸(HNO3)，盡管是在很多工業(yè)中廣泛使用的化學品，它仍然不如鹽酸或硫酸普及，原因在于它使用起來比兩者更昂貴。硝酸與空氣中存在的水蒸汽結合變?yōu)橛泻怏w。該氣體是高度腐蝕性的，并侵蝕所有金屬物品，包括建筑物結構，噴頭，銅線，不銹鋼等。因此，必須是適當通風，或在氣體可容易消散的室外使用。
磷酸(H3PO4)，非常廣泛用于農業(yè)肥料和洗滌產品的生產，它是相對廉價的酸。然而，它仍然不能與硫酸和鹽酸充分競爭，原因在于它是弱酸，并且在正常濃度時在水中不能完全解離。這賦于它在使用時比硫酸或鹽酸更安全，并且它較少變體氣體。它傾向于緩沖中和反應，這使得它用于較慢的容易控制的反應。由于它的成本(與硫酸相比較)和可用性，磷酸不常用于中和體系中。
二氧化碳(CO2)是在地球大氣中發(fā)現(xiàn)的第三個最濃的氣體，CO2本身不是酸。當溶解于水中時，它形成碳酸(H2CO3)；就是這種碳酸在溶液中產生堿的中和。對于所有的實際應用而言，CO2最吸引人的特征是它不將水的pH降低在7.0以下。另外，CO2不具有腐蝕性；然而，由于它比空氣更重，因此，一種危險是引起窒息。由于必須將二氧化碳溶解在溶液中使用，因此難于使用該氣體，并且它的應用受到限制。這需要使用碳酸化器，或一些方法，以將該氣體溶解在溶液中。還發(fā)生顯著的出氣，這不成問題，除非方法還需要固體沉淀。在灌注水泥的操作中，產生大量的堿性廢水。對于這類應用而言是極好的選擇，原因在于位點是臨時的，氣體是無危險的，假設考慮保留和混和，可以平行(in-line)使用，并且該氣體是自身緩沖的，因此不考慮劑量，它將不會將pH降低到低于7.5-7.0。
嗜堿菌(alkaliphiles)
取決于生長條件，特別是營養(yǎng)，金屬離子和溫度，對于生長而言，幾種微生物顯示出多于一種適宜pH。術語“嗜堿菌”用于表示在pH超過9的條件下最適生長或生長良好的微生物。第一篇涉及嗜堿性微生物的堿性酶的報道公開于1971年(Horikoshi.K.(1971)Production of alkaline enzymesby alkalophilic microorganisms.Part 1.Akaine protease produced by BacillusNo，221.Agric.Biol.Chem.36，.1407-1414)。在過去的二十年中，我們的研究已經集中在嗜堿性微生物的酶學，生理學，生態(tài)學，分類學，分子生物學和遺傳學。這些微生物的工業(yè)應用也已經被廣泛研究，一些酶如堿性蛋白酶，堿性淀粉酶和堿性纖維素酶已經用于工業(yè)規(guī)模(Horikoshi，K.andAkiba，T.(1982)Alkalophilic MicroorganismsA New Microbial World.Springer-Verlag，Heidelberg，Tokyo.，Horikoshi，K.(1991)Microorganisms inAlkaline Environments，Kodansha-VCH，Tokyo，Weinheim，New York，Cambridge，Basel)。
隨后，很多微生物學家在各種領域發(fā)表了許多關于嗜堿性微生物的文章。在pH10-13的堿性環(huán)境中，嗜堿菌的細胞表面可以維持細胞內的pH處于中性。在1995年，通過利用嗜基本二氧化碳C-125突變體開發(fā)了新的宿主載體系統(tǒng)，該突變體對堿性敏感，并且已經研究了負責嗜堿性(alkaliphily)的基因(Kudo，T.，Hino，M.，Kitada，M.and Horikoshi，K.(1990)DNA sequences required for the alkalophily of Bacillus sp.strain C-125 arelocated close together on its chromosomal DNA.J.Bacteriol.172，7282-7283.Seto，Y.，Hashimoto，M.，Usami，R.，Hamamoto，T.，Kudo，T.and Horikoshi，K.(1995)Characterization of a mutation responsible for an alkali-sensitivemutant，18224，of alkaliphilic Bacillus sp.Strain C-125.Biosei.Biotechnol.Biochem.59，1364-1366)。
盡管已經將嗜堿菌用于許多工業(yè)應用，但沒有關于利用它們來中和紡織工業(yè)廢水的研究報道。美國專利申請?zhí)?9/160422(1998)公開了在存在糖的條件下利用細菌混和物的生物中和方法。
發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是提供細菌分離株-庫特氏菌(MTCC 5181)，其保藏在布達佩斯條約認可的國際保藏機構IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度。
本發(fā)明的另一個目的是提供制備保藏在布達佩斯條約認可的國際保藏機構IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度的細菌分離株庫特氏菌(MTCC5181)的方法。
本發(fā)明的另一個目的是分離細菌-庫特氏菌(MTCC 5181)，其保藏在布達佩斯條約認可的國際保藏機構IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度，并且能夠中和紡織工業(yè)的高堿性廢水。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種來自紡織工業(yè)廢水的細菌分離株-庫特氏菌(MTCC5181)，其保藏在布達佩斯條約認可的國際保藏機構IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度。該細菌分離株能夠在2小時的時間內將廢水的pH從12.00降低到7.00單位。與通過化學手段進行常規(guī)中和相比，通過該生物技術方法中和堿性紡織工業(yè)廢水是高度有效和經濟的。
在本發(fā)明的一個實施方案中，該細菌分離株能夠在10.00-12.00的pH范圍內生長。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，該細菌分離株能夠在短時間內(約2小時)將紡織工業(yè)廢水的pH(12.0-11.5)降低至中性pH(7.5-7.00)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，以1∶5-1∶10的比率，將細菌沉淀用于將紡織工業(yè)廢水的高pH(12.0-11.5)中和至中性pH(7.5-7.0)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，該細菌分離株分離自位于印度昌迪加爾的紡織工業(yè)流出物處理工廠管道中在積累的污物，該管道已經長時間通過堿性廢水。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，該細菌分離株-庫特氏菌是革蘭氏陽性的，能動的，過氧化氫酶陽性的，和能夠還原硝酸鹽和水解淀粉。本發(fā)明還提供制備用于中和紡織工業(yè)堿性廢水(pH-12.00-11.5)的細菌庫特氏菌(MTCC 5181)的細菌分離株，其保藏在布達佩斯條約認可的國際保藏機構IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度，該方法包括a)通過以1∶1-1∶2的比率，100-120rpm和35-37℃下，將污物提取物加入在基本碳酸鹽培養(yǎng)基中72-96小時，富集被細菌污染的污物；b)通過使用所述基本碳酸鹽培養(yǎng)基，在pH1.5-12.00和35-37℃下培養(yǎng)細菌8-10小時；c)在達到大量生長(O.D.1.5-2.0)后，通過離心獲自步驟(b)的培養(yǎng)物來分離所述細菌，以獲得細菌細胞的沉淀；d)將獲自步驟(c)的沉淀溶解在磷酸鹽緩沖液中；e)通過向廢水中加入從步驟(d)中獲得的細菌沉淀來中和紡織工業(yè)的堿性廢水(pH12.00-11.5)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，被污染的污物獲自位于印度昌迪加爾紡織工業(yè)的流出物處理工廠的管道。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，通過取5-7g高壓滅菌瓶中的新鮮污物進行來自所述位置的污物的富集，所述滅菌瓶中含有100-110ml污物提取物，50μl Candid B(抗真菌)和基本碳酸鹽培養(yǎng)基。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，通過在約4000rpm下離心滅菌的污物混和物約20分鐘來制備污物提取物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，通過以約1∶3的比率將干燥的污物溶解在蒸餾水中，并在約15psi下高壓滅菌約1小時來制備滅菌的污物混和物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，基本碳酸鹽培養(yǎng)基包含約1∶.5∶.5∶.13∶.02∶10重量/體積比的葡萄糖，細菌培養(yǎng)用蛋白胨，酵母提取物，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O和碳酸鈉。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，將污物提取物和基本碳酸鹽培養(yǎng)基的混和物用于捕獲所述位置的最大限度的細菌菌群。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述污物提取物和所述基本碳酸鹽培養(yǎng)基的比率是1∶1-1∶2。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，在確定的條件如培養(yǎng)基，溫度，pH，碳源下來培養(yǎng)分離的細菌分離株。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，對于所有的細菌分離株(總共三株)，檢查它們在短時間內降低紡織廢水pH的中和能力。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，通過pH計監(jiān)測pH的降低。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，選擇能夠在約2小時的短時間內降低堿性紡織廢水pH的細菌。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，在利用基本碳酸鹽培養(yǎng)基，接著在37℃/120rpm下溫育8小時的確定的條件下培養(yǎng)選擇的細菌，用于中和堿性紡織工業(yè)廢水。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，在達到大量(heavy)生長O.D.(1.5)后，在5000-7000rpm，1-4℃下離心生長培養(yǎng)物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，將細菌沉淀溶解在磷酸鹽緩沖液(pH6.8)中。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，通過向200ml廢水中加入細菌沉淀來進行高堿性紡織工業(yè)廢水的中和，當通過pH計所檢測時，在2-1.5小時中觀察到將pH從12.0-11.5降低到7.5-7.00。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，將細菌庫特氏菌用作全細胞。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了細菌分離株-庫特氏菌(MTCC 5181)，其保藏在布達佩斯條約認可的國際保藏機構IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度。該細菌分離株-庫特氏菌(MTCC 5181)能夠中和紡織工業(yè)的高堿性廢水。
該細菌分離株能夠在pH為10-12.00的培養(yǎng)基中生長。
已經觀察到該細菌分離株還能夠在短的時間內(約2小時)將紡織工業(yè)廢水的pH(12.0-11.5)降低到中性pH(7.5-7.00)。以1∶5-1∶10的比率，將該分離株以細菌沉淀的形式用于將紡織工業(yè)廢水的高pH(12.0-11.5)中和至中性pH(7.5-7.0)。
該細菌分離株分離自位于印度昌迪加爾的紡織工業(yè)的流出物處理工廠管道中積累的污物，該管道已經長時間通過堿性廢水。該細菌分離株是革蘭氏陽性的，能動的，過氧化氫酶陽性的，能夠還原硝酸鹽和水解淀粉。
制備細菌庫特氏菌(MTCC 5181)的細菌分離株的方法包括以下步驟a)通過以1∶1-1∶2的比率，100-120rpm和35-37℃下，將污物提取物加入在基本碳酸鹽培養(yǎng)基中72-96小時，富集被細菌污染的污物；b)通過使用所述基本碳酸鹽培養(yǎng)基，在pH1.5-12.00和35-37℃下培養(yǎng)細菌8-10小時；c)在達到大量生長(O.D.1.5-2.0)后，通過離心獲自步驟(b)的培養(yǎng)物來分離所述細菌，以獲得細菌細胞的沉淀；d)將獲自步驟(c)的沉淀溶解在磷酸鹽緩沖液中；e)通過向廢水中加入從步驟(d)中獲得的細菌沉淀來中和紡織工業(yè)的堿性廢水(pH12.00-11.5)。
被污染的污物獲自位于印度昌迪加爾紡織工業(yè)的流出物處理工廠的管道。通過取5-7g高壓滅菌瓶中的新鮮污物進行來自所述位置的污物的富集，所述滅菌瓶中含有100-110ml污物提取物，50μl Candid B(抗真菌)和基本碳酸鹽培養(yǎng)基。
通過在約4000rpm下離心滅菌的污物混和物約20分鐘來制備污物提取物。通過以約1∶3的比率將干燥的污物溶解在蒸餾水中，并在約15psi下高壓滅菌約1小時來制備滅菌的污物混和物。
基本碳酸鹽培養(yǎng)基包含約1∶.5∶.5∶.13∶.02∶10重量/體積比的葡萄糖，細菌培養(yǎng)用蛋白胨，酵母提取物，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O和碳酸鈉。將污物提取物和基本碳酸鹽培養(yǎng)基的混和物用于捕獲所述位置的最大限度的細菌菌群。所述污物提取物和所述基本碳酸鹽培養(yǎng)基的比率是1∶1-1∶2。
在確定的條件下如培養(yǎng)基，溫度，pH，碳源等來培養(yǎng)分離的細菌分離株。對于所有的細菌分離株(總共三株)，檢查它們在短時間內降低紡織廢水pH的中和能力。通過pH計監(jiān)測pH的降低?；谒诩s2小時的短時間內降低堿性紡織廢水pH的能力來選擇細菌。
在利用基本碳酸鹽培養(yǎng)基，接著在37℃/120rpm下溫育8小時的確定的條件下培養(yǎng)選擇的細菌，用于中和堿性紡織工業(yè)廢水。在達到大量生長O.D.(1.5)后在5000-7000rpm，1-4℃下離心生長培養(yǎng)物。將細菌沉淀溶解在磷酸鹽緩沖液(pH6.8)中。
通過向200ml廢水中加入細菌沉淀來進行高堿性紡織工業(yè)廢水的中和，如通過pH計所檢測，在2-1.5小時中觀察到將pH從12.0-11.5降低到7.5-7.00。
如果需要，將細菌庫特氏菌用作全細胞。
將本發(fā)明關注的細菌菌株保藏在布達佩斯條約認可的國際保藏機構IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度。
S.No.培養(yǎng)物 MTCC ID No.
1庫特氏菌(MTCC 5181)上述細菌菌株顯示在確定的條件下，在1.5-2小時的短時間內能夠中和高堿性紡織工業(yè)廢水的顯著能力。本發(fā)明的細菌菌株分離自位于印度昌迪加爾的紡織工業(yè)流出物處理工廠管道中積累的污物。為了分離潛在的細菌分離株，100-110ml污物提取物；100-110ml基本碳酸鹽培養(yǎng)基和50μlCandid B(抗真菌)?；咎妓猁}培養(yǎng)基含有1％(w/v)葡萄糖，0.5％細菌培養(yǎng)用蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.13％K2HPO4·3H2O，和0.02％MgSO4·7H2O。將碳酸鈉(10％)單獨滅菌，并添加以獲得1％濃度和培養(yǎng)基的最初pH值為10.5。將富集瓶在35-37℃、100-120rpm下放置約72-96小時。
為了制備污物提取物，取1kg污物，并在50℃干燥2小時。將400g干燥的污物溶解在960ml一次蒸餾的水中，并在15lbs下高壓滅菌1小時。高壓滅菌后，將樣品在5000rpm下離心10分鐘。收集上清液(提取物)，并存儲在無菌瓶中，用于制備富集瓶和進一步使用。
將富集的污物樣品系列稀釋在0.85％鹽水中。將10μl來自每個個體稀釋物樣品平鋪到瓊脂培養(yǎng)板上，該培養(yǎng)板含有污物提取物和50％基本碳酸鹽培養(yǎng)基。基本碳酸鹽培養(yǎng)基含有1％(w/v)葡萄糖，0.5％細菌培養(yǎng)用蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.13％K2HPO4·3H2O，和0.02％MgSO4·7H2O。將碳酸鈉(10％)單獨滅菌，并添加以獲得1％濃度和培養(yǎng)基的最初pH值為10.5。將如此獲得的平板倒置在37±2℃下溫育24-96小時。
在克隆形態(tài)學和顏色的基礎上，選擇總共3株細菌分離株，以檢測它們中和堿性廢水的能力。挑取單個分離的克隆，并在新鮮的平板上劃線，所述平板含有相同的培養(yǎng)基。重復上述步驟，直至獲得純凈的克隆。
為了檢查三株分離細菌的中和能力，在玻璃瓶的三個位置取200ml高pH(12.0-11.5)的紡織工業(yè)廢水，獨自加入每種細菌生長物。用pH計監(jiān)測pH的降低。
三株細菌中，發(fā)現(xiàn)僅1株分離株能夠在高pH(12.0-11.5)下生長，并且在1.5-2小時的短時間內降低廢水的pH。將該細菌鑒定為庫特氏菌，其主要特征如下細菌-庫特氏菌在性質上是需氧的，是革蘭氏陽性的，在25-42℃溫度范圍內顯示最佳生長，能夠在高pH環(huán)境(pH12.00)中生長，能夠水解淀粉，是能動的，過氧化氫酶陽性的合還原硝酸鹽。在中和實驗中，紡織工業(yè)廢水取自地方紡織工業(yè)。將如上述篩選的細菌庫特氏菌接種在200-220ml基本碳酸鹽培養(yǎng)基中。在振蕩(100-120rpm)條件下，于35-37℃下溫育培養(yǎng)物8小時。觀察到大量細菌生長(光密度(O.D＝1.5))后，在約1-4℃，5000-7,000rpm下離心培養(yǎng)物。按照沉淀的大小，將培養(yǎng)物沉淀溶解在約20ml磷酸鹽緩沖液中。將該沉淀添加到含有200ml紡織工業(yè)廢水(pH12.0-11.5))的燒瓶中。將該燒瓶放置在振蕩條件下(100-120rpm)。在1.5-2小時后觀察到pH的降低。在1.5-2小時的短時間內，該細菌庫特氏菌(MTCC 5181)已經能夠將pH從12-11.5降低到7.5-7。通過pH計監(jiān)測pH。
本發(fā)明還提供了一種制備用于中和堿性廢水的細菌生長物的方法a)利用污物提取物和基本碳酸鹽培養(yǎng)基富集所述位置的污物，以分離具有中和能力的細菌；b)利用污物提取物和基本碳酸鹽培養(yǎng)基的混和物從所述位置捕獲需要的潛在細菌，所述培養(yǎng)基包含約1％(w/v)葡萄糖，約0.5％細菌培養(yǎng)用蛋白胨，約0.5％酵母提取物，約0.13％K2HPO4·3H2O，和約0.02％MgSO4·7H2O。將碳酸鈉(約10％)單獨滅菌，并添加以獲得1％濃度和最初pH值為10.5；c)在如培養(yǎng)基，溫度，pH，碳源等的確定條件下培養(yǎng)分離自具體位置的所述細菌；d)通過將分離的細菌分離株接種在200-220ml堿性紡織工業(yè)廢水中來檢查分離的細菌分離株的中和能力；e)通過pH計監(jiān)測pH的降低；f)選擇可以在短時間內中和堿性廢水的細菌分離株；g)在確定的條件下培養(yǎng)所選擇的細菌，用于中和堿性紡織工業(yè)廢水。使用基本碳酸鹽培養(yǎng)基來培養(yǎng)培養(yǎng)物。將培養(yǎng)燒瓶在35-37℃、100-120rpm下溫育8小時，以便獲得大量生長；h)在達到大量生長O.D.(1.5)后，離心得到的培養(yǎng)物；
i)收集細菌沉淀并溶解在磷酸鹽緩沖液中；j)通過將細菌沉淀加入到200ml廢水中來中和高堿性紡織工業(yè)廢水。如通過pH計所檢查，在1.5-2小時觀察到pH從12.0-11.5降低到7.5-7.00。
下述實施例是用于舉例說明，因此不應被解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實施例1在開發(fā)嗜堿性細菌的努力中，進行戰(zhàn)略分離以從位于印度昌迪加爾德紡織工業(yè)流出物處理工廠管道中積累的污物捕獲潛在的細菌群，該管道已長時間通過堿性廢水。從所述管道收集積累的污物以分離細菌。
為了分離潛在的細菌分離株，將5g來自所述位置的污物添加到500ml高壓滅菌瓶中，所述高壓滅菌瓶包含100ml污物提取物；100ml基本碳酸鹽培養(yǎng)基和50μl Candid B(抗真菌)。基本碳酸鹽培養(yǎng)基包含1％(w/v)葡萄糖，0.5％細菌培養(yǎng)用蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.13％K2HPO4·3H2O，和0.02％MgSO4·7H2O。將碳酸鈉(10％)單獨滅菌，并添加以獲得1％濃度和培養(yǎng)基的最初pH為10.5。將富集瓶在37℃，120rpm下放置96小時。為了制備污物提取物，取1kg污物，并在50℃干燥2小時。
將400g干燥的污物溶解在960ml一次蒸餾的水中，并在15lbs下高壓滅菌1小時。高壓滅菌后，將樣品在5000rpm下離心10分鐘。收集上清液(提取物)，并存儲在無菌瓶中，用于制備富集瓶和進一步應用。將富集的污物樣品系列稀釋在0.85％鹽水中。100μl來自每個個體稀釋物的樣品平鋪到瓊脂培養(yǎng)板上，該培養(yǎng)板含有污物提取物和50％基本碳酸鹽培養(yǎng)基。所述基本碳酸鹽培養(yǎng)基含有1％(w/v)葡萄糖，0.5％細菌培養(yǎng)用蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.13％K2HPO4·3H2O，和0.02％MgSO4·7H2O。將碳酸鈉(10％)單獨滅菌，并添加以獲得1％濃度和培養(yǎng)基的最初pH為10.5。將如此獲得到平板在37±2℃下倒置溫育24-96小時。
在菌落形態(tài)學和顏色的基礎上，選擇總共3株細菌分離株以檢測它們中和堿性廢水的能力。挑取單個分離的克隆，并在新鮮的平板上劃線，所述平板含有相同的培養(yǎng)基。重復上述步驟，直至獲得純凈的克隆。
實施例2為了開發(fā)中和堿性紡織工業(yè)廢水的潛在細菌，從已長時間通過紡織工業(yè)廢水的管道中分離總共三株細菌。選擇這些細菌分離株，以檢查它們中和堿性廢水的能力。挑取單個分離的克隆并在新鮮的瓊脂平板上劃線，所述平板含有相同的培養(yǎng)基。重復上述步驟直至獲得純凈的克隆。
為了檢查三株分離細菌的中和能力，在500ml玻璃瓶的三個位置取200ml高pH(12.00)的紡織工業(yè)廢水，獨自加入每種細菌生長物。用pH計監(jiān)測pH的降低(表1)。
表1通過分離的嗜堿性細菌引起的堿性廢水的pH減少
實施例3在菌落形態(tài)學和顏色的基礎上，選擇總共3株細菌分離株以檢測它們中和堿性廢水的能力。挑取單個分離的克隆，并在新鮮的平板上劃線，所述平板含有相同的培養(yǎng)基。重復上述步驟，直至獲得純凈的克隆。
三株細菌中，發(fā)現(xiàn)僅1株分離株(分離株2)-庫特氏菌能夠在高pH(12.00)下生長，并且在2小時的短時間內降低廢水的pH(7.04)。將該細菌鑒定為庫特氏菌，其主要特征如下(a)在性質上是需氧的(b)革蘭氏陽性的(c)在25-42℃顯示適宜生長
(d)能在高pH(pH12.00)環(huán)境中生(e)能夠水解淀粉(f)是能動的(g)是過氧化氫酶陽性的(h)還原硝酸鹽實施例4為了觀察所篩選的細菌庫特氏菌在合適培養(yǎng)基上的生長，將來自庫特氏菌瓊脂平板的兩個接種環(huán)在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和基本碳酸鹽培養(yǎng)基的平板上劃線?；咎妓猁}培養(yǎng)基含有1％(w/v)葡萄糖，0.5％細菌培養(yǎng)用蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.13％K2HPO4·3H2O，和0.02％MgSO4·7H2O。將碳酸鈉(10％)單獨滅菌，并添加以獲得1％濃度和培養(yǎng)基的最初pH為10.5。將如此獲得到平板在37±2℃下倒置溫育24-96小時。
含有2％瓊脂的NB培養(yǎng)基具有約7的最初pH，而BCM培養(yǎng)基具有10.5的最初pH。為了增加培養(yǎng)基的pH，使用Tris-HCL和Na2CO3-NaHCO3緩沖液。
表2顯示庫特氏菌在NB和BCM培養(yǎng)基上的生長
+非常差生長++較差生長；+++良好生長；++++非常良好地生長。
觀察到高pH的BCM培養(yǎng)基是生長庫特氏菌的合適培養(yǎng)基。
實施例5
還用凍干的庫特氏菌粉末中和堿性紡織廢水。將40ml培養(yǎng)物(O.D.＝1.5)的細菌沉淀凍干，并添加到500ml含有200ml堿性紡織廢水的燒瓶中。
將接種的燒瓶在37℃保持2小時。在2小時內觀察到pH的降低(表3)。
將實驗進行一式兩份(組1和組2)表3通過庫特氏菌的凍干細菌粉末引起的堿性廢水pH降低
益處1.利用庫特氏菌中和堿性紡織廢水是經濟和有效的方法。在常規(guī)的酸-中和方法中，利用酸的特性(tone)來進行中和，而在所開發(fā)的生物方法中，極大地降低了成分。
2.通過生物手段中和堿性紡織廢水是相當安全的方法，原因在于由于強酸對工人的健康以及工業(yè)方法有危險作用，導致利用大量的酸中和廢水對于工業(yè)而言是不安全的。除此之外，利用大量的酸還增加了排出到主要河流中的工業(yè)廢水的體積。
權利要求
1.細菌分離株-庫特氏菌(Kurthia sp.)(MTCC 5181)，其保藏在布達佩斯條約認可的國際保藏機構IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度。
2.權利要求1的分離株，其中所述分離株能夠在pH為10.00-12.00的培養(yǎng)基上生長。
3.權利要求1的分離株，其中所述細菌分離株能夠在約2小時的短時間內將紡織工業(yè)廢水的pH(12.0-11.5)降低至中性pH(7.5-7.00)。
4.權利要求1的分離株，其中當以1∶5-1∶10的比率使用時，所述細菌分離株能夠將紡織工業(yè)廢水的高pH(12.0-11.5)中和至中性pH(7.5-7.0)。
5.權利要求1的分離株，其中所述細菌分離株分離自位于印度昌迪加爾的紡織工業(yè)的流出物處理工廠的已通過堿性廢水的管道中所積累的污物。
6.權利要求1的分離株，其中所述細菌分離株庫特氏菌是革蘭氏陽性的，能動的，過氧化氫酶陽性的，和能夠還原硝酸鹽和水解淀粉。
7.制備細菌庫特氏菌(MTCC 5181)的細菌分離株的方法，所述分離株用于中和紡織工業(yè)的堿性廢水(pH-12.00-11.5)，并保藏在布達佩斯條約認可的國際保藏機構IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度，所述方法包括(a)通過將污物提取物加入到基本碳酸鹽培養(yǎng)基富集被細菌污染的污物；(b)利用基本碳酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌；(c)分離獲自步驟(b)的培養(yǎng)物的細菌，以獲得細菌細胞的沉淀；(d)將獲自步驟(c)的沉淀溶解在磷酸鹽緩沖液中。
8.權利要求7的方法，其中將步驟(a)在100-120rpm和35-37℃范圍的溫度下進行72-96小時。
9.權利要求7的方法，其中所述污物提取物對基本碳酸鹽培養(yǎng)基的比率是1∶1-1∶2。
10.權利要求7的方法，其中將細菌在1.5-12.00的pH，35-37℃的溫度下，在步驟(b)中培養(yǎng)8-10小時。
11.權利要求7的方法，其中在通過測定光密度，直至光密度達到1.5-2.0的范圍而確定的大量生長后，通過離心在步驟(c)中分離步驟(b)中獲得的培養(yǎng)物。
12.權利要求7的方法，其中污染的污物獲自位于印度昌迪加爾的紡織工業(yè)流出物處理工廠的管道。
13.權利要求7的方法，其中通過取5-7g高壓滅菌瓶中的新鮮污物進行污物的富集，所述高壓滅菌瓶中含有100-110ml的污物提取物，50μlCandid B(抗真菌)和基本碳酸鹽培養(yǎng)基。
14.權利要求7的方法，其中通過在約4000rpm下離心無菌的污物混和物約20分鐘來制備提取物。
15.權利要求14的方法，其中通過以約1∶3的比率在蒸餾水中混合干燥的污物，和在約15psi下高壓滅菌該混和物約1小時來制備無菌污物混和物。
16.權利要求7的方法，其中所述基本碳酸鹽培養(yǎng)基含有比率約為1∶.5∶.5∶.13∶.02∶10重量/體積的葡萄糖，細菌培養(yǎng)用蛋白胨，酵母提取物，K2HPO4.3H2O，MgSO4.7H2O和碳酸鈉。
17.權利要求7的方法，其中在培養(yǎng)基、溫度、pH和碳源的確定條件下培養(yǎng)所述分離的細菌分離株。
18.權利要求7的方法，其中在達到通過光密度約為1.5確定的大量生長后，在5000-7000rpm，1-4℃下離心生長的培養(yǎng)物。
19.權利要求7的方法，其中將細菌沉淀溶解在pH約為6.8的磷酸鹽緩沖液中。
20.中和紡織工業(yè)堿性廢水的方法，其包括向其中加入細菌庫特氏菌細菌分離株(MTCC 5181)的細胞沉淀，以將堿性廢水的pH從pH12.00-11.5降低到范圍為7.5-7.00的中性pH。
21.權利要求20的方法，其中所述方法包含(a)通過將污物提取物加入到基本碳酸鹽培養(yǎng)基來富集被細菌污染的污物；(b)利用基本碳酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌；(c)從獲自步驟(b)的培養(yǎng)物中分離細菌，以獲得細菌細胞的沉淀；(d)將獲自步驟(c)的沉淀溶解在磷酸鹽緩沖液中；(e)通過向廢水中加入獲自步驟(d)的細菌沉淀來中和紡織工業(yè)的堿性廢水(pH-12.00-11.5)。
22.權利要求21的方法，其中將步驟(a)在100-120rpm和35-37℃范圍的溫度下進行72-96小時。
23.權利要求21的方法，其中污物提取物與基本碳酸鹽培養(yǎng)基的比率在1∶1-1∶2的范圍內。
24.權利要求21的方法，其中在1.5-12.00的pH和35-37℃的溫度下，在步驟(b)中培養(yǎng)細菌8-10小時。
25.權利要求21的方法，其中在通過測量光密度直至光密度達到1.5-2.0而確定大量生長后，通過離心在步驟(c)中分離步驟(b)中獲得的培養(yǎng)物。
26.權利要求21的方法，其中被污染的污物獲自位于印度昌迪加爾的紡織工業(yè)的流出物處理工廠的管道。
27.權利要求21的方法，其中通過取5-7g高壓滅菌瓶中的新鮮污物進行污物的富集，所述高壓滅菌瓶中含有100-110ml的污物提取物，50μlCandid B(抗真菌)和基本碳酸鹽培養(yǎng)基。
28.權利要求21的方法，其中通過在約4000rpm下離心無菌的污物混和物約20分鐘來制備污物提取物。
29.權利要求28的方法，其中通過以約1∶3的比率將干燥的污物溶解在蒸餾水中和將混和物在約15psi下高壓滅菌約1小時來制備無菌污物混和物。
30.權利要求21的方法，其中所述基本碳酸鹽培養(yǎng)基包含比率約為1∶.5∶.5∶.13∶.02∶10重量/體積的葡萄糖，細菌培養(yǎng)用蛋白胨，酵母提取物，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O和碳酸鈉。
31.權利要求21的方法，其中在培養(yǎng)基、溫度、pH和碳源的確定條件下培養(yǎng)所述分離的細菌分離株。
32.權利要求21的方法，其中在通過約1.5的光密度確定的大量生長后，在5000-7000rpm，1-4℃下離心生長培養(yǎng)物。
33.權利要求21的方法，其中將細菌沉淀溶解在pH約為6.8的磷酸緩沖液中。
34.權利要求21的方法，其中在確定的時間中檢查在步驟(d)的結尾獲得的所有細菌分離株降低紡織廢水的pH的中和能力。
35.權利要求21的方法，其中通過pH計監(jiān)測pH的降低。
36.權利要求21的方法，其中通過利用細菌培養(yǎng)用碳酸鹽培養(yǎng)基，接著在37℃和120rpm下溫育8小時，培養(yǎng)所選擇的細菌。
37.權利要求21的方法，其中通過將細菌沉淀加入到200ml廢水中以在2小時-1.5小時的時間內用pH計測量將pH從12.0-11.5降低到7.5-7.00來實現(xiàn)紡織工業(yè)的高堿性廢水的中和。
38.權利要求21的方法，其中將細菌庫特氏菌用作全細胞。
39.權利要求21的方法，其中相對于廢水，以1∶5-1∶10的比率使用細菌沉淀。
40.權利要求21的方法，其中所述細菌分離株庫特氏菌是革蘭氏陽性的，能動的，過氧化氫酶陽性的，能夠還原硝酸鹽和水解淀粉。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新的通過在印度分離的細菌菌株來中和紡織工業(yè)廢水的方法。該分離的細菌菌株能夠在2小時內將廢水的pH從12.00降低到7.00單位。與通過化學手段進行的常規(guī)中和相比，通過這種生物技術方法進行的堿性紡織工業(yè)廢水的中和是高度有效和經濟的。這種生物技術方法在產生堿性廢水的紡織工業(yè)中可發(fā)現(xiàn)廣泛的商業(yè)應用。
文檔編號C02F103/30GK101090872SQ200480044739
公開日2007年12月19日 申請日期2004年12月30日 優(yōu)先權日2004年12月30日
發(fā)明者麗塔·庫馬爾, 阿尼爾·庫馬爾 申請人:科學與工業(yè)研究委員會