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一種修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體的制作方法

文檔序號:3752560閱讀:582來源:國知局
專利名稱:一種修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及納米生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及ー種修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體。
背景技術(shù)
量子點(diǎn)(QDs)是ー種零維半導(dǎo)體納米晶體,近似球形,直徑f 12nm,可分散于水或者有機(jī)溶劑中形成膠體,由于QDs的尺寸接近甚至小于相應(yīng)半導(dǎo)體相材料的激子(電子-空穴對)Bohr半徑,受激發(fā)時產(chǎn)生的電子和空穴被限制在狹小的三維空間,因而表現(xiàn)出量子效應(yīng),與傳統(tǒng)的有機(jī)染料相比,QDs具有更優(yōu)異的光譜性質(zhì),如激發(fā)光譜寬且連續(xù)分布,而發(fā)射光譜呈對稱分布且寬度窄,顏色可調(diào),并且光化學(xué)穩(wěn)定性高,不易光解(Marcel BJ, MarioM, Peter G, et al. Science 1998,281,2013-2016)。這些優(yōu)越的性能使 QDs 在體內(nèi)細(xì)胞成像和生物特定標(biāo)記等方面都得到了廣泛應(yīng)用,它正在并將日益成為分子細(xì)胞成像研究中非常重要的一種探針工具。因此,具有高性能的水溶性量子點(diǎn)的合成受到了密切關(guān)注。目前,在生物標(biāo)記中應(yīng)用最廣泛的是金屬有機(jī)溶劑法合成的脂溶性CdSe/ZnS量子點(diǎn)。因此,必須將脂溶性的QDs轉(zhuǎn)化成水溶性的QDs才能進(jìn)行生物標(biāo)記。而將脂溶性的QDs轉(zhuǎn)化成水溶性的QDs最常用的方法是先用巰基小分子(如巰基こ酸、巰基丙酸、谷胱甘肽、巰基丁ニ酸等)取代脂溶性QDs表面的配體,然后通過偶聯(lián)劑與生物分子偶聯(lián);另ー種常用的QDs標(biāo)記生物分子的方法是與含有組氨酸標(biāo)簽的多肽或蛋白結(jié)合。QDs表面的Zn原子和多組氨酸殘基的金屬親和協(xié)調(diào)作用,含有組氨酸殘基的蛋白質(zhì)和多肽能夠直接接到QDs表面的Zn原子,這種方法具有很好的穩(wěn)定性,已逐漸成為生物標(biāo)記中ー種常用的方法。Sapsford 等(Sapsford K. E. , Pons T. , Medintz I. L. , et al. J. Phys. Chem.C2007, 111,11528-11538)系統(tǒng)地研究了含組氨酸多肽與QDs之間的相互作用及結(jié)合常數(shù)等,6個組氨酸序列與QDs的結(jié)合速率是約100秒,KtT1約為InM ;但其結(jié)果證實(shí)組氨酸超過6個的線性多肽序列并不能提高結(jié)合速率,這可能是因?yàn)殚L鏈中的組氨酸不能全部與QDs結(jié)合;同時6個組氨酸序列與QDs的結(jié)合不是非常穩(wěn)定,進(jìn)入生物體內(nèi)有可能被其他生物分子取代。因此,我們考慮改變組氨酸的結(jié)構(gòu),設(shè)計(jì)ー種新型的多肽配體,使更多的組氨酸與QDs結(jié)合,以此提高結(jié)合速率及穩(wěn)定性,從而大大提高QDs在生物標(biāo)記領(lǐng)域中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有多肽配體與QDs結(jié)合速度慢、穩(wěn)定性差等問題,限制其在生物領(lǐng)域中的普及使用,為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明提供ー種與QDs結(jié)合速度快,而且穩(wěn)定性好的新型多肽配體。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體,其特征在干包括用于結(jié)合量子點(diǎn)的組氨酸序列(I)、提供多肽剛性結(jié)構(gòu)的序列(2)、功能序列(3)和帶負(fù)電荷的序列(4),各序列之間以肽鍵相結(jié)合。所述的組氨酸序列(I)由Lys側(cè)鏈修飾為4個組氨酸標(biāo)簽(H6)序列;所述的剛性結(jié)構(gòu)的序列為9個Ρι·ο序列;所述的功能序列(3)使得量子點(diǎn)與多肽連接后具有生物功能,如酶切序列LVPRGS或者具有靶向性的多肽分子等;所述的帶負(fù)電荷的序列(4)使量子點(diǎn)保持穩(wěn)定,通常為2 4個帶負(fù)電的氨基酸組成,如DD、DDD、DDDD、EE、EEE、EEEE或D與E的任意組合。本發(fā)明所述的量子點(diǎn)為含有Zn的量子點(diǎn),如CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。采用上述的技術(shù)方案后,本發(fā)明取得的有益效果是,本發(fā)明提供的修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體,合成方法簡單,可重復(fù)性高,與量子點(diǎn)結(jié)合速度快,穩(wěn)定性高,解決了現(xiàn)有量子點(diǎn)多肽配體穩(wěn)定性不足而導(dǎo)致其在生物體內(nèi)的不穩(wěn)定,進(jìn)一步拓展了量子點(diǎn)一多肽復(fù)合物作為納米熒光探針在生物中的應(yīng)用。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。
圖I是修飾QDs的新型多肽配體(H24)的結(jié)構(gòu)示意圖;圖中I是結(jié)合QDs的組氨酸序列、2是提供多肽剛性結(jié)構(gòu)的序列、3是功能序列、4是帶負(fù)電荷的序列。圖2是用熒光分光光度計(jì)檢測H24-Cy5與QDs結(jié)合的速率圖,檢測波長612nm(量子點(diǎn)熒光發(fā)射波長為612nm)。其中a是對照實(shí)驗(yàn)H6_Cy5與QDs混合后檢測QDs熒光強(qiáng)度變化,b是H24-Cy5與QDs混合后檢測QDs熒光強(qiáng)度變化。([QD] = [p^)tide]=16nM)圖3是用毛細(xì)管電泳檢測H24_Cy5與QDs結(jié)合的穩(wěn)定性。電泳條件25mM硼酸緩沖液(pH 9. 3),電壓為 18kV。H24-Cy5:QD=20:l, [QD] = O. 5 μ Μ。其中 a 是對照試驗(yàn),沒有加取代分子。b是H24-Cy5與QDs混合后加入取代小分子(40倍的GP9G2H6和40倍的H6-GFP)。檢測波長,實(shí)線為612nm檢測QDs,虛線為661nm檢測Cy5。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例本發(fā)明將就以下實(shí)施例作進(jìn)一步說明,但應(yīng)了解的是,這些實(shí)施例僅為例示說明之用,而不應(yīng)被解釋為本發(fā)明實(shí)施的限制。實(shí)施例I本發(fā)明所述的方法采用常規(guī)的固相Fmoc法,即固相樹脂上被Fmoc保護(hù)的單體氨基酸去保護(hù)后露出氨基,通過縮合反應(yīng)與溶液中氨基酸的羧基形成肽鍵,從而將氨基酸連接到樹脂上,使肽鏈從C端向N端延伸。I、基本材料(I)樹脂與連接分子固相Fmoc法選擇的樹脂為RinkAinide-ChemMatrixR W
月旨。這種樹脂具有非常好的溶脹性,可以使肽鏈之間更好地進(jìn)行縮合反應(yīng),且有足夠的網(wǎng)絡(luò)空間滿足不斷增長的肽鏈。采用HBTU和HOBt作為連接分子,將多肽分子固定到樹脂上。(2)單體合成所用單體為經(jīng)化學(xué)修飾的α -氨基酸。2、反應(yīng)步驟第一步,將第一個氨基酸共價連接到樹脂上加入適當(dāng)?shù)目s合劑如HBTU和HOBt,使被保護(hù)氨基酸羧基端與樹脂形成共脂以完成氨基酸的固定;第二步,去保護(hù)
采用堿性溶劑20%哌啶去除氨基上的Fmoc,暴露出氨基。第三步,激活和交聯(lián)采用活化劑HBTU和HOBt活化下一個氨基上的羧基,與樹脂上的氨基交聯(lián),形成用鍵。第四步,重復(fù)第二步和第三步,反復(fù)循環(huán)添加單體氨基酸,直到合成完成。3、合成后處理( 1)洗脫和脫保護(hù)用脫保護(hù)劑三氟乙酸(TFA)將肽鏈從樹枝上洗脫下來,并脫聞
保護(hù)基。(2 ) HPLC分析純化,凍干保存。通過上述方法,合成多肽序列H24_G2P9GLVPRGSK (Cy5) DDD (H24_Cy5),如下
權(quán)利要求
1.一種修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體,其特征在于該多肽配體包括用于結(jié)合量子點(diǎn)的組氨酸序列(I)、提供多肽剛性結(jié)構(gòu)的序列(2)、功能序列(3)和帶負(fù)電荷的序列(4),各序列之間以肽鍵相結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體,其特征在于所述的組氨酸序列(I)由賴氨酸側(cè)鏈修飾為4個組氨酸標(biāo)簽H6序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體,其特征在于所述的提供多肽剛性結(jié)構(gòu)的序列(2)為9個脯氨酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體,其特征在于所述的功能序列(3)為酶切序列LVPRGS或者具有靶向性的多肽序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體,其特征在于所述的帶負(fù)電荷的序列(4)為2 4個帶負(fù)電的氨基酸組成,如DD、DDD、DDDD、EE、EEE、EEEE或D與E的任意組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體,其特征在于所述的量子點(diǎn)為含有 Zn 的量子點(diǎn),如 CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe 或者 CdTe/ZnSe。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體(H24),屬于納米生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明中的新型多肽配體包括用于結(jié)合量子點(diǎn)的組氨酸序列(1)、提供多肽剛性結(jié)構(gòu)的序列(2)、功能序列(3)和帶負(fù)電荷的序列(4),各序列之間以肽鍵相結(jié)合。該配體合成方法簡單,其N端通過4個組氨酸標(biāo)簽序列與量子點(diǎn)結(jié)合,大大提高了配體與量子點(diǎn)的結(jié)合速率及穩(wěn)定性,可以作為納米熒光探針廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)記。
文檔編號C09K11/06GK102911259SQ20121035536
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月21日
發(fā)明者王建浩, 邱琳, 蔣鵬舉, 王車禮, 夏江 申請人:常州大學(xué)
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