專(zhuān)利名稱(chēng)：復(fù)腦素在防治心腦血管疾病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及山萘酚-3-O-蕓香糖苷在制備防治心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用。
該化合物可由菊科植物紅花屬植物紅花(Carthamus tinctorius)、銀杏科植物銀杏(Ginkgo biloba)、鳳仙花科植物鳳仙花(Impatiens balsamina)五加科植物異株五加(Acanthopanax sieboldianus)等植物中提取制得。據(jù)報(bào)道，具有鎮(zhèn)痛及抗過(guò)敏活性(The Analgesic Activity of Hedyosmum bonplandianumFlavonoid Glycosides，Cardenas LC，et al.Planta Med，1993，59(1)26～27.Antianaphylactic Effects of the Principal Compounds fromthe White Petals of Impatiens balsamina L.Fukumoto H，et al.Phytotherapy Research，1996，10(3)202～206)，但是，從未有過(guò)用于制備防治心腦血管疾病藥物的報(bào)導(dǎo)。
腦血管病主要是在血管內(nèi)形成血栓，導(dǎo)致腦缺血，從而對(duì)人類(lèi)健康造成嚴(yán)重威脅。研究表明血栓形成的因素有三(1)血管內(nèi)皮損傷；(2)血小板粘附、聚集和釋放反應(yīng)(3)凝血活性增高，血液粘度增加，血流緩慢。防止血液凝固或抑制血小板功能可以預(yù)防血栓形成。具有溶栓、抗凝、降低血粘度、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抑制血小板聚集、等作用的物質(zhì)可以防治心肌梗塞和腦梗塞等心腦血管疾病。我們的研究表明山萘酚-3-O-蕓香糖苷具有溶栓、明顯改善腦缺血大鼠的成活率、改善神經(jīng)損傷癥狀、對(duì)大鼠腦缺血具有較強(qiáng)的保護(hù)作用，同時(shí)，山萘酚-3-O-蕓香糖苷具有明顯的抗凝、降低血粘度、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。因此，山萘酚-3-O-蕓香糖苷可以制成防治心肌梗塞和腦梗塞等心腦血管疾病的藥物和食品。
為了通過(guò)藥理試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明在醫(yī)藥領(lǐng)域中的新用途。
一、對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用試驗(yàn)動(dòng)物為Wistar大鼠40只，雄性，體重250-280g。用栓線法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。將大鼠用10％水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉，頸正中切口，分離、結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及其分支動(dòng)脈。分離右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，沿頸內(nèi)動(dòng)脈向下分離翼顎動(dòng)脈，根部結(jié)扎該分枝。在頸內(nèi)動(dòng)脈近端備線、遠(yuǎn)端放置動(dòng)脈夾，頸總動(dòng)脈分叉處切口，插入4-0尼龍線，其深度為17～20mm，栓線進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，入顱至大腦前動(dòng)脈，阻斷氫大腦中動(dòng)脈所有血流來(lái)源。撤掉動(dòng)脈夾，扎緊備線，外留1cm長(zhǎng)線頭，縫合皮膚。缺血時(shí)尾靜脈注射藥物。缺血2小時(shí)后再灌注，勿需再次麻醉和切開(kāi)皮膚，輕輕提拉所留線頭至有阻力時(shí)提示尼龍線頭端已至頸總動(dòng)脈切口處，血流再通。假手術(shù)組除不插線外，其余步驟同上。再灌注24h后存活鼠，觀察大鼠行為學(xué)變化，進(jìn)行神經(jīng)病學(xué)評(píng)分。行為評(píng)分方法參考Zea Longa的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)0分，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。然后快速斷頭取鼠大腦。在前連合平面切下厚約2mm冠狀腦片，立刻置于2％TTC溶液中，37℃孵育30分鐘。梗塞區(qū)呈現(xiàn)白色，非梗塞區(qū)呈現(xiàn)紅色。用求積儀(C63圖象分析系統(tǒng))測(cè)出各區(qū)面積，并計(jì)算梗塞區(qū)占整個(gè)冠面的百分比(％)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明藥物組明顯改善了腦缺血大鼠的存活率，由模型組的20％提高到60％；從神經(jīng)學(xué)評(píng)分上優(yōu)于模型組；同時(shí)，藥物組非常顯著地降低了腦梗塞面積，由模型組的36.68％±0.98％下降為11.52％±1.32％。上述結(jié)果表明，山萘酚-3-O-蕓香糖苷對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有較強(qiáng)的保護(hù)作用(見(jiàn)表1)。
表1藥物對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

二、對(duì)凝血系統(tǒng)的影響試驗(yàn)動(dòng)物為家兔5只，購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)1個(gè)月，體重(2.5±0.3)kg。
儀器與試劑ST4Bio型半自動(dòng)血液凝固測(cè)定儀(法國(guó)Diagnostica STAGO產(chǎn)品)，抗肝素鈣凝血活酶，部分凝血活酶(上海貝特生物技術(shù)有限公司)，氯化鈣、檸檬酸鈉、戊巴比妥鈉皆為分析純國(guó)產(chǎn)試劑。
試驗(yàn)結(jié)果表明，山萘酚-3-O-蕓香糖苷能明顯延長(zhǎng)凝血酶原時(shí)間和部分凝血活酶時(shí)間，有利于防治血栓形成(見(jiàn)表2)。
表2 山萘酚-3-O-蕓香糖苷對(duì)家兔凝血系統(tǒng)的影響

三、對(duì)血液流變學(xué)的影響試驗(yàn)動(dòng)物為家兔20只，每只2kg，雌雄各半，分成4組，每組5只。
試驗(yàn)儀器為德國(guó)全自動(dòng)LBY-N6A自清洗旋轉(zhuǎn)式粘度計(jì)及其自帶的流變學(xué)軟件平臺(tái)。
實(shí)驗(yàn)方法家兔分別耳靜脈取血4ml，置于肝素干管中，于LBY-N6A自清洗旋轉(zhuǎn)式粘度計(jì)測(cè)量家兔全血粘度、血漿粘度、全血還原粘度、紅細(xì)胞壓積，并通過(guò)粘度計(jì)自帶的流變學(xué)軟件平臺(tái)分析血沉、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、剛性指數(shù)、變形指數(shù)、電泳指數(shù)等。給藥途徑耳靜脈注射。給藥0.5小時(shí)后，再次取血測(cè)量家兔上述各種指標(biāo)，觀察給藥前后上述各指標(biāo)的變化。山萘酚-3-O-蕓香糖苷分兩個(gè)劑量組高劑量組(10mg/Kg)，低劑量組(5mg/Kg)，陰性對(duì)照為溶劑組(2.5ml/Kg)，陽(yáng)性對(duì)照為紅花注射液(2.5ml/Kg)。給藥次數(shù)均單次給藥。
試驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量組顯著降低家兔全血粘度和全血還原粘度(P＜0.05)，并能顯著降低紅細(xì)胞聚集指數(shù)(P＜0.05)，而對(duì)家兔血漿粘度及其它指標(biāo)無(wú)顯著影響(P＞0.05)。血粘度是血液流變學(xué)的重要指標(biāo)，因此，山萘酚-3-O-蕓香糖苷通過(guò)顯著降低全血粘度、全血還原粘度和紅細(xì)胞聚集指數(shù)，而有利于防治血栓形成(見(jiàn)表3)。
表3山萘酚-3-O-蕓香糖苷對(duì)家兔血液流變學(xué)的影響

四、對(duì)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)4～5代，鋪96孔板長(zhǎng)成致密單層，腫瘤壞死因子(TNF)及藥物共孵，四唑鹽(MTT)比色法測(cè)定細(xì)胞存活。492nm處測(cè)吸收度。結(jié)果表明對(duì)照組為0.083±0.003，TNF(200U/ml)為0.0463±0.005，TNF+藥物組(10-4mg/ml)為0.071±0.006，可見(jiàn)山萘酚-3-O-蕓香糖苷對(duì)TNF所致的BAEC的損傷有較好的保護(hù)作用。
五、急性毒性試驗(yàn)昆明種小鼠30只，雌雄各半，體重18～20g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在室溫20±2℃實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)3天后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分成3組，分別灌胃給予山萘酚-3-O-蕓香糖苷1.0、2.0、4.0g/kg體重，立即觀察各劑量組小鼠的反應(yīng)情況及在7天內(nèi)的死亡的數(shù)目，并對(duì)存活和死亡的小鼠進(jìn)行解剖病理檢查，結(jié)果表明，各劑量組小鼠無(wú)死亡，病檢未見(jiàn)明顯異常變化，表明山萘酚-3-O-蕓香糖苷口服具有較高的安全性。
據(jù)資料報(bào)道，山萘酚-3-O-蕓香糖苷還有鎮(zhèn)痛作用、促進(jìn)皮膚色素沉著、抗過(guò)敏作用、抑制RBL-1細(xì)胞的花生四烯酸鹽5-脂質(zhì)氧化酶、抗氧化等活性。
以上試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，山萘酚-3-O-蕓香糖苷對(duì)腦缺血有較強(qiáng)的保護(hù)作用，能夠明顯改善腦缺血大鼠的存活率及神經(jīng)神經(jīng)損傷癥狀，顯著地降低腦梗塞面積，明顯降低血粘度，延長(zhǎng)凝血時(shí)間，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而有效防治心腦血管疾病。而且，無(wú)毒性，使用安全。因此，山萘酚-3-O-蕓香糖苷可用于制備預(yù)防和治療心腦血管疾病的藥物。故本發(fā)明稱(chēng)山萘酚-3-O-蕓香糖苷為復(fù)腦素。
六、山萘酚-3-O-蕓香糖苷的制備方法紅花花冠、銀杏葉、鳳仙花花瓣、異株五加的的葉等，按常規(guī)用60～80％乙醇滲漉提取，浸出液減壓濃縮得浸膏，以3倍量水混懸，按常規(guī)依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取。乙酸乙酯浸膏經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，氯仿∶甲醇(20∶1-1∶1)洗脫，得山萘酚-3-O-蕓香糖苷黃色結(jié)晶，按常規(guī)制備成注射劑、膠囊或片劑等，作為藥物用于防治心腦血管疾病，也可作為食品添加劑用于制備防治心腦血管疾病的功能性食品。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)已知化合物山萘酚-3-O-蕓香糖發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開(kāi)拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。山萘酚-3-O-蕓香糖苷藥理作用較強(qiáng)，其原料來(lái)源豐富、價(jià)廉，制備工藝簡(jiǎn)單，可用于制備預(yù)防和治療心腦血管疾病的藥物以及保健食品。
多種介質(zhì)、賦形劑或稀釋劑可用于本組合物，如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、聚乙二醇、明膠等。制劑中，還可加入潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、矯味劑、懸浮劑、防腐劑等。本發(fā)明的化合物制成的藥品，可使用本領(lǐng)域通常采用的任何制備方法，以達(dá)到對(duì)患者使用后，活性成分發(fā)揮最大藥效的目的。
權(quán)利要求
1.山萘酚-3-O-蕓香糖苷在制備防治心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山萘酚-3-O-蕓香糖苷的應(yīng)用，其特征在于將其與載體混合或包埋，制成組合物，其形式可為片劑、注射劑、懸浮液或溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山萘酚-3-O-蕓香糖苷的應(yīng)用，其特征在于所說(shuō)的載體為乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、聚乙二醇、明膠。
4.根據(jù)權(quán)利要求4所述的山萘酚-3-O-蕓香糖苷的應(yīng)用，其特征在于還可加入潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、矯味劑、懸浮劑、防腐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及山萘酚－3－O－蕓香糖苷在制備防治心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用,經(jīng)研究表明,山萘酚－3－O－蕓香糖苷對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有較強(qiáng)的保護(hù)作用,并能明顯降低家兔血粘度,延長(zhǎng)凝血時(shí)間,保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞,并且無(wú)毒性,使用安全,因而可用于制備防治心腦血管疾病的藥物。
文檔編號(hào)A61K31/7048GK1382446SQ0113194
公開(kāi)日2002年12月4日 申請(qǐng)日期2001年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月22日
發(fā)明者郭美麗, 張戈, 張漢明 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)