專利名稱:微生物組合物及處理土壤的方法
本發(fā)明涉及含光合微生物，特別是藻類的組合物，用其作為覆蓋土壤的作物，可以改善土壤的團(tuán)聚作用。
覆蓋作物之所以能改良土壤，是由于它可以增加土壤的有機(jī)質(zhì)，增強(qiáng)土壤團(tuán)聚作用，控制土壤流蝕及使土壤保存更多的水分。從而有利于經(jīng)濟(jì)作物的生長(zhǎng)。
覆蓋作物分解時(shí)，使土壤增加了有機(jī)質(zhì)。為此目的種植的覆蓋作物稱為“綠肥”。綠肥可以多種形式施用，如在種經(jīng)濟(jì)作物前先種一次豆料植物，或?qū)⒔?jīng)濟(jì)作物與綠肥同時(shí)種植，或?qū)⒃谄渌胤椒N植的植物或樹木的葉和切碎的枝條在經(jīng)濟(jì)作物種植前或后施入土壤，綠肥的好處在于增加土壤中有機(jī)質(zhì)含量，改善土壤微生物和物理性質(zhì)，從而使所種植物能得到更多的養(yǎng)分。
傳統(tǒng)的覆蓋作物的弊有時(shí)大于利。如果使之與經(jīng)濟(jì)作物一起生長(zhǎng)，它們就會(huì)與經(jīng)濟(jì)作物爭(zhēng)水，養(yǎng)分或陽光。如果用它們代替經(jīng)濟(jì)作物，土地的價(jià)值就降低了。此外，要受益于綠肥，還要將常規(guī)的覆蓋作物翻到土壤中，這將使農(nóng)戶耗費(fèi)更多的錢和時(shí)間。
用微生物覆蓋作物就是要克服傳統(tǒng)覆蓋作物的缺點(diǎn)，一些光合微生物，特別是藻類，有助于控制土壤流蝕，增加土壤水分，增強(qiáng)土壤團(tuán)聚作用和增加土壤養(yǎng)分和有機(jī)質(zhì)，減少其鹽分等作用。藻類可簡(jiǎn)單地用于土壤，如與水混合制成懸液，噴撒在土壤上。也可將藻類與經(jīng)濟(jì)作物同時(shí)種植，因?yàn)樵孱惿L(zhǎng)只需幾周而傳統(tǒng)的覆蓋作物需要幾個(gè)月才能長(zhǎng)成，它很少與經(jīng)濟(jì)作物爭(zhēng)養(yǎng)分，水，空間和陽光，也不必將其翻入土中，所以用它作為綠肥。
土壤用藻類可分為綠藻，蘭綠藻，硅藻和黃綠藻。蘭綠藻和綠藻為本發(fā)明的最佳實(shí)施例。
人所共知，很多種藻類特別是綠藻和蘭綠藻科都可以免于脫水(見Trainor，F(xiàn).R.在“藻類學(xué)”1970中第9期111-113頁的文章)。藻類的某些種，諸如墨西哥衣藻(chlamydomonas mexicana)。在環(huán)境營養(yǎng)枯竭時(shí)進(jìn)行有性繁殖，產(chǎn)生一個(gè)具有強(qiáng)抗干旱能力的稱為接合孢子的細(xì)胞類型。(見Lewin，R.A.在“普通微生物雜志”1951中5期926-929頁文章)。
土壤中種植藻類的一個(gè)重要益處是通過土壤顆粒的團(tuán)聚改善土壤結(jié)構(gòu)。(見Bailey D.等人在“藻類學(xué)”雜志1973年第9期99-101頁的文章)。改善土壤的團(tuán)聚作用可使作物根生長(zhǎng)的更好，從而在根區(qū)更有效地輸導(dǎo)養(yǎng)分、水分和氣體，并減少土壤侵蝕，增加土壤保水力。(見Metting，B.等人在“Soil Science Soc.of Amer.J.，1983年47期682-685頁的文章)。
土壤團(tuán)聚作用是由藻類分泌的粘液狀物質(zhì)，粘結(jié)土壤顆粒所引起的。該粘液物質(zhì)被認(rèn)為主要是由作為絮凝劑的多糖組成。目前，對(duì)該粘物質(zhì)中所含多糖及其它物質(zhì)的詳細(xì)性質(zhì)還研究的不多。因此，本申請(qǐng)用絮凝劑一詞來表示由藻類和其它光合微生物產(chǎn)生的土壤凝聚材料的特性。
美國專利3，969，844中Fogel等人揭示了用藻類產(chǎn)生的某些絮凝劑處理土壤的方法，敘述了氨缺乏狀態(tài)導(dǎo)致產(chǎn)生藻類絮凝劑。
美國專利3，958，364中Schenck等人也報(bào)道了氮素?fù)p失到一定程度會(huì)增加藻類絮凝劑產(chǎn)生的特性。
氮素消耗的步驟有很多問題，它即費(fèi)時(shí)，經(jīng)濟(jì)效益又低，也很難用農(nóng)業(yè)機(jī)械監(jiān)測(cè)和控制。
維持和運(yùn)輸大量營養(yǎng)期或生長(zhǎng)期的藻類也出現(xiàn)有害微生物的污染問題。此外，要保持藻類的存活力在其生長(zhǎng)時(shí)必須經(jīng)常監(jiān)測(cè)和及時(shí)補(bǔ)充養(yǎng)分供應(yīng)。還必須觀察藻細(xì)胞密度以保證其接受足夠的光照。還需長(zhǎng)期保持空氣和二氧化碳的供應(yīng)。此外，貯存和運(yùn)輸大量用于改良土壤的藻類是非常昂貴的。由于產(chǎn)品的體積和重量至少一半的成本用于運(yùn)輸。而且在約14天內(nèi)藻類存活力嚴(yán)重喪失。運(yùn)輸成本高和貯存期限有限限制了產(chǎn)品的實(shí)際地理分布范圍。特別是不能出口。
藻類除了能改善土壤的團(tuán)聚作用外，還可用于固氮。特別是一些蘭綠藻用于水稻田就是為此目的。(見Roger，P.A.和Kulasooriya，S.A.，文章“蘭綠藻和水稻”《馬尼拉國際水稻研究所，1980年》49-50頁，下稱Roger和Kulasooriya。)這些產(chǎn)品也不能分散在水中或勻一施用于土壤中，僅能用于水稻田。而實(shí)際上除水稻外大多經(jīng)濟(jì)作物都是種植在旱地中。
申請(qǐng)人:驚奇地發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生絮凝劑的光合微生物的組合物，其制備方法及用它生產(chǎn)微生物覆蓋作物能克服上述組合物和方法的缺陷，申請(qǐng)人發(fā)明了含抗旱，休眠，產(chǎn)生絮凝劑的光合微生物的組合物能簡(jiǎn)易而廉價(jià)地運(yùn)輸?shù)饺魏蔚胤?，并能容易而均一地施用于旱地，例如可制成懸液噴撒在田中的組合物。結(jié)果運(yùn)輸該組合物成本可降低至少一半，甚至10倍，該組合物的貯存期限至少增加兩周到6個(gè)月，有的甚至達(dá)18個(gè)月。申請(qǐng)人還發(fā)明了制備該組合物的方法，及用它們作覆蓋作物和改善團(tuán)聚作用的方法。最后，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，與先有技術(shù)相比，不必在產(chǎn)生大量絮凝劑之前使?fàn)I養(yǎng)期的一些藻類得不到氮素。
根據(jù)本發(fā)明，還提供一種組合物，它包括靜止期的干的，可流動(dòng)的產(chǎn)生絮凝劑的光合微生物和一種干的，顆粒狀的，能在水中分散的載體。該組合物能均一施用于干燥土壤中，使上述營養(yǎng)期的微生物成為一種覆蓋作物，從而通過上述絮凝劑的作用改善土壤團(tuán)聚作用。
本發(fā)明還提供生產(chǎn)干的可流動(dòng)的微生物組合物的方法，該組合物包括在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)著的產(chǎn)絮凝劑的光合微生物;誘發(fā)該微生物進(jìn)入靜止期，從而得到干的可流動(dòng)的組合物，具體步驟如下(a)將所述微生物與干的、顆粒狀的，在水中分散的載體混合;
(b)將所述微生物與培養(yǎng)基分開，干燥分開后的微生物，制成塊狀，再使其分散成顆粒狀，從而制成干的，可流動(dòng)的組合物;或(c)選擇藻類作為所述微生物，使該藻類生長(zhǎng)在含營養(yǎng)的其質(zhì)中(培養(yǎng)基中)，基質(zhì)中養(yǎng)分能使該藻類形成接合孢子，將接合孢子與基質(zhì)分開，將其與干的顆粒狀的水分散載體混合;從而得到一組合物，它能均一地施用于干燥土壤中，生長(zhǎng)成覆蓋作物，通過所說絮凝劑改善土壤的團(tuán)聚作用。
在另一優(yōu)選的實(shí)施例中，組合物由至少兩種分別生長(zhǎng)在培養(yǎng)基中的不同種藻類的純培養(yǎng)物組合生產(chǎn)的，將其與培養(yǎng)基分開，將分離的不同種藻類混合，通過將混合的藻類與干的顆粒狀，在水中可分散的載體混合，誘使其進(jìn)入靜止期，生成干燥，可流動(dòng)的組合物，它可被均一地施用于干燥土壤中，以提供覆蓋作物并改善土壤團(tuán)聚作用。在另一特定的優(yōu)選實(shí)施例中，通過將分離出的藻類噴撒到干燥、顆粒狀、在水中能分散的載體上而使藻類與載體混合，誘使藻類進(jìn)入靜止期。
在一個(gè)可選擇的實(shí)施例中，組合物是如下步驟得到的，先使藻類生長(zhǎng)在培養(yǎng)基中，再增加培養(yǎng)基的養(yǎng)分，誘導(dǎo)處于靜止期的藻形成接合孢子，將接合孢子與培養(yǎng)基分開，再將分開的接合孢子與干燥、顆粒狀、在水中能分散的載體混合，生產(chǎn)出干燥、可流動(dòng)的組合物。它可被均一地施用于干燥的土壤，以提供覆蓋作物，改善土壤團(tuán)聚作用。
在另一個(gè)可選擇的實(shí)施例中，是使產(chǎn)生絮凝劑的光合微生物生長(zhǎng)在培養(yǎng)基中，然后將微生物與培養(yǎng)基分開，通過干燥誘導(dǎo)它進(jìn)入靜止期，從而產(chǎn)生一團(tuán)靜止期藻類，再進(jìn)一步干燥使其成為干燥的、可流動(dòng)的組合物。它可被均一地施用于干燥的土壤，以提供覆蓋作物，改善土壤團(tuán)聚作用。
本發(fā)明還提供一種覆蓋作物改善土壤團(tuán)聚作用的方法，包括將產(chǎn)生絮凝劑的營養(yǎng)期藻施用于干燥土壤中，其中所述藻能產(chǎn)生足夠量的絮凝劑使土壤顆粒團(tuán)聚，又不導(dǎo)致氮素缺乏。在某些情況下，土壤中可能需要足夠的水份使藻類能繼續(xù)繁殖。優(yōu)選的營養(yǎng)期藻類選自下列一組的一個(gè)或多個(gè)種地木耳，墨西哥衣藻或是Sajao衣藻。
本發(fā)明涉及將微生物組合物施用于土壤，以提供覆蓋作物及改善土壤團(tuán)聚作物。該組合物包括靜止期的產(chǎn)生絮凝劑的光合微生物干燥、可流動(dòng)的混合物和干燥、顆粒狀、在水中能分散的載體，該組合物能均一地施用于干燥土壤，以提供營養(yǎng)期的微生物覆蓋作物，通過絮凝劑的作用改善土壤的團(tuán)聚作用。組合物還可以包括干燥、顆粒狀的其它材料，如各種植物營養(yǎng)素，特別是化肥。某些情況下，如該組合物施用于營養(yǎng)缺乏的土壤時(shí)，也可在組合物中提供光合微生物的養(yǎng)分。
本發(fā)明的光合微生物是任意能產(chǎn)生絮凝劑的微生物，它們可利用葉綠素借助光能將二氧化碳，一些養(yǎng)分和無機(jī)氮素轉(zhuǎn)化成細(xì)胞的成分。這種微生物突出的例子是藻類，特別是綠藻和蘭綠藻，它們是本發(fā)明組合物優(yōu)選的微生物。利用遺傳操作的任何方法得到的具光合作用或能產(chǎn)生絮凝劑的微生物都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，組合物包含一個(gè)或多個(gè)綠藻或蘭綠藻的菌株。一般來說，優(yōu)先選用幾種菌株的混合物，從而該組合物可用于各種類型的土壤。在PH約4-7的土壤上，綠藻比蘭綠藻生長(zhǎng)得好。而在PH約7-9的土壤上蘭綠藻比綠藻生長(zhǎng)得好。組合物最好至少含一株蘭綠藻和至少一株綠藻。這里所用株(菌株)是分類學(xué)種的亞單位。
為保證組合物質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益，藻類通常要純株培養(yǎng)，即某特定種或株在培養(yǎng)基生長(zhǎng)時(shí)排除其它種，甚至同種其它株而保持純株。然后再收集各純株，將其混合成處理土壤組合物。在優(yōu)選實(shí)施例中，組合物含有至少兩種不同的純株，它們選自下列的一個(gè)或多個(gè)屬衣藻屬、小球藻屬、念珠藻屬、顫藻屬，隱球藻屬(Aphanocapsa)，隱桿藻屬(Aphanothece)，裂須藻屬或微鞘藻屬。一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例包括一個(gè)至少兩種不同的純株的混合物，這些純株選自下列一組中一個(gè)或多個(gè)種雪衣藻，蛋白核小球藻，多育顫藻或構(gòu)巢隱桿藻。另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例含地木耳的一個(gè)純株及選自上面提及的任一個(gè)或多個(gè)種的至少一個(gè)菌株。
在一個(gè)最佳實(shí)施例中，選擇了那些絮凝劑的產(chǎn)量比其他株的綠藻或藍(lán)綠藻高的綠藻的藍(lán)綠藻。由于產(chǎn)生絮凝劑的方式和絮凝劑本身的物理性質(zhì)的可變性，要明確規(guī)定測(cè)定高的絮凝劑產(chǎn)量的標(biāo)準(zhǔn)是困難的。藻細(xì)胞產(chǎn)生并分泌絮凝劑致使在細(xì)胞周圍形成粘液樣的鞘。某些類型的藻類在幾小時(shí)內(nèi)就能產(chǎn)生這樣的鞘，而另一些類型的藻類則需幾天。有時(shí)這個(gè)鞘可相當(dāng)容易地與細(xì)胞分離，并可測(cè)定分離的絮凝劑的體積和重量。其他時(shí)候，難于使鞘分離，并且必須依靠目測(cè)。
申請(qǐng)人:已用下列測(cè)定法選擇高產(chǎn)絮凝劑的藻類。在有利于其絮凝劑最高產(chǎn)量的條件下培養(yǎng)不同種或菌株的藻類。將大約0.5ml的藻類懸浮液加入到一個(gè)裝有大約10ml水的四英寸寬的陪氏培養(yǎng)皿中。在培養(yǎng)皿底部是大約0.5g研得很細(xì)的，試劑級(jí)的純高嶺粘土。在將藻的懸浮液加入到培養(yǎng)皿中以后，以大約每分鐘40-50轉(zhuǎn)的速度用手旋動(dòng)培養(yǎng)皿數(shù)次，并目測(cè)粘土的團(tuán)聚作用。這樣的團(tuán)聚作用大約在15秒鐘之內(nèi)發(fā)生，出現(xiàn)團(tuán)聚體。導(dǎo)致這種團(tuán)聚作用的藻類被認(rèn)為是絮凝劑的高產(chǎn)者，而不能導(dǎo)致這種團(tuán)聚作用的藻類則被認(rèn)為是絮凝劑的低產(chǎn)者。已證明絮凝劑的高產(chǎn)者在土壤中生長(zhǎng)一段足夠的時(shí)間后，一般2-6周就能產(chǎn)生足夠量的使土壤顆粒團(tuán)聚的絮凝劑。
在本發(fā)明組合物中的藻類是處于靜止期的。與處于營養(yǎng)期的可生長(zhǎng)并繁殖的藻類相反，處于靜止期的藻類基本上是休眠的。細(xì)胞可部分或全部變干或可以孢子的形式存在，細(xì)胞壁很厚并對(duì)環(huán)境有耐受性。在這個(gè)時(shí)期，藻類可幸免于脫水和不受其它極端環(huán)境的影響。有關(guān)藻類干燥時(shí)可進(jìn)入休眠期或靜止期，然后通過加水復(fù)活再進(jìn)入營養(yǎng)期的生理機(jī)制尚未完全搞清。在此期不同種的藻類似乎采取不同的形式，而許多其他藻類不能進(jìn)入靜止期以免于脫水。因此，在這里所用的“靜止期”一詞是指藻類或其他光合微生物當(dāng)干燥時(shí)所進(jìn)入的任何形成或生理狀態(tài)以使之幸免于脫水并當(dāng)重新變濕時(shí)再進(jìn)入營養(yǎng)期。能夠進(jìn)入靜止期的藻類通常具有相當(dāng)高的存活率，即，90～95%的細(xì)胞能重新進(jìn)入營養(yǎng)期，不能進(jìn)入靜止期的藻類存活率極低。即使有，也幾乎不能幸免于脫水。
如前所述，在靜止期不同的種具有不同的形式。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞似乎可通過簡(jiǎn)單的干透從營養(yǎng)期直接進(jìn)入靜止期。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，其它種的藻類可僅在培養(yǎng)基中的養(yǎng)分被控制后進(jìn)入靜止期以便使藻類開始有性生殖，形成合子。然后合子發(fā)展為厚壁的，耐受環(huán)境的，稱為接合孢子的休眠細(xì)胞，這些休眠細(xì)胞能幸免于脫水。
在本發(fā)明的組合物，將產(chǎn)生絮凝劑的光合微生物與一種干燥的，顆粒狀的，水分散性載體混合。這些組合物是干燥的，可流動(dòng)的，并能均勻施用于干燥的土壤。這里所用的“能均勻施用”一詞是指能均勻分散在使覆蓋作物生長(zhǎng)的整個(gè)面積的土壤表面。這里所用的“水分散性”一詞是指能溶解在水中或在水中形成懸浮物。
可使用任何干燥的，顆粒狀的，和水分散性載體。載體不需為惰性的，但不應(yīng)有毒性或有害于微生物。例如這樣的載體包括乳清，瓜耳膠，阿拉伯膠，瓊脂，麥芽糊精，乳糖和細(xì)粒粘土。最好是乳糖或細(xì)粒粘土。當(dāng)粘土是載體時(shí)，可使用其顆粒是水分散性的干燥粘土。粘土顆粒的直徑最好為約0.1微米到約5微米。一種該類型的粘土是硅鎂土粘土，99.7%的這種粘土可通過一個(gè)325號(hào)篩網(wǎng)。
本發(fā)明的組合物能夠施用于干燥土壤。這里所用的“干燥土壤”一詞是指不被水淹沒的土壤，更確切地說，這個(gè)詞是指含水量為田間持水量的100%-0%的土壤。田間持水量是使土壤浸透2或3天后并在確實(shí)停止自流排水后保留在土壤中的水的百分率。
本發(fā)明組合物的藻類一般在土壤含水量至少為田間持水量的55%時(shí)生長(zhǎng)最好。然而，藻類一般生長(zhǎng)在含水量大約低于田間持水量40%的土壤中。田間持水量在約40%以下時(shí)，在土壤獲得額外的水分之前藻類將停留在或重新進(jìn)入靜止期。因此，本發(fā)明組合物的優(yōu)點(diǎn)之一是可將其施用于很干的(小于40%的田間持水量)地里而不需要另加水。農(nóng)民可依靠自然降雨而不用另加水，此外，如果藻類生長(zhǎng)并產(chǎn)生絮凝劑，然后土壤的含水量降到40%的田間持水量以下，則在含水量增加之前藻類可進(jìn)入靜止期。
用下列方法生產(chǎn)本發(fā)明的組合物(a)在一個(gè)含有養(yǎng)分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生絮凝劑的光合微生物;和(b)將微生物與一個(gè)干燥的，顆粒狀的，水分散性載體混合而使微生物進(jìn)入靜止期。在得到的組合物中，多的微生物都粘附到載體的顆粒上或粘附在這種顆粒收集物的內(nèi)部。在一個(gè)較好的實(shí)施例中，微生物在與誘導(dǎo)靜止期的載體混合前基本上從培養(yǎng)基中分離出來了。
在將微生物與載體混合后，組合物基本上是干燥的。必要的話，可通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)在可維持細(xì)胞生存力的中溫下進(jìn)一步使之干燥，例如，可將組合物放入平皿中并通過使干燥空氣通過其上方進(jìn)一步使之干燥?？諝獾臏囟葢?yīng)不高于大約65℃，并最好在約25℃～35℃的范圍內(nèi)。在此范圍之內(nèi)，干燥時(shí)間約為0.5～2小時(shí)。為了完成干燥可適用加熱燈或干燥鼓。
本發(fā)明方法一般可生產(chǎn)顆粒形式的，能夠分散在水中的組合物，這些組合物可均勻施用于干燥的土地上。然而，在某些情況下，可能有必要或需要使顆粒進(jìn)一步減小。為使顆粒減小可伴隨有破碎，研磨，粉化，或任何本領(lǐng)域已知的方法，只要這樣的方法可維持靜止期的微生物在水分充足時(shí)進(jìn)入營養(yǎng)期的能力。
在本發(fā)明方法中所用的生物是前面所述的組合物。
組合物一般最好含有不同株藻類的混合物。生產(chǎn)該混合物的最好方法是在含有養(yǎng)分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少兩種，基本上純的藻類培養(yǎng)物，從培養(yǎng)基中基本上分離出來，將基本分離出的藻類混合，并通過將其與一個(gè)干燥的，顆粒狀的，具水分散性載體混合誘導(dǎo)混合藻進(jìn)入靜止期，生產(chǎn)所需的組合物。在一個(gè)可選擇的實(shí)施例中，通過將某種不同的，基本分離的藻類與一個(gè)干燥的，顆粒性水分散載體混合而誘導(dǎo)每種藻進(jìn)入靜止期而產(chǎn)生中間組合物，將中間組合物生產(chǎn)所需的組合物。
用本領(lǐng)域已知的技術(shù)培養(yǎng)生產(chǎn)絮凝劑的光合微生物。例如在Schenck等人的3，958，364號(hào)美國專利，和Porter等人的3，889，418號(hào)美國專利中提出了培養(yǎng)綠藻和藍(lán)綠藻的方法?？偟膩碚f，為了使藻類增殖在有充足的光，養(yǎng)分，氧，和二氧化碳的條件下在3785-5678升(1，000-1，500加侖)的生產(chǎn)罐中培養(yǎng)藻類。水在最初被加入到罐里時(shí)經(jīng)過了滅菌、過濾和脫氯。將水在罐中不斷混合。二氧化碳從水中逸出而使藻類生長(zhǎng)并較其它情況使藻類維持更高的密度。在18小時(shí)光和6小時(shí)暗的循環(huán)中提供人造光，盡管可使用其它光控制，包括連續(xù)的光。
使藻類的所有種都保持在富含氮，鉀，磷和微量養(yǎng)分的瓊脂斜面上。由于一系列中間培養(yǎng)物按比例擴(kuò)大以適用于體積約為1，000加侖的培養(yǎng)物通常是必要的。
使生產(chǎn)罐中的藻類生長(zhǎng)到大約每m110個(gè)細(xì)胞的最大密度。一旦達(dá)到這個(gè)最大密度，就必須每天收集一些細(xì)胞以維持一個(gè)穩(wěn)定，旺盛的培養(yǎng)。對(duì)綠藻來說，每天收集40%～60%的體積并用滅菌的，濾過的，脫氯的水補(bǔ)足到原體積。對(duì)藍(lán)綠藻來說，每天收集大約10%～30%的體積。
藻類被收集以后，可將其直接與載體混合并干燥。然而，最好將藻類從培養(yǎng)基中基本分離出來?？赏ㄟ^任何方法進(jìn)行分離，這些方法包括離心，沉降，使用收集篩，和從培養(yǎng)基的表面撇去細(xì)胞。最好通過離心分離綠藻。用這種方法可除去大約95%體積的水，產(chǎn)生一種藻的糊狀物。可通過加壓滅菌，濾過，脫氯，水流從離心機(jī)中移出糊狀物而形成綠藻漿。然后使這種漿與載體混合。
也可將綠藻離心，但絲狀的種會(huì)阻塞機(jī)器。因此，與培養(yǎng)基分離的最好方法是停止混合細(xì)胞，于是它們就會(huì)沉在容器的底部成為一團(tuán)。通過容器底部的一個(gè)排水口移出該團(tuán)塊。
藍(lán)綠藻也可通過將漿傾入一個(gè)底部有濾網(wǎng)的收集盤從培養(yǎng)基中分離出來。然而，必須經(jīng)常用無菌水回流濾網(wǎng)以防阻塞。
對(duì)于被光吸引的趨光細(xì)胞還可采用另一種方法。這些細(xì)胞主要是綠藻。當(dāng)停止培養(yǎng)物的混合并連續(xù)照光時(shí)，最后就會(huì)在其表面出現(xiàn)一個(gè)厚的，濃縮的細(xì)胞層。然后將這層細(xì)胞撇掉。
在一個(gè)較好的實(shí)施例中，通過將細(xì)胞與載體混合而誘使分離細(xì)胞進(jìn)入靜止期。在一個(gè)最佳實(shí)施例中，將藻類噴灑到載體分散體上而與載體混合。藻類可以是兩種或多種菌株的混合物，并且可在與載體噴灑-混合前或噴灑-混合時(shí)將這樣的菌株混合，藻類和載體以任何體積比噴灑-混合可生成一種基本干燥的混合物。一般說來，該比例是約為1-5%的藻的漿液體積比約99-95%的載體體積。如前所述，可通過任何方法使得到的混合物干燥的維持處于靜止期細(xì)胞的最大存活力。
在一個(gè)可選擇實(shí)施例中，通過控制培養(yǎng)其中的養(yǎng)分而誘使藻類進(jìn)入靜止期。這可伴隨著使氮的水平降低，從而導(dǎo)致某些綠藻經(jīng)歷有性生殖。例如，可從標(biāo)準(zhǔn)Bristol培養(yǎng)基中除去Na NO，通常所說的異序列的某些種形成兩種不同的接合型，即通常所說的接合型正型和接合型負(fù)型。不同的類型接合形成合子。通常所說的同序列的另一些種只形成一種接合型，它們也接合形成合子。對(duì)于任一種類型，合子都經(jīng)過一系列復(fù)雜的變化，導(dǎo)致厚壁，耐受環(huán)境的，稱為接合孢子的休眠細(xì)胞的形成。如上所述最好通過離心或過濾從培養(yǎng)基中移出接合孢子。然后如上所述將它們與載體混合，用于本實(shí)施例的一種最好的藻是墨西哥衣藻。
最好將這種方法應(yīng)用于分離不同菌株的接合孢子形成的藻培養(yǎng)物，形成這樣的接合孢子。然后將接合孢子基本上從培養(yǎng)基中分離出來，混合在一起，然后與載體混合?？蛇x擇的方法是將不同菌株的分離接合孢子分別與載體混合形成中間組合物，然后將中間組合物，形成本發(fā)明的組合物。還有另一種可供選擇的方法，可將分離的接合孢子與從使之生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中分離出來的未形成接合孢子的藻混合。然后再將此混合物與載體混合生產(chǎn)組合物。
如果藻類是一個(gè)異宗配合的種，可在不同的缸中培養(yǎng)正和負(fù)接合型。在營養(yǎng)期過程中，重要的是保持培養(yǎng)物活躍生長(zhǎng)以便它們不形成配子細(xì)胞，這需要保持氮的水平高得足以維持營養(yǎng)期。當(dāng)藻類達(dá)到所需的密度時(shí)，可將正和負(fù)接合型一起混合并且使氮的水平降低以便促進(jìn)接合或有性生殖。從缸中取出樣品，用顯微鏡觀察此過程。當(dāng)適當(dāng)百分?jǐn)?shù)的細(xì)胞形成接合孢子時(shí)，將接合孢子從培養(yǎng)基中移出來。
同樣的方法被用于誘導(dǎo)同序列藻類形成接合孢子。然而，要在一個(gè)單個(gè)缸中培養(yǎng)藻類。
在另一個(gè)實(shí)施例中，藻類或其它產(chǎn)生絮凝劑的光合微生物的某些種可被直接干燥而不需同時(shí)與載體混合，而誘導(dǎo)進(jìn)入靜止期。確切地說，如上所述在培養(yǎng)基中培養(yǎng)藻類并將其從培養(yǎng)基中分離出來，然后在中溫下使之干燥。例如，它們可用加熱燈或干燥空氣干燥。經(jīng)過干燥產(chǎn)生一個(gè)通常硬而脆的干燥團(tuán)塊。可將該團(tuán)塊破碎成顆粒。這些顆粒不需與載體混合，但可通過將它們簡(jiǎn)單地懸浮在水中并將這種懸浮液加到土壤中而施用于土壤。這個(gè)實(shí)施例最適用于綠藻和非絲狀的藍(lán)綠藻，因?yàn)榻z狀團(tuán)塊不易破碎成顆粒。對(duì)于這個(gè)實(shí)施例可選用的種有雪衣藻，蛋白核小球藻，和構(gòu)巢隱桿藻(Aphanothce nidulans)。
用本發(fā)明的組合物提供一種覆蓋作物并改善土壤的團(tuán)聚作用。這需要將組合物均勻施用于干燥的土壤。如果土壤中有足夠的水分，則組合物中靜止期的產(chǎn)生絮凝劑的光合微生物就會(huì)進(jìn)入營養(yǎng)期，繁殖，并產(chǎn)生絮凝劑。如果土壤中的水分不夠充足，可將它加入。也可加入養(yǎng)分，盡管這對(duì)多數(shù)土壤來說一般是沒必要的。
當(dāng)微生物是藻類時(shí)，充足的水分約為田間持水量的40%或更多。然而，對(duì)于生長(zhǎng)旺盛的藻類，土壤表面的含水量應(yīng)至少約為土壤的田間持水量的50%。必要的話，可維持土壤中的水分和養(yǎng)分以便藻類繼續(xù)旺盛生長(zhǎng)，盡管這一般來說是沒必要的。此外，如前所述，沒有必要在最初加入或維持一定水平的氮，然后使氮耗盡用來使藻產(chǎn)生足量的絮凝劑而使土壤顆粒團(tuán)聚。
可用任何方法施用這些組合物以使它們廣泛分散并均勻施用到土壤中，最好將這些組合物在施用的地點(diǎn)或附近與水混合形成懸浮液，然后將懸浮液噴灑到地里，例如通過原有的灌溉系統(tǒng)噴灑。水應(yīng)基本上沒有氯，氯能夠殺死細(xì)胞。細(xì)胞的濃度應(yīng)至少為每平方厘米土壤表面含100個(gè)細(xì)胞。最好加入每平方厘米土壤表面約含250～1，000個(gè)細(xì)胞濃度的懸浮液。
在一個(gè)可選擇的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種覆蓋作物及用它改善土壤團(tuán)聚作用的方法，該方法包括將處于營養(yǎng)期的產(chǎn)生絮凝劑的藻施用于干燥的土壤，其中藻類在不喪失氮時(shí)能夠產(chǎn)生絮凝劑。因此不需使細(xì)胞的氮維持在大約10%(重量比)，然后降到5%(重量比)。在這個(gè)實(shí)施例中，營養(yǎng)期的藻類可以是單一的菌株或不同菌株的混合物?？蛇x擇的較好的菌株有念珠藻屬或衣藻屬。最好是地木耳，墨西哥衣藻，或Sajao衣藻這些種，并且可從任何一種或多種的這些菌株中選擇最佳的菌株。細(xì)胞的濃度至少為每平方厘米土壤表面含100個(gè)細(xì)胞并且最好為每平方厘米土壤表面含大約250-1，000個(gè)細(xì)胞，必要時(shí)，土壤水分和/或除了氮以外的養(yǎng)分可被增加或維持以便藻類繼續(xù)增殖。土壤水分應(yīng)維持在至少為田間持水量的40%并最好約為田間持水量的50-100%。
實(shí)施例1制備含有處于靜止期的蛋白核小球藻組合物將20升含有約5×106個(gè)細(xì)胞/毫升的小球藻接種物和1升濃縮藻的營養(yǎng)培養(yǎng)基加入到含有1，000加侖無菌的，濾過的，脫氯水的生產(chǎn)罐中。不斷混合罐中的水將二氧化碳加到水中。用5只架在罐的上方的1000瓦的汞-囟燈在18小時(shí)亮和6小時(shí)暗的循環(huán)下給培養(yǎng)物照光。大約6天后，細(xì)胞的密度最大。收集50%的體積并用無菌的，濾過的，脫氯水補(bǔ)足到約1，000加侖的原體積。
用一個(gè)每小時(shí)可處理900加侖流料的乳品澄清器離心收集細(xì)胞。通過離心除去約95%(體積比)的水，藻的糊狀物留在離心機(jī)轉(zhuǎn)筒中。停機(jī)，拆卸機(jī)器，并在壓力下用無菌的，濾過的，脫氯水沖洗到接受桶中，產(chǎn)生15升密度為2×103個(gè)細(xì)胞/毫升細(xì)胞以上的藻漿。
在一個(gè)含有50磅粘土的槳式混合機(jī)中將漿液噴灑到硅鎂土粘土上?；旌蠙C(jī)包括4片槳葉，以48rpm的速度混合材料。將大約1%(體積比)的漿液加入到大約99%(體積比)的粘土中。這樣可產(chǎn)生一個(gè)充分混合的干燥產(chǎn)物，可通過將混合物放入一個(gè)3英尺×2英尺×3英寸的平皿中并使80°F的干燥空氣通過其上方2小時(shí)可進(jìn)一步干燥。移出試驗(yàn)樣品后，將組合物放入一個(gè)塑料容器中，密封，并貯存在室溫下。
再濕潤樣品并噴灑到瓊脂平板上測(cè)定藻的存活力。在7天之內(nèi)藻類重新開始營養(yǎng)生長(zhǎng)。
實(shí)施例2制備含有墨西哥衣藻接合孢子的組合物在標(biāo)準(zhǔn)瓊脂固化培養(yǎng)基上通過在大約20℃時(shí)的連續(xù)光照，培養(yǎng)該藻類菌株的相反接合型。在細(xì)胞達(dá)到一個(gè)旺盛的群體密度以后，從瓊脂培養(yǎng)基中移出這兩種接合型并分別懸浮在Bristol培養(yǎng)基中培養(yǎng)直到其達(dá)到大約106個(gè)細(xì)胞/毫升的密度為止，結(jié)果可獲得數(shù)目大致相等的相反的接合型。
然后將兩種接合型培養(yǎng)物一起混合并使之繼續(xù)在Bristol培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，使培養(yǎng)物在大約20℃下連續(xù)照光。由于細(xì)胞繼續(xù)無性分裂，所以培養(yǎng)物變成一個(gè)較暗的綠色。不需向培養(yǎng)物中加入額外的養(yǎng)分去補(bǔ)充消耗掉的養(yǎng)分。培養(yǎng)物呈現(xiàn)淺黃色就表明養(yǎng)分開始不足，幾天之后，培養(yǎng)物開始變?yōu)闇\棕色，顯微鏡觀察表明淺棕色的出現(xiàn)是與接合孢子的形成相關(guān)連的。樣品的定期顯微鏡觀察顯示了21天后接合孢子的百分?jǐn)?shù)達(dá)到一個(gè)最大值，可看到接合孢子的產(chǎn)量約為10%。
這是，將培養(yǎng)物離心并倒掉上清液，剩余的漿是暗棕色的。然后從離心機(jī)中移出這種由將近100%的接合孢子組成的漿，散布在玻璃平面上，保持在氯化鈣中，并在暗處放置，將這種材料大約放置1周，在此期間水可蒸發(fā)。然后將這種接合孢子材料用手工操作從玻璃平皿中刮下來。這時(shí)，它具有木屑的稠度。
將樣品粉末放在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中進(jìn)行這種材料的萌發(fā)試驗(yàn)?？捎^察到75%以上的萌發(fā)百分率。將這些細(xì)胞保存大約8周萌發(fā)百分率沒有明顯的下降。
實(shí)施例3靜止期藻類應(yīng)用于土壤實(shí)驗(yàn)點(diǎn)和方法通過控制衣阿華州杰裴遜地區(qū)的光禿土壤中的水分含量，在陰涼大棚下測(cè)定了干旱對(duì)試驗(yàn)藻類菌株的影響。該土壤被鑒定為Haig和Grundy，粉砂粘壤土。
1)大棚的設(shè)計(jì)將0.01cm(4密耳)的白色塑料大棚安裝在試驗(yàn)田上。建造三個(gè)隔離的18.3cm×3m(60英尺×10英尺)的建筑物以覆蓋試驗(yàn)田，大棚離地面1.4至1.5米(4 1/2英尺-5英尺)高以避免雨水落到試驗(yàn)田內(nèi)，每一試驗(yàn)田為1.2米×0.6米(4英尺×2英尺)，且相互間用金屬板隔開。
建筑物的邊都是開的，允許空氣流動(dòng)且有充足的光線用于藻類的繁殖。由于大棚的存在使得直接的降雨不能落到試驗(yàn)田內(nèi)，且對(duì)于直接的太陽輻射也起到輕微的遮蔽效應(yīng)，它是用來模擬夏天成熟經(jīng)濟(jì)作物在土壤上的遮陰。
帶有噴頭的PVC管的管道系統(tǒng)被安裝在大棚下面的試驗(yàn)田上。用于控制溫度。每天中午11∶00至12∶00之間給試驗(yàn)田澆水一次。每天在澆水之前，用從A& L實(shí)驗(yàn)室得到的Delmhorst儀器公司濕度儀，每天在澆水前讀出十二個(gè)石膏土濕度板上的總數(shù)而記錄土壤表面2.5厘米處(1英寸)的濕度水平。隨著每天的澆水，在儀器上處于10的范圍內(nèi)則顯示土壤表面保持非常濕潤狀態(tài)。
每天從在覆蓋土壤的大棚下0.6米(2英尺)處的6支溫度計(jì)上記錄大氣溫度，同時(shí)每天也在試驗(yàn)田的六個(gè)點(diǎn)測(cè)定頂部?jī)捎⒊咛幍耐寥罍囟取?br>用五株靜止期藻類進(jìn)行試驗(yàn)，它們是灰色念珠藻(Nostoc inuscorum)，構(gòu)巢隱桿藻，地木耳，蛋白核小球藻和peterbii衣藻分別稱作BG-1，BG-2，BG-3，C-1和C-2。C-2已按實(shí)例1的方法用干燥的載體瓊脂制備。其它幾株未與一種載體混合單獨(dú)干燥。每一菌株做七個(gè)重復(fù)，共35塊試驗(yàn)田。有八塊對(duì)照試驗(yàn)田。
將干燥藻株加到脫氯水中，稀釋成大約107細(xì)胞/毫升濃度的懸浮液，懸浮液以每4047米3(英畝)試驗(yàn)田用的76升(20加侖)水中含有大約946厘米3(一夸脫)的懸浮液的濃度噴灑到試驗(yàn)田中，使其濃度達(dá)到每4047米2(每畝)含1010個(gè)細(xì)胞。這些試驗(yàn)田在施用菌株后七天不澆水。七天后每天澆水一次，持續(xù)28天。對(duì)照田也與試驗(yàn)田一樣澆水，但其中沒有加進(jìn)藻類。
在第14和28天采集土壤樣品和藻類樣品，測(cè)定濕團(tuán)聚穩(wěn)定性和斷裂系數(shù)(modulus of rupture)作為土壤的物理測(cè)定;用顯微鏡分析其活力和鑒定藻類，澆水完成后的兩個(gè)星期用一探測(cè)環(huán)滲透儀來測(cè)定試驗(yàn)土壤的緊密度。所有的試驗(yàn)田和對(duì)照田都進(jìn)行了抽樣檢測(cè)。
2)方法樣品制備將用刀鏟從每一試驗(yàn)田隨機(jī)采集的大量樣品收集在一起，在實(shí)驗(yàn)室里將它們散開，空氣干燥72小時(shí)。然后用一橡皮鎚輕輕粉碎。在一個(gè)20.3厘米(8英寸)的黃銅絲格篩中用手將土壤篩選成兩部分(1)通過2.00毫米格篩的所有材料(2)通過2.00毫米的格篩而保留在1.00毫米的格篩上的材料。將樣品貯藏在封閉的聚乙烯桶中。
濕團(tuán)聚穩(wěn)定性所用方法與Kemper，W.D.的方法非常相似。方法見《土壤分析方法》第一部分物理學(xué)和礦物學(xué)特征，包括測(cè)量和取樣的統(tǒng)計(jì)學(xué)中的一節(jié)“團(tuán)聚穩(wěn)定性”。C.A.Block出版，511-519頁(1965)。大約50克團(tuán)粒在1.00毫米的篩子上以每分鐘30轉(zhuǎn)的速度濕篩7分鐘，每轉(zhuǎn)一圈搖床升高125毫米。篩子是60號(hào)(0.25毫米)的Soiltest篩(商品名)，其直徑為20.3厘米(8英寸)。18號(hào)的篩子(1.00毫米)放在它的上面，10號(hào)的篩子(2.00毫米)放在它的下面，用來截留從邊上漏掉的小粒材料，但是水的流動(dòng)不受限制。材料迅速浸沒，篩選，沖洗到一個(gè)干燥盤中，于100℃干燥過夜。砂子的重量通過手洗在5克/升偏磷酸鈉的分散液中的60號(hào)篩的干燥樣品而測(cè)定的。存留在篩子上的砂子沖洗到干燥盤中，干燥稱重，將其重量從水穩(wěn)定的團(tuán)聚體和起始團(tuán)聚體中減去。計(jì)算出水穩(wěn)定團(tuán)粒與原始團(tuán)粒的比值，其比率稱作“水穩(wěn)定材料百分?jǐn)?shù)”。
斷裂系數(shù)所用方法已由Reeues敘述，見《土壤分析方法》第一部分物理和礦物學(xué)特性，包括測(cè)量和取樣的統(tǒng)計(jì)學(xué)中一節(jié)“斷裂系數(shù)”，C.A.Block出版，第466-471頁(1965)。一個(gè)用裝載土塊裝置按習(xí)慣方法用硬木在流水下制造。該團(tuán)塊模子購自Soilmoisture公司，Santa Barbara，CA。將通過2.00毫米的格篩，且基本不含植物殘?jiān)牟牧希盟芰下┒费b入模子，該材料是被擱在鋁格篩框架頂端的濾紙上。由于大部分的土壤團(tuán)聚得相當(dāng)好，所以發(fā)現(xiàn)為了產(chǎn)生能夠用于操作和試驗(yàn)時(shí)不粉碎的團(tuán)塊，必須在現(xiàn)階段的標(biāo)準(zhǔn)方法中加壓。將一個(gè)松木塊放在篩選的土壤表面上，用5.2kg(11.41b)的秤砣輕壓幾秒種，其壓力是22.6kpa(3.3psi)。大部分土壤是撒在擠壓的表面，篩選。重復(fù)同樣的壓縮。每一格篩架制造出8個(gè)團(tuán)塊，從下面將其滲透和吸水一小時(shí)再在50℃干燥36小時(shí)。按標(biāo)準(zhǔn)方式用單波束將團(tuán)塊打破，測(cè)定它們的大小。按照波束的纖維應(yīng)力公式S＝EL/2bd/達(dá)因/厘米，計(jì)算出斷裂系數(shù)，其中F相當(dāng)于作用于團(tuán)塊波束距中心的斷力，L等于團(tuán)塊和支持物之間的距離，b等于團(tuán)塊的寬度，d等于從所用重物平行方向測(cè)得的團(tuán)塊的深度或厚度。
宏觀的和顯微鏡的分析在兩個(gè)星期，用肉眼觀察到在大部分的試驗(yàn)田和對(duì)照田中有植物生長(zhǎng)。植物的顏色在對(duì)照，綠藻和蘭綠藻之間有變化。在對(duì)照田中觀察到的結(jié)果表明了苔蘚的生長(zhǎng)或可能是藻類的生長(zhǎng)，綠藻田C-1和C-2有各種不同藻類的生長(zhǎng)，藍(lán)綠藻試驗(yàn)田中，BG-1，BG-2和BG-3具有更藍(lán)的綠色。
顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)了植物殘?jiān)?，為?shù)眾多的細(xì)菌，其它普通存在的藻類，土壤動(dòng)物以及移植在各塊試驗(yàn)田中特有的藻類。觀察到500-5000個(gè)用于試驗(yàn)生物的移植藻類細(xì)胞。
3)田間滲透用土壤試驗(yàn)探測(cè)環(huán)滲透儀(Soiltest Proving Ring Penet rometer)對(duì)試驗(yàn)田進(jìn)行測(cè)試。這種儀器是帶有厚度為0.000254厘米直徑為32.3厘米(5英寸)的鋼探測(cè)環(huán)，用于測(cè)定將一個(gè)5.1厘米(20英寸)長(zhǎng)的錐形鋼物推入土中所需壓力。尖狀物的角度為30度，其頂端的直徑是2.54厘米(一英寸)。在對(duì)照和處理的試驗(yàn)田中(包括田起伏的高處和低處)作五個(gè)探測(cè)，水分含量少于土壤吸收力。
4)結(jié)果在干燥一星期后澆水的兩個(gè)星期，五株菌中的兩株在濕團(tuán)聚穩(wěn)定性方面具有顯著結(jié)果(70%以上有意義)，用BG-1時(shí)為70%，用BG-2時(shí)為99%。在四個(gè)星期里，對(duì)照田的團(tuán)聚穩(wěn)定性有所升高，結(jié)果試驗(yàn)田與對(duì)照田沒有明顯不同。見表1。
在干旱七天后澆水的兩個(gè)星期，BG-2田比對(duì)照田的斷裂系數(shù)弱，置信度為90%。在兩個(gè)星期中，所有其它菌株與對(duì)照沒有顯示明顯不同。在四個(gè)星期，BG-3比對(duì)照具有較強(qiáng)的斷裂系數(shù)，其置信度為90%。而BG-1的置信度為95%。BG-2以95%的置信度顯示了比對(duì)照較弱的斷裂系數(shù)。見表2。
在干旱條件下，沒有出現(xiàn)綠藻，但在第十天，三塊田(BG-3和兩個(gè)對(duì)照)變綠，到十一天，58塊田中的30塊變綠，其中BG-1，BG-2和BG-3的7塊試驗(yàn)田中有5塊變綠，而對(duì)照田中，C-1和C-2有4塊(或少于4塊)變綠。到十二天，58塊試驗(yàn)田中的55塊顯示了植物生長(zhǎng)的跡象。
在澆水的28天進(jìn)行的顯微鏡分析顯示出活的細(xì)菌種群，多種藻類種群和活的土壤動(dòng)物。發(fā)現(xiàn)在每塊田中有500-50000個(gè)的試驗(yàn)菌株的菌落，它們以凝塊撒播在各種植物群中。而對(duì)照田比實(shí)驗(yàn)田中苔蘚和植物殘?jiān)純?yōu)勢(shì)。
田間滲透數(shù)據(jù)表明在四個(gè)干旱處理的試驗(yàn)田上也有明顯不同，但對(duì)照要比任何試驗(yàn)田弱。見表3。
5)討論我們發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)兩個(gè)星期的BG-1和BG-2比對(duì)照田的濕團(tuán)聚穩(wěn)定性大些。澆水四個(gè)星期，對(duì)照田的團(tuán)聚穩(wěn)定性與任何菌株田沒有顯著不同，但是即使BG-1，BG-2和BG-3斷裂系數(shù)比對(duì)照強(qiáng)90%，比C-1強(qiáng)75%，但田間滲透數(shù)據(jù)也是混亂的。
6)結(jié)論將試驗(yàn)菌株在接種后干燥七天，再澆水的兩個(gè)星期后，所有的試驗(yàn)田中均有生長(zhǎng)。將用BG-1和BG-2與對(duì)照在團(tuán)粒穩(wěn)定性方面相比較，發(fā)現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)上可測(cè)定的差異。與對(duì)照相比，BG-2田的斷裂系數(shù)顯示出90%的有效水平。四個(gè)星期，所有菌株在團(tuán)聚穩(wěn)定性方面與對(duì)照沒有明顯不同，但是BG-1，BG-2和BG-3，斷裂系數(shù)顯示了統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯不同，比對(duì)照大90%以上，且對(duì)于C-1其置紋度為75%。
表1濕團(tuán)聚穩(wěn)定性兩星期 四星期菌株 %團(tuán)粒百分 標(biāo)準(zhǔn) C.L. 團(tuán)粒百分 標(biāo)準(zhǔn) C.L.
數(shù)＊ 編差 數(shù)＊ 編差對(duì)照 27.0 2.1 - 29.7 8.1 -C-1 27.0 3.4 N.S. 29.7 4.6 N.S.
BG-1 29.8 4.7 70% 29.0 4.3 N.S.
BG-2 32.4 3.9 99% 32.8 4.1 N.S.
C-2 29.1 3.9 N.S. 29.0 3.7 N.S.
BG-3 30.1 6.2 N.S. 27.4 6.2 N.S.
＊基于35個(gè)試驗(yàn)田和40個(gè)對(duì)照田C.L＝置信度N.S＝不明顯表2斷裂系數(shù)兩星期 四星期菌株 平均 C.L. 平均 C.L.
對(duì)照 203 59 - 210 54 -C-1 170 27 N.S. 241 64 75%BG-1 172 45 N.S. 316 73 95%BG-2 107 82 90% 159 39 95%C-2 194 85 N.S. 212 67 N.S.
BG-3 191 80 N.S. 265 49 90%＊基于35個(gè)試驗(yàn)田和40個(gè)對(duì)照田C.L＝置信度N.S＝不明顯表3田間滲透兩星期 四星期菌株 平均 標(biāo)準(zhǔn) 平均力＊ 置信度 平均水份含量＊DIAL＊ 編差 LBS.
對(duì)照 109 22 36 - 12.2C-1 120 28 41 99% 12.9BG-1 168 44 55 99.9% 16.7BG-2 111 31 37 N.S. 14.2C-2 118 37 99 90% 13.4BG-3 107 29 35 N.S. 12.4＊基于35個(gè)試驗(yàn)田和40個(gè)對(duì)照田C.L＝置信度N.S＝不明顯實(shí)例4本發(fā)明的組合物中靜止期藻類的存活力1)目的這一實(shí)驗(yàn)的目的是測(cè)試兩種藻類與一種干燥的水分散載體混合后的存活力。
2)方法將藻類與按照實(shí)例1的方法制備的幾種不同干燥的水分散載體結(jié)合并在瓊脂平皿上測(cè)定其存活力。將一種蘭藻-地木耳和一種綠藻-蛋白核小球藻與幾種干燥的水分散粉末混合。單獨(dú)的地木耳，單獨(dú)的蛋白核小球藻以及它們的混合物都被試驗(yàn)過。載體是乳清，瓜耳膠，阿拉伯樹膠，瓊脂，麥芽糊精，乳糖和粘土。
通過離心從正在生長(zhǎng)的活的培養(yǎng)物中濃縮每一種營養(yǎng)細(xì)胞，然后與一種干燥載體噴灑混合。配制成一種液體泥漿，其中載體與濃縮的藻類的比例為99%∶1%。所有樣品在25℃空氣干燥48小時(shí)。
存活力試驗(yàn)是通過將干燥的藻類與載體的混合物粉碎在瓊脂平板培養(yǎng)基上進(jìn)行的，作十個(gè)重復(fù)。在7至14天對(duì)平板進(jìn)行觀察。
結(jié)果在表4，5和6中給出。單獨(dú)的藻類及與瓜耳膠，阿拉伯樹膠，瓊脂，麥芽糊精，乳糖和粘土共存的藻類，在其混合與干燥后都是存活的。顯微鏡學(xué)分析證實(shí)了存活和生長(zhǎng)者就是原來干燥和試驗(yàn)的菌種。觀察到藍(lán)藻生長(zhǎng)得比綠藻慢。
4)結(jié)論經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)利用干燥的水分散材料與營養(yǎng)藻類細(xì)胞的混合物來干燥和保藏藻類細(xì)胞的方法是有效的。干燥后形成的可流動(dòng)組合物的活力和生長(zhǎng)是通過在瓊脂培養(yǎng)基上接種后7至14天進(jìn)行觀察而被證實(shí)。
表4與各種載體混合的地木耳在瓊脂上的存活與生長(zhǎng)載體 存活(十個(gè)重復(fù)的瓊脂平皿)乳清 與大量細(xì)菌混合生長(zhǎng)瓜耳膠 9/10阿拉伯樹膠 9/10瓊脂 10/10麥芽糊精 8/10乳糖 9/10粘土 10/10
表5與各種載體混合的蛋白核小球藻在瓊脂上的存活與生長(zhǎng)載體 存活(在瓊脂在做十個(gè)重復(fù))乳清 0/10瓜耳膠 8/10阿拉伯樹膠 9/10瓊脂 10/10麥芽糊精 9/10乳糖 10/10粘土 10/10
表6與各種載體混合的地木耳和蛋白核小球藻在瓊脂上的存活與生長(zhǎng)載體 存活(十個(gè)重復(fù)的瓊脂平板)地木耳 蛋白核小球藻乳清 與細(xì)菌及霉菌混合生長(zhǎng)瓜耳膠 8/10 8/10瓊脂 9/10 8/10麥芽糊精 9/10 9/10乳糖 9/10 8/10粘土 10/10 10/10實(shí)例5營養(yǎng)期藻類應(yīng)用于土壤1)目的這一實(shí)驗(yàn)的目的是要試驗(yàn)現(xiàn)有技術(shù)所介紹的，即將營養(yǎng)期藻類應(yīng)用于土壤表面時(shí)，必須向土壤表面加入氮，它允許在明顯數(shù)量的絮凝劑產(chǎn)生之前消耗掉。
2)材料和樣品制備藻類覆蓋作物制備一種藻類懸浮液，其中墨西哥衣藻占每升懸浮液中細(xì)胞總數(shù)的80%，地木耳占20%，而每升懸浮液中細(xì)胞總數(shù)的最小值為107個(gè)。
在第一年的十一月份和下一年的三月份(第二次)用于動(dòng)噴灑機(jī)對(duì)試驗(yàn)田進(jìn)行噴灑，其濃度為每4047米2(英畝)試驗(yàn)田中用76升的水加入到約一夸脫的懸浮液中。這樣提供的是每4047米2(英畝)大約含1010個(gè)細(xì)胞。在第二年的五月對(duì)2.54厘米(1英寸)的土壤表面進(jìn)行抽樣檢測(cè)。沒有加進(jìn)氮或其它營養(yǎng)物。
試驗(yàn)田利用一塊4047米2(英畝)的平地。在開始噴灑的前兩年種玉米，而在這之前的三年種的是苜蓿和雞腳草。地面被劃分成20個(gè)3米×15米(10英尺×50英尺)的試驗(yàn)田，而在其間插入一個(gè)3米(10英尺)寬的緩沖區(qū)，種上黑麥以防止試驗(yàn)田中的藻類向?qū)φ仗镏新?。所有試?yàn)田的質(zhì)地由內(nèi)布拉斯加州奧馬哈城的A& L中西部農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)室有限公司(A& L MidWest Agricultural Laboratories，Inc.，Omaha，NE.)進(jìn)行了測(cè)定，且根據(jù)它們的質(zhì)地對(duì)試驗(yàn)田進(jìn)行配對(duì)以消除可變因素。這一研究比較了試驗(yàn)田2(作為試驗(yàn)田，含30%的砂，55%的淤泥和15%的粘土)和試驗(yàn)田5(作為試驗(yàn)田，含30%的砂，53%的淤泥和17%粘土)。土壤在秋季進(jìn)行旋耕，將雜草翻入土內(nèi)。沒有施用化肥或化學(xué)藥品。
樣品的制備將用刀鏟從每一試驗(yàn)田中隨意采用的大量土樣品收集在一起。在實(shí)驗(yàn)室中將它們?nèi)鲩_，且空氣干燥72小時(shí)，然后用橡皮槌將其輕微粉碎。在一個(gè)20.3厘米(8英寸)的黃銅絲格篩中用手動(dòng)將土壤篩選成兩部分(1)通過2.00毫米的格篩的所有材料和(2)通過2.00毫米的格篩而存留在1.00毫米的格篩中的材料。將樣品保藏在一封閉的聚乙烯桶中。
3)試驗(yàn)方法濕團(tuán)聚穩(wěn)定性用于測(cè)定濕團(tuán)聚穩(wěn)定性的方法與實(shí)例3中的相同。
斷裂系數(shù)用于測(cè)定斷裂系數(shù)的方法與實(shí)例3中的相同。
田間滲透在第二年的五月用土壤試驗(yàn)探測(cè)環(huán)滲透儀(Soiltest Proving Ring Penetrometer)對(duì)試驗(yàn)田進(jìn)行測(cè)試。這一裝置是一個(gè)厚0.00254厘米(0.0001英寸)的直徑為5英寸的鋼探測(cè)環(huán)，它用來測(cè)定將5.08厘米(2英寸)長(zhǎng)的鋼制錐形尖狀物推入土壤所需的壓力。尖狀物的角度是30度，頂部的直徑是一英寸。在對(duì)照田和試驗(yàn)田(包括小范圍起伏的高低兩區(qū))測(cè)定20處。水分含量略微低于田間持水量。
黃豆發(fā)芽對(duì)在同一地點(diǎn)的兩塊3米×15米(10英尺×50英尺)試驗(yàn)田(試驗(yàn)田15和16)進(jìn)行旋耕，它們已用覆蓋作物處理兩次(第一年的十一月和第二年的三月)。用2.5×15.2厘米(1×6英寸)的木材制成24個(gè)1.5米2(4平方尺)的種植箱，放入土壤中。對(duì)試驗(yàn)田15和16進(jìn)行的質(zhì)地分析，含16%砂，64%淤泥和20%粘土。澆上一英寸的水后就形成了一層外殼。接著交替使用雨水和陽光，形成一個(gè)1.3厘米(1/2英寸)的外殼。在每一盒子中將十二個(gè)黃豆種子種植在輕微裂開外殼的深度為3.8厘米(1.5英寸)，30厘米(12英寸)處，外殼通過澆水而重新形成。兩個(gè)品種各種植144顆。Adcl，Iowa的Stine 3560示苗率最高，定為“1”，Oskaloosa，Iowa的William 82出苗最差，定為“5”，即前者的1/5。每星期對(duì)發(fā)芽植株清點(diǎn)幾次。
4)結(jié)果與討論對(duì)試驗(yàn)田和對(duì)照田的三個(gè)物理特征的測(cè)定顯示了明顯的不同，見表7。經(jīng)處理的土壤產(chǎn)生高百分比的水穩(wěn)定團(tuán)粒，這對(duì)于絕大部分的莊稼是有利的，因?yàn)樗鼫p少土壤流蝕并提高了滲透率和通氣。處理過的土壤的斷裂系數(shù)明顯低于對(duì)照，說明它不易由于干旱而產(chǎn)生表面的硬殼和硬塊。土壤滲透實(shí)驗(yàn)證實(shí)其斷裂系數(shù)接近較軟的土壤表面。
九天之后，在處理過的土壤中種植的黃豆比對(duì)照土壤中種植的種子具有明顯高的發(fā)芽百分?jǐn)?shù)。表8為第21天的結(jié)果，顯示了對(duì)發(fā)芽力較弱的種子Williams82，相對(duì)更有益。
上面的結(jié)果使人想到用這種藻類覆蓋植物來改善中西部粘土的團(tuán)粒。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)與現(xiàn)有技術(shù)相反，本發(fā)明不必將氮加入土壤中，然后通過藻類覆蓋作物消耗它產(chǎn)生足夠數(shù)量的絮凝劑來改善土壤的團(tuán)粒。
表7用藻類覆蓋作物處理的試驗(yàn)田與對(duì)照田相比較的試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn) 處理的(T) 重復(fù)數(shù) 平均值 標(biāo)準(zhǔn)偏差 置信度＊對(duì)照的(C)濕團(tuán)聚 T 9 46.0% 4.2% 95%穩(wěn)定性 C 9 35.8% 6.7%斷裂 T 7，3.55×105達(dá)因/厘米 0.27 95%系數(shù) C 7 4.52×105達(dá)因/厘米 0.22田間滲透 T 20 94磅 14磅 95%C 20 103磅 13磅＊以2結(jié)尾的t試驗(yàn)表8黃豆通過土壤外殼的發(fā)芽情況黃豆品種 排數(shù) 在21天的發(fā)芽百分?jǐn)?shù) 置信度＊(四個(gè)種植箱的總數(shù)) 處理的 對(duì)照的Stine3560 1 83 812 75 67 90%3 83 75Williams82 4 81 485 75 67 90%6 77 56＊以2結(jié)尾的t試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.用于改良土壤的組合物，其特征在于包括處于靜止期產(chǎn)生絮凝劑的光合微生物的干燥、可流動(dòng)的混合物和干燥、顆粒狀，能在水中分散的載體；該組合物能均一地施用于干燥土壤中，以提供營養(yǎng)期的該微生物覆蓋作物，從而通過絮凝劑的作用改善土壤的團(tuán)聚作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的組合物，其特征在于所述產(chǎn)生絮凝劑的光合微生物是藻類的一個(gè)或多個(gè)菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2的組合物，其特征在于所述藻是至少兩種不同純菌株的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3的組合物，其特征在于所述藻是(a)綠藻的第一菌株和蘭綠藻的第二菌株的混合物;或(b)在PH約4-7土壤中能存活的第一菌株和在PH約7-9的土壤中能存活的第二菌株的混合物;或(c)選自下列一組的一株或多株的混合物衣藻屬、小球藻屬、念珠藻屬、顫藻屬、隱球藻屬、隱桿藻屬、裂須藻屬或微鞘藻屬;或(d)選自下列一組的一株或多株的混合物雪衣藻，蛋白核小球藻，地木耳，多育顫藻或構(gòu)巢隱桿藻。
5.權(quán)利要求
1-4中任一項(xiàng)的組合物，其特征在于所述載體選自下列一組的一個(gè)或多個(gè)乳清，瓜耳膠，阿拉伯膠，瓊脂，麥芽糊精，乳糖或粘土。
6.權(quán)利要求
5所述組合物，其特征在于所述的載體是細(xì)粒粘土。
7.生產(chǎn)干燥，可流動(dòng)的微生物組合物的方法，包括將產(chǎn)絮凝劑的光合微生物生長(zhǎng)在培養(yǎng)其中;其特征在于通過下列幾個(gè)方法將所述微生物誘導(dǎo)到靜止期，從而得到干燥、可流動(dòng)的組合物(a)將其與干燥、顆粒狀的，能在水中分散的載體混合;或(b)將所述微生物與培養(yǎng)基分開，干燥分離后的微生物，使其成團(tuán)塊，再干燥成顆粒狀可流動(dòng)的組合物;或(c)選擇藻類作為所述微生物，使其生長(zhǎng)在培養(yǎng)其中，增加培養(yǎng)基中養(yǎng)分使藻類形成接合孢子，將接合孢子與培養(yǎng)基分開，將分離出的接合孢子與干燥、顆粒狀、在水中可分散的載體混合;從而得到能均一地施用于干燥土壤中的組合物，為土壤提供覆蓋作物，通過絮凝劑的作用改善土壤團(tuán)聚作用。
8.權(quán)利要求
7所述方法，其特征在于步驟(a)中還包括誘導(dǎo)微生物到靜止期前將微生物與培養(yǎng)基分開。
9.權(quán)利要求
7或8的方法，其特征在于步驟(a)或(c)中，進(jìn)一步包括降低所述組合物的顆粒大小的步驟。
10.權(quán)利要求
7到9中任一項(xiàng)，其特征在于在步驟(a)或(b)中所述光合微生物是一株或多株藻類。
11.權(quán)利要求
7(c)或10的方法，其特征在于所述藻類產(chǎn)生足夠量的絮凝劑，從而使其生長(zhǎng)在干燥土壤后能使土壤顆粒團(tuán)聚。
12.權(quán)利要求
10的方法，其特征在于步驟(a)中進(jìn)一步包括將分離的藻類噴灑在干燥、顆粒狀、能在水中分散的載體中，使藻類與載體混合。
13.權(quán)利要求
12所述方法，其特征在于所述藻類與所述載體以體積比約1-50%的藻類及約99-95%的載體的比例混合。
14.權(quán)利要求
7到13中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述步驟(a)是在溫度約25℃～35℃間進(jìn)行的。
15.權(quán)利要求
10到14中任一項(xiàng)的方法，其特征在于該方法包括下列步驟將至少兩株不同的藻類分別純培養(yǎng)在培養(yǎng)基中;將所述的藻與培養(yǎng)基分開;再將混合的藻與干燥、顆粒狀、在水中可分散的載體混合誘導(dǎo)它們達(dá)靜止期，從而制成干燥，可流動(dòng)的組合物。
16.權(quán)利要求
10到14的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于該方法包括下列步驟將至少兩株不同的藻類分別純培養(yǎng)在培養(yǎng)基上;將藻與培養(yǎng)基分開;通過將分離出的不同株的藻分別與干燥、顆粒狀、在水中能分散的載體混合誘導(dǎo)進(jìn)入靜止期，從而也制成至少兩種中間組合物。將上述中間組合物混合，制成干燥、可流動(dòng)的組合物。
17.權(quán)利要求
7到16中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述的藻是選自下面一個(gè)或多個(gè)屬中的一個(gè)或多個(gè)菌株衣藻屬、小球藻屬、念珠藻屬、顫藻屬、隱球藻屬、隱桿藻屬、裂須藻屬或微鞘藻屬。
18.權(quán)利要求
7到17中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于步驟(a)還包括一株或多株選自下列種的一個(gè)或多個(gè)菌株雪衣藻，蛋白核小球藻，多育顫藻，地木耳或構(gòu)巢隱桿藻。
19.權(quán)利要求
7的方法，其特征在于步驟(c)所述分離出的接合孢子與從培養(yǎng)基分離出的未形成接合孢子的藻混合，將這接合孢子與未形成接合孢子的藻的混合物再與干燥、顆粒狀、能在水中分散的載體混合以誘導(dǎo)未形成接合孢子的藻進(jìn)入靜止期，從而制成干燥，可流動(dòng)的組合物。
20.權(quán)利要求
19所述方法，其特征在于該藻為墨西哥衣藻(chlamydomas mexicana)。
21.權(quán)利要求
7所述方法，其特征在于該方法包括下列步驟將至少兩株不同的藻純培養(yǎng)在培養(yǎng)基中;在步驟(c)中，增加培養(yǎng)基中的養(yǎng)分誘導(dǎo)靜止期的藻，使其形成接合孢子;將該接合孢子與培養(yǎng)基分開;或者(1)先將各株分離出的接合孢子混合;再將各株混合的接合孢子與干燥、顆粒狀、在水中能分散的載體混合，從而產(chǎn)生干燥、可流動(dòng)的組合物;或者(2)將分離出的各株的接合孢子分別與干燥、顆粒狀、在水中能分散的載體混合，制成至少兩種中間組合物，再將各種中間組合物混合在一起制成干燥、可流動(dòng)的組合物。
22.權(quán)利要求
7的方法，其特征在于步驟(b)中分開的微生物是選自下面任一種和多種藻的一個(gè)或多個(gè)菌株的藻類雪衣藻，構(gòu)巢隱桿藻，或蛋白核小球藻。
23.權(quán)利要求
7到22中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于進(jìn)一步包括再干燥所述組合物的步驟。
24.權(quán)利要求
7-23中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述載體是選自下列一組的一個(gè)或多個(gè)混合乳清，瓜耳膠，阿拉伯膠，瓊脂，麥芽糊精，乳糖或粘土。
25.權(quán)利要求
24的方法，其特征在于所述的載體為細(xì)粒粘土。
26.提供覆蓋作物改善土壤團(tuán)聚作用的方法，其特征在于將權(quán)利要求
1到25的藻類組合物均一地施用到干燥土壤中。
27.權(quán)利要求
26的方法，其特征在于施用后藻在土壤中的濃度至少為每平方厘米土壤表面有100個(gè)藻細(xì)胞。
28.權(quán)利要求
26的方法，其特征在于施用后藻在土壤中的濃度大約為每平方厘米土壤表面有250到1000個(gè)藻細(xì)胞。
專利摘要
本發(fā)明提供一種微生物組合物及其制造方法，該組合物含有靜止期產(chǎn)生絮凝劑的光合微生物的干燥、可流動(dòng)的混合物和干燥、顆粒狀、具水分散性的載體。它可均一地施用于土壤，提供營養(yǎng)期的該微生物覆蓋作物，通過絮凝劑的作用改善土壤的團(tuán)聚作用。
文檔編號(hào)C05F11/08GK86107488SQ86107488
公開日1987年8月26日 申請(qǐng)日期1986年11月5日
發(fā)明者吉米·W·施阿弗爾, 肯特·W·波依姆 申請(qǐng)人:土壤技術(shù)公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan