專利名稱：一種含重組人金屬硫蛋白藥物及制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領域，具體涉及一種含重組人金屬硫蛋白藥物及制備方法。
MT發(fā)現(xiàn)至今已有40多年，有關的分子生物學，生理學和醫(yī)學基礎性研究發(fā)表的論文超過5000多篇。MT的生理、生化功能非常廣泛，概括起來主要有以下幾點(1)參與細胞分裂增殖、分化和抑制細胞調(diào)亡；(2)參與重金屬元素的代謝，維持機體鋅元素等重金屬元素的平衡和穩(wěn)定；(3)參與調(diào)節(jié)部分機體免疫功能；(4)解除機體有害重金屬元素如鎘、鉛、汞等的中毒；(5)強力的細胞自由基清除功能；不僅對超氧自由基有強的清除能力，而且對羥自由基、NO自由基、脂自由基等都有較強的清除能力，目前熟知的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶、谷光甘肽等是不具備同時能清除多種類型的氧自由基或其它自由基的能力。
MT自發(fā)現(xiàn)至今，一直是生物科學和醫(yī)學科學研究的熱門課題。分子生物學的研究已經(jīng)使這類蛋白的基因結(jié)構(gòu)，基因調(diào)空，基因序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，氨基酸序列等得到了解和闡明。MT轉(zhuǎn)基因動物的研究和應用給MT醫(yī)學科學的研究帶來了方便和支持。MT抗氧化自由基的作用在基礎醫(yī)學研究中已經(jīng)表明，MT可以防治許多由自由基造成的機體組織和器官的損傷以及阻止或減緩多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，如失血或缺血以及再輸血造成的組織細胞損傷。對重金屬元素不平衡造成的機體疾病，MT有較好的解除重金屬對肝和腎等組織的損傷。體外研究表明，MT可以阻止和降解在大腦中的β-淀粉樣蛋白物質(zhì)的積聚，研究發(fā)現(xiàn)這類物質(zhì)與老年癡呆的發(fā)生發(fā)展有關。另外，清除腦組織中的自由基，對于防治老年癡呆，防止機體衰老都具有極其重要的臨床治療和保健意義。
據(jù)報道，在德國有心肌梗塞、抗風濕/類風濕關節(jié)炎；在美國有抗肝癌；在日本有抗?jié)?、消炎等專利報道；我國有抗口腔潰瘍藥物制劑的專利報道。但所有上述專利藥品已?jīng)開發(fā)成功的和市場應用的所見不多。目前市場上的產(chǎn)品也較多地集中在保健品、化妝品等領域。這些產(chǎn)品MT原料主要來自動物兔肝組織誘導提取純化。提取成本很高，平均原料成本85萬元/公斤。大約提取0.3公斤MT(大于60％含量)，需要殺死555只家兔，而且是MT-1和MT-2的混合型，純度不高。北京大學從酵母中提取銅金屬硫蛋白，雖然降低了提取成本，但仍然與人體MT還有較大的差異。所有上述產(chǎn)品開發(fā)的原料均為非人體MT，這可能在一定程度上限制了MT藥品的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。因為非人體蛋白在人體血液中會引起免疫抗體的產(chǎn)生，降低蛋白質(zhì)的藥理生理作用或產(chǎn)生其他可能的副作用。目前采用重組人金屬硫蛋白為主要有效成分開發(fā)的藥品報道和市場應用還沒有。此外，有關細胞調(diào)亡抑制作用的“卡斯帕酶(Caspases)抑制劑”的開發(fā)熱潮在西方跨國制藥公司與生物工程公司一浪高過一浪，競相投入數(shù)百萬美元的科研經(jīng)費。目前已經(jīng)有幾個這類藥品在進行臨床階段的研究。MT通過抑制自由基的攻擊抑制卡斯帕酶的激活，從而抑制細胞調(diào)亡的作用已經(jīng)有多篇研究報道得到肯定。MT作為一種類型的細胞調(diào)亡抑制劑大有臨床開發(fā)前景。因此，為加速MT的開發(fā)利用，尤其是臨床藥品的開發(fā)，采用低成本，高純度的重組人類MT是目前的當務之急。
本發(fā)明公開的重組人金屬硫蛋白(rhMT)通過下述方法獲得1.含MT基因質(zhì)粒的獲得RT-PCR方法，按MT目標基因mRNA的結(jié)構(gòu)序列，合成5’和3’端的RT-PCR反應引物，約20-30個bp堿基。人組織細胞株體外培養(yǎng)，誘導(一般用鋅元素等)，提取總RNA，通過30個循環(huán)的RT-PCR反應，獲得MT目標基因的cDNA，同樣在5’和3’端的非翻譯區(qū)引入酶切位點。PCR獲得的cDNA，酶切后，與相應載體上的酶切位點相連接。獲得含MT目標基因cDNA的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化到相應工程菌受體細胞中，擴增質(zhì)粒。
2.質(zhì)粒MT序列鑒定將擴增帶有MT目標基因序列的質(zhì)粒，酶切，電泳分析、純化，收集相關片段測序，以鑒別是否與目標基因序列一致。
3.MT目標基因工程菌的獲得將上述擴增鑒別的質(zhì)粒，酶切，與表達菌質(zhì)粒酶切位點連接，獲得含MT目標基因的表達菌質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到相應的工程菌(此工程菌包括大腸桿菌和酵母菌)。培養(yǎng)，溫度變化誘導、金屬鋅元素誘導或化學物的誘導表達目標基因產(chǎn)物---重組人金屬硫蛋白。培養(yǎng)，分析MT目標基因表達狀況。
4.MT提取純化(1)工程菌細胞發(fā)酵培養(yǎng)，誘導，收集菌體。對大腸桿菌，須破壁處理，離心，收集上清液；對于分泌型酵母，直接離心，收集上清液?！恋怼x心，收集沉淀——緩沖液溶解沉淀——過Sephadex分子篩層析——收集分子量一萬以下的組分——加熱和有機溶劑處理，離心去沉淀——揮發(fā)有機溶劑——過DEAE離子交換柱層析——收集MT組分——再進行離子交換柱層析——收集MT組分——冷凍干燥得純品。
(2)鑒別電泳和HPLC測純度，同時進行抗氧化活性測定。
本發(fā)明方法中MT基因也可通過化學合成法獲得，即選擇MT目標基因(包括MT-1，或MT-2，或MT-3，或MT-4)的結(jié)構(gòu)基因序列，按此序列合成200-300bp的堿基片段，正負鏈各一條，5’和3’端mRNA轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)部分，合成時引入酶切位點。正負鏈退火后，PCR擴增后，酶切，與相應的載體的酶切位點相連接，得到含MT目標基因的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到相應大腸桿菌受體細胞，培養(yǎng)，擴增質(zhì)粒。
本發(fā)明所述的工程菌為大腸桿菌或各種酵母菌。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是提供用上述方法獲得的重組人金屬硫蛋白制成的可供臨床應用的藥物制劑。
本發(fā)明所述的含有重組金屬硫蛋白的藥物制劑，是由純度為90％以上含量的重組人金屬硫蛋白和各種相關的藥用輔料以任意比例制成的各種醫(yī)學上可接受的藥物制劑。如注射劑(包括輸液、肌肉注射劑、粉針劑等)；滴劑；固體制劑(包括膠囊劑、片劑等)；膏劑、霜劑等。
本發(fā)明的所要解決的再一技術(shù)問題是公開上述含金屬硫蛋白藥物制劑在臨床相關疾病治療中的應用。
本發(fā)明制劑可作為制備用于臨床上需要的抗氧化，清除自由基，消炎，抑制細胞調(diào)亡，調(diào)節(jié)體內(nèi)金屬元素平衡的藥物的應用。
本發(fā)明注射劑含1-100mg rhMT/l，膠囊劑或片劑含0.1-50mgrhMT/顆或片，可用于①心肌梗塞或腦梗塞發(fā)作時的輔助搶救藥，減輕發(fā)病過程中的氧化自由基損傷引起后遺癥；創(chuàng)傷失血后的輸血搶救時使用，以防止輸血造成的組織細胞氧化自由基損傷；②有益金屬元素平衡失調(diào)的糾正和重金屬有害元素的中毒排除和防止用藥；③老年癡呆癥的防治用藥；④抗炎癥用藥；⑤防治機體自身免疫性疾病，如類風濕關節(jié)炎用藥。
本發(fā)明滴劑含0.01-10mg rhMT/ml可作為防治白內(nèi)障用藥。
本發(fā)明膏劑或霜劑含0.1-10mg rhMT/g可用于防止燒傷病人燒傷部位氧化損傷用藥。
作為保健品或化妝品中的有效添加劑原料，用于防衰老，預防氧化自由基造成的機體組織損傷及相關疾病的發(fā)生和發(fā)展，加速相關疾病的康復作用。
已有的自由基清除劑，如SOD，植物黃酮類，維生素C和維生素E等在清除自由基能力上無法與MT相比較。以MT與SOD相比較為例(1)MT清除自由基的能力是SOD的1000倍以上；(2)SOD的半衰期僅60秒，而MT的半衰期為2年；(3)SOD的穩(wěn)定性差，60℃即可失活，而MT加熱120℃仍保持活性；(4)SOD的分子量大，為9000-120000，不易被人體吸收，而MT的分子量僅為3000，還不及SOD的1/30，極易被人體吸收；(5)SOD在腸胃中極易被蛋白酶消化分解，而MT不易被消化；(6)MT阻抗電離輻射(紫外線)的能力遠高于SOD；(7)SOD只能清除超氧陰離子等氧自由基，不能清除羥自由基等多種類型的自由基，而MT可以清除多種類型自由基。
本發(fā)明的人體抗氧化蛋白MT，具有清除多種自由基的功能，不僅能消除氧自由基，還可以清除羥自由基，脂自由基，一氧化氮自由基和其它多種自由基。除清除自由基功能外，本發(fā)明的蛋白MT還具有維持體內(nèi)金屬元素穩(wěn)定，清除或緩解有害金屬對機體造成的損傷；抑制多種因子引起的細胞調(diào)亡作用等功能。
本發(fā)明通過基因工程方法在體外大量獲得所需要的目的蛋白，成本低，提取方便，產(chǎn)品可以高度純化，避免了其它方法大量采伐、消耗植物資源和殺害動物等高成本現(xiàn)象，起到了保護環(huán)境資源的作用。
本發(fā)明采用的人體MT蛋白的另一個優(yōu)點是，人MT蛋白分子量小，蛋白呈剛性，分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易變性，便于提取純化，不易產(chǎn)生抗體，不易對人體產(chǎn)生因蛋白變性引起的副作用，便于各種制劑的制備，便于保存。本發(fā)明產(chǎn)品適應癥廣泛，是一種極具應用價值的生物藥物。
具體實施例方式
實施例1 rhMT的制備MT的基因克隆取人肝組織細胞株，用CDCL210(-5)M體外培養(yǎng)誘導8小時，抽取總MRNA，用反轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄。
PCR擴增引物設計上游P15’-GAATTCTAGCCGCCTCTTCAGCTCGCCATGGAT-3’下游P25’-TGTAGACCCTCGCCCCGACAGGGTCGTAGT-3’擴增反應條件引物50Pmol，dNTP100μmol/L，TAG酶2U。按照94C30s，55C30s，72C45s反應30個循環(huán)。
克隆轉(zhuǎn)化將上述擴增產(chǎn)物，用EcoRl和Pstl酶切，質(zhì)粒pUCl8用同樣的酶切，目的片段回收后，用T4DNA連接酶連接構(gòu)成重組質(zhì)粒pUCl8-MT，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中。對轉(zhuǎn)化的目標cDNA測序與已知序列比較確認。
細菌培養(yǎng)；轉(zhuǎn)化菌接種于含Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6-0.8，加入IPTG至終濃度1mmolL/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時，收集菌體，進行SDS-PAGE分析。
其它工程菌中的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒PUCl8-MT，酶切后，與溫度誘導工程菌或酵母菌(如比赤酵母)的質(zhì)粒酶切后重組，后者轉(zhuǎn)化到相應的菌中，按該菌培養(yǎng)誘導條件發(fā)酵培養(yǎng)和MT表達誘導。
MT的提取純化上述收集的菌體，加適量PBS緩沖液，4℃或冰浴超聲破碎，離心，收集上清，沉淀加入適量PBS緩沖液，再離心，收集上清液，合并上清液。過濾，收集濾液。82℃加熱，出現(xiàn)沉淀后，立即放入冰浴，離心4800g20min，取上清液。加入預冷的丙酮，使終濃度為40％，2小時后離心去除沉淀，取上清液。再加預冷丙酮致濃度80％，放置過夜。離心27000g25min，棄上清液，沉淀溶解在5mMTris-HCL(pH8.6)，離心，棄除沉淀。上清液過SephadexG-75柱，用5mMTris-HCL(pH8.6)洗脫，流速為17mL/h。UV吸收254nm。收集目標組分(電泳和抗氧化檢測)，MT組分再過離子交換柱TSKDEAE-650柱，用20-350mMTris-HCL(pH8.6)洗脫，流速為50mL/h，254nm紫外檢測，收集MT組分，用SephadexG-25柱層析脫鹽。收集MT組分，冷凍干燥。得到MT純品。
實施例2 粉針劑制備將按實施例1方法制得的含90％以上純度的MT溶解在滅菌的0.85％NaCL液體中，加入人血白蛋白終濃度為0.5％，加入甘露醇終濃度為4％，加適量吐溫-80后，混勻，0.22μm濾膜過濾滅菌，分裝在無菌小瓶中，冷凍干燥，密封后，得產(chǎn)品。MT含量終濃度為每瓶0.5mg。
實施例3 片劑制備將實施例1方法制得的MT和甘露醇溶解在無菌水中，加入藥用環(huán)糊精，混勻后，干燥，加入制片的常用輔料，混勻后，壓片，得MT片劑。每片含0.5mg，甘露醇終濃度為4％。
實施例4 膠囊劑制備將實施例1方法制得的MT和甘露醇溶解在無菌水中，加入藥用環(huán)糊精，混勻后，制粒，干燥，裝入膠囊。每粒含MT0.5mg。
實施例5 注射液制備按常規(guī)葡萄糖生理鹽水制備方法，同時加入MT，含量為25mg/l。
實施例6 滴劑制備按常規(guī)眼藥水制備方法，有效成分為MT，同時加適量甘露醇，使MT含量為0.02mg/ml。
實施例7 其它制劑如口服液，乳液，霜劑等，均按常規(guī)制備方法，添加適量MT。MT含量為1--40mg/l，或MT含量在1--40mg/g。
權(quán)利要求
1.一種含重組人金屬硫蛋白藥物，其特征在于該藥物是由含量為90％以上重組人金屬硫蛋白和相關的藥用輔料以任意比例制成的各種醫(yī)學上可接受的藥物制劑。
2.一種如權(quán)利要求1所述的含重組人金屬硫蛋白藥物，其特征在于其中所述的藥物制劑包括注射劑、滴劑、片劑、膠囊劑、膏劑和霜劑。
3.一種如權(quán)利要求1所述的含重組人金屬硫蛋白藥物的制備方法，其特征在于其中所述的重組人金屬硫蛋白是通過下述方法獲得的(1)含MT基因質(zhì)粒的獲得人組織細胞株體外培養(yǎng)，誘導，提取總RNA，通過30個循環(huán)的RT-PCR反應，獲得MT目標基因的cDNA，同樣在5’和3’端的非翻譯區(qū)引入酶切位點；酶切后，與相應載體上的酶切位點相連接，獲得含MT目標基因cDNA的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到相應工程菌受體細胞中，擴增質(zhì)粒；(2)質(zhì)粒MT序列鑒定將擴增帶有MT目標基因序列的質(zhì)粒，酶切，電泳分析、純化，收集相關片段測序，以鑒別是否與目標基因序列一致；(3)MT目標基因工程菌的獲得將上述擴增鑒別的質(zhì)粒，酶切，與表達菌質(zhì)粒酶切位點連接，獲得含MT目標基因的表達菌質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到相應的工程菌，培養(yǎng)、篩選含MT目標基因的工程菌，并能通過培養(yǎng)，溫度變化誘導、金屬鋅元素誘導或化學物的誘導表達目標基因產(chǎn)物---重組人金屬硫蛋白；(4)MT提取純化①工程菌細胞發(fā)酵培養(yǎng)，誘導，收集菌體，沉淀，離心，收集沉淀，緩沖液溶解沉淀，過Sephadex分子篩層析，收集分子量一萬以下的組分，加熱和有機溶劑處理，離心去沉淀，揮發(fā)有機溶劑，過DEAE離子交換柱層析，收集MT組分，再進行離子交換柱層析，收集MT組分，冷凍干燥得純品；②鑒別電泳和HPLC測純度，同時進行抗氧化活性測定。
4.一種如權(quán)利要求2所述的含重組人金屬硫蛋白藥物的制備方法，其特征在于其中所述的工程菌為大腸桿菌或各種酵母菌。
5.一種如權(quán)利要求1所述的含重組人金屬硫蛋白藥物在制備治療性藥物中的應用。
6.一種如權(quán)利要求5所述的含重組人金屬硫蛋白藥物的應用，其特征在于該藥物可作為臨床上所需的抗氧化，清除自由基，消炎，抑制細胞調(diào)亡，調(diào)節(jié)體內(nèi)金屬元素平衡的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含重組人金屬硫蛋白藥物、制備方法及臨床中的應用。本發(fā)明公開的重組人金屬硫蛋白(rhMT)，通過大腸桿菌和酵母菌獲得高效表達，成本低，提取方便，產(chǎn)品可以高度純化，避免了消耗大量動植物資源。用本發(fā)明方法制得的rhMT蛋白分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易變性，便于提取純化，便于各種制劑的制備，便于保存，不易對人體產(chǎn)生因蛋白變性引起的副作用。本發(fā)明含rhMT的藥物可作為制備用于臨床上需要的抗氧化，清除自由基，消炎，抑制細胞調(diào)亡，調(diào)節(jié)體內(nèi)金屬元素平衡的藥物的應用，是一種極具應用價值的生物藥物。
文檔編號A61P39/00GK1416893SQ0113204
公開日2003年5月14日 申請日期2001年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月30日
發(fā)明者楊龍春 申請人:楊龍春