專利名稱：：多色光學(xué)編碼硅殼納米棒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種納米
技術(shù)領(lǐng)域：
光致發(fā)光材料及其制備方法，具體涉及一種可用于多元生物分析與熒光成像中信號編碼的光致發(fā)光材料及其制備方法。技術(shù)背景生命科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展給分析技術(shù)提出了新的挑戰(zhàn)。面對分析對象的日益增多，需要有與之相適應(yīng)的分析手段相配合，特別需要有能夠?qū)ν粯悠分卸喾N組分進行同時測定的多元分析技術(shù)。在多元分析中，往往需要使用多種熒光標記物，最好是僅用一個波長的光就能有效激發(fā)出各個標記物的熒光，這要求被選用的標記物具有相近的最大激發(fā)波長和明顯不同的最大發(fā)射波長，然而這樣的染料并不多。此外，多數(shù)染料分子的熒光并不強，而且易于受到不可逆的光漂白作用。最近發(fā)展起來的光學(xué)編碼技術(shù)為多元分析提供了更為廣泛的熒光標記物。該技術(shù)通常在聚合物微球中包裹兩種或多種熒光染料或量子點，通過控制各種染料的比例來實現(xiàn)編碼。目前常用于光學(xué)編碼的材料主要有聚合物熒光編碼微球和量子點編碼微球。聚合物材料易于發(fā)生溶脹而引起染料泄露，親水性不好，在水溶液中易于團聚；量子點存在著制備條件苛刻，毒性大等問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種染料泄露少、生物相容性好、親水性好、熒光強、性質(zhì)穩(wěn)定的多色光學(xué)編碼硅殼納米棒，還提供一種工藝簡單、染料包裹效率高的多色光學(xué)編碼硅殼納米棒的制備方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種多色光學(xué)編碼硅殼納米棒，其特征在于所述多色光學(xué)編碼硅殼納米棒為核殼型結(jié)構(gòu)，其外殼材料為二氧化硅，內(nèi)核材料為熒光編碼的多聚賴氨酸，熒光編碼的多聚賴氨酸含有熒光染料A和熒光染料B,熒光染料A和熒光染料B是熒光共振能量轉(zhuǎn)移供體-受體對;所述熒光編碼的多聚賴氨酸是熒光染料A和熒光染料B通過其各自所帶有的活性基團與多聚賴氨酸的胺基共價連接而成。上述熒光共振能量轉(zhuǎn)移供體-受體對可以為下表中所列的各熒光染料配對組合中的任意一種表一<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述熒光染料所帶有的活性基團為異硫氰酸酯基或琥珀酰亞胺酯基。本發(fā)明還提出一種上述多色光學(xué)編碼硅殼納米棒的制備方法，其特征在于將熒光染料A和熒光染料B與多聚賴氨酸反應(yīng)制備熒光編碼的多聚賴氨酸，以熒光編碼的多聚賴氨酸為內(nèi)核材料，用反向微乳液法將內(nèi)核材料包裹在二氧化硅基質(zhì)中制備成多色光學(xué)編碼的硅殼納米棒。上述制備方法具體包括以下步驟(1)熒光編碼多聚賴氨酸的制備將熒光染料A和熒光染料B按要求的比例同時或依次與多聚賴氨酸在碳酸鹽緩沖液中于室溫下反應(yīng)2~3h，用透析法除去過量的熒光染料，制得熒光編碼的多聚賴氨酸；(2)編碼多聚賴氨酸的包殼將7.2~7.5體積的環(huán)己垸、1.61.8體積的表面活性劑曲拉通X-100和1.6-1.8體積的正己醇混合均勻，往混合液中加入0.4-0.8體積的水作為分散相，攪拌均勻后形成反相微乳液；加入0.2~0.6體積4.0x10'5~8.0x10"4mol/L上述制得的熒光編碼多聚賴氨酸的水溶液，攪拌均勻后再加入0.2~0.4體積的正硅酸乙酯和0.1~0.2體積氨水(質(zhì)量分數(shù)25~28%)，反應(yīng)2024h后加入丙酮或乙醇破乳，離心收集納米棒，并依次用乙醇、水洗滌收集到的納米棒，最后得到多色光學(xué)編碼硅殼納米棒。上述碳酸鹽緩沖液的濃度為0.01~0.1mol/L。當熒光染料的活性基團為異硫氰酸酯基時，碳酸鹽緩沖液的pH值可以為9.09.5;當熒光染料的活性基團為琥珀酰亞胺酯基時，碳酸鹽緩沖液的pH值可以為8.0~8.5。在熒光染料A和熒光染料B與多聚賴氨酸反應(yīng)制備熒光編碼多聚賴氨酸的過程中，當熒光染料A與熒光染料B所帶的活性基團相同時，熒光染料A與熒光染料B可以同時與多聚賴氨酸反應(yīng)制備熒光編碼的多聚賴氨酸；當熒光染料A與熒光染料B所帶的活性基團不同時，應(yīng)當將熒光染料A與熒光染料B依次與多聚賴氨酸反應(yīng)制備熒光編碼的多聚賴氨酸。上述熒光染料A和熒光染料B的配比應(yīng)當根據(jù)所要制備的光學(xué)編碼材料的要求進行確定，隨著熒光染料A和熒光染料B配比情況的變化，以供體染料的最大激發(fā)波長的光激發(fā)，所述納米顆?？砂l(fā)出不同顏色的熒光，從而達到多色光學(xué)編碼的效果。本發(fā)明針對如何制備硅殼納米棒以及如何將多色光學(xué)編碼的思路融合于納米棒的制備的問題，設(shè)計了一種簡單易行的制備方案。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明不僅克服了現(xiàn)有光學(xué)編碼材料易于溶脹引起染料泄露、親水性不好、毒性大等技術(shù)缺陷，也改進了現(xiàn)有制備工藝中常見的工藝過程復(fù)雜、制備條件苛刻等不足，提供了一種簡便易行、染料包裹效率高、染料泄露少的多色光學(xué)編碼硅殼納米棒的制備工藝。通過改變硅殼納米棒中各種染料的配比，而制得的系列性的多色光學(xué)編碼硅殼納米棒，在某一特定波長光的激發(fā)下，各個納米棒能發(fā)出不同顏色的熒光，光強度較高，具有較好的生物相容性和親水性，且性質(zhì)較為穩(wěn)定。此外，由于硅殼納米棒表面有硅網(wǎng)結(jié)構(gòu)的存在，可以利用表面硅垸化修飾方法對本發(fā)明的硅殼納米棒表面進行進一步處理，使其帶上氨基、羧基等基團，以便于蛋白質(zhì)、核酸等生物分子的接枝。因此，本發(fā)明的多色光學(xué)編碼硅殼納米棒在多基因表達分析、蛋白質(zhì)多元分析、高通量篩選、多通道生物學(xué)測定、醫(yī)學(xué)診斷學(xué)和組合化學(xué)等方面都有著廣闊的應(yīng)用前景。圖1為多色光學(xué)編碼硅殼納米棒(實施例中第c種硅殼納米棒)的透射電子顯微鏡成像圖；圖2為實施例中制備的七種多色光學(xué)編碼硅殼納米棒的熒光發(fā)射光譜圖；圖3為由活體熒光成像儀所拍攝到的七種多色光學(xué)編碼硅殼納米棒的熒光成像圖；其中每種硅殼納米棒所發(fā)出的熒光顏色在RGB顏色模式下的色值如下納米棒a的顏色(R:101，G:192，B:107);納米棒b的顏色(R:250,G:230,B:87);納米棒c的顏色(R:254，G:190,B:59);納米棒d的顏色(R:245,G:166，B:44);納米棒e的顏色(R:247,G:139，B:27);納米棒f的顏色(R:255，G:119,B:22);納米棒g的顏色(R:255，G:119，B:10)。具體實施方式實施例一種多色光學(xué)編碼硅殼納米棒，通過以下方法制備得到(1)將分子量為715萬的多聚賴氨酸溶解在pH8.3,0.1mol/L的碳酸氫鈉溶液中，配成40mg/mL的溶液A;將5-羧基四甲基羅丹明琥珀酰亞胺酯(5-TAMRA,SE)用無水二甲亞砜(DMSO)溶解，配制成9.0x1(T3mol/L的溶液B;取30pl溶液B加入到270pl溶液A中，迅速攪拌均勻，在室溫下持續(xù)輕微攪拌2h，用0.15mol/L的NaCl溶液透析除去過量的染料，再加入pH9.2,0.1mol/L的碳酸鹽緩沖液補足1250nl，得到溶液C;(2)取熒光素異硫氰酸酯(FITC)溶于無水DMSO中，分別配制成7.6xl(^mol/L、3.8xl0-4mol/L、1.9x10-4mol/L、9.5x10-5mol/L、4.8xl(T5mol/L的不同濃度的FITC/DMSO溶液；取45pl溶液A，加入162pl、pH值9.2、0.1mol/L的碳酸鹽緩沖液和23pl7.6xl0"4mol/LFITC/DMSO得到溶液a1;另取207pl溶液C，加入23plDMSO得到溶液g1;再取五個管，各加入207nl溶液C，然后在各管中分別加入7.6xl(^mol/L、3.8xl0"4mol/L、1.9xl(T4mol/L、9.5x10-5mol/L、4.8xl(T5mol/L的FITC/DMSO溶液，分別得到溶液bi、Cl、d卜ei、f1;將得到的溶液a廣gi在室溫下持續(xù)輕微攪拌3h，分別用0.15mol/L的NaCl溶液和超純水透析除去過量的FITC染料，得到溶液a2~g2;(3)在七個具塞廣口瓶中各加入環(huán)己垸7.5mL、表面活性劑曲拉通X-1001.8mL和正己醇1.8mL，混合均勻，加入400pL水作為分散相，攪拌均勻后形成反相微乳液，將溶液a2g2分別加入上述七個瓶中，攪拌均勻后加入200正硅酸乙酯和200質(zhì)量分數(shù)為25~28%的氨水，反應(yīng)24h后加入乙醇破乳，離心收集納米棒，依次用乙醇、水洗滌收集到的納米棒，由此可制得一套包含七種類型的多色光學(xué)編碼硅殼納米棒(ag)。(其中b~f為本發(fā)明的多色光學(xué)編碼硅殼納米棒)用透射電子顯微鏡來觀察制備得到的多色光學(xué)編碼硅殼納米棒的形貌(納米棒c)，得到如圖1所示的一個具有代表性的成像圖，由圖可見，該納米顆粒呈棒狀、有明顯的核殼結(jié)構(gòu)，長度主要分布在100200nm之間，寬度約為70nm，殼厚度約為25nm，顆粒分散性好。用熒光分光光度計在相同的激發(fā)波長(460nm)下，對納米棒ag的發(fā)射光譜進行測定，如圖2所示，由圖可見，僅用一種激發(fā)波長就能有效激發(fā)出納米棒ag的熒光，各納米棒在520nm與580nm的發(fā)射峰的比值隨著FITC與TAMRA投料比的減小而減小，該比值可以用于編碼。用活體熒光成像儀以藍光同時對納米棒ag進行激發(fā)來觀察它們的熒光，如圖3所示，由圖3可見，僅用一個波長的光就能有效激發(fā)出各個納米棒的熒光，熒光強、各顆粒所激發(fā)出的熒光隨著FITC與TAMRA投料比的減小而由綠色逐漸過渡到橙紅色，這些不同的顏色也可以用來進行光學(xué)編碼。權(quán)利要求1、一種多色光學(xué)編碼硅殼納米棒，其特征在于所述多色光學(xué)編碼硅殼納米棒為核殼型結(jié)構(gòu)，其外殼材料為二氧化硅，內(nèi)核材料為熒光編碼的多聚賴氨酸，熒光編碼的多聚賴氨酸含有熒光染料A和熒光染料B，熒光染料A和熒光染料B是熒光共振能量轉(zhuǎn)移供體-受體對；所述熒光編碼的多聚賴氨酸是熒光染料A和熒光染料B通過其各自所帶有的活性基團與多聚賴氨酸的胺基共價連接而成。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多色光學(xué)編碼硅殼納米棒，其特征在于所述熒光共振能量轉(zhuǎn)移供體-受體對為下述各熒光染料配對組合中的任意一種組合l:熒光染料A為熒光素異硫氰酸酯，熒光染料B為四甲基羅丹明異硫氰酸酯；組合2:熒光染料A為羧基熒光素琥珀酰亞胺酯，熒光染料B為羧基羅丹明6G琥珀酰亞胺酯；組合3:熒光染料A為羧基羅丹明6G琥珀酰亞胺酯，熒光染料B為羧基-X-羅丹明琥珀酰亞胺酯；組合4:熒光染料A為熒光素異硫氰酸酯，熒光染料B為5-羧基四甲基羅丹明琥珀酰亞胺酯；組合5:熒光染料A為Cy2,NHS，熒光染料B為Cy3,NHS;組合6:熒光染料A為Cy3，NHS，熒光染料B為Cy5，NHS;組合7:熒光染料A為AlexaFluor488dye,SE，熒光染料B為AlexaFluor555dye，SE;組合8:熒光染料A為AlexaFluor555dye,SE，熒光染料B為AlexaFluor647dye,SE;組合9:熒光染料A為BODIPYTR，SE，熒光染料B為BODIPY650/655-X,SE。3.根據(jù)權(quán)利要求l.所述的多色光學(xué)編碼硅殼納米棒，其特征在于所述活性基團為異硫氰酸酯基或琥珀酰亞胺酯基。4.一種如權(quán)利要求1~3中任意一項所述的多色光學(xué)編碼硅殼納米棒的制備方法，其特征在于將熒光染料A和熒光染料B與多聚賴氨酸反應(yīng)制備熒光編碼的多聚賴氨酸，以熒光編碼的多聚賴氨酸為內(nèi)核材料用反向微乳液法將其包裹在二氧化硅基質(zhì)中制備成多色光學(xué)編碼硅殼納米棒。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于具體包括以下步驟(1)熒光編碼多聚賴氨酸的制備將熒光染料A和熒光染料B按要求的比例同時或依次與多聚賴氨酸在碳酸鹽緩沖液中于室溫下反應(yīng)2~3h，用透析法除去過量的熒光染料，制得熒光編碼的多聚賴氨酸；(2)編碼多聚賴氨酸的包殼將7.2~7.5體積的環(huán)己垸、1.61.8體積的表面活性劑曲拉通X-100和1.61.8體積的正己醇混合均勻，往混合液中加入0.4~0.8體積的水作為分散相，攪拌均勻后形成反相微乳液；加入0.2-0.6體積4.0xl(rs8.0xl0"4mol/L的熒光編碼多聚賴氨酸的水溶液，攪拌均勻后再加入0.2~0.4體積的正硅酸乙酯和0.1~0.2體積的氨水，反應(yīng)20~24h后加入丙酮或乙醇破乳，離心收集納米棒并洗滌，最后得到多色光學(xué)編碼硅殼納米棒。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述碳酸鹽緩沖液的濃度為0.01~0.1mol/L。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于當熒光染料的活性基團為異硫氰酸酯基時，碳酸鹽緩沖液的pH值為9.09.5;當熒光染料的活性基團為琥珀酰亞胺酯基時，碳酸鹽緩沖液的pH值為8.0~8.5。8、根據(jù)權(quán)利要求4~7中任意一項所述的制備方法，其特征在于當熒光染料A與熒光染料B所帶的活性基團不同時，將熒光染料A與熒光染料B依次與多聚賴氨酸反應(yīng)制備熒光編碼的多聚賴氨酸。全文摘要本發(fā)明公開了一種多色光學(xué)編碼硅殼納米棒，該多色光學(xué)編碼硅殼納米棒為核殼型結(jié)構(gòu)，其外殼材料為二氧化硅，內(nèi)核材料為熒光編碼的多聚賴氨酸，熒光編碼的多聚賴氨酸含有熒光染料A和熒光染料B，熒光染料A和熒光染料B是熒光共振能量轉(zhuǎn)移供體-受體對。本發(fā)明還公開了一種多色光學(xué)編碼硅殼納米棒的制備方法，它是將熒光染料A和熒光染料B與多聚賴氨酸反應(yīng)制備熒光編碼的多聚賴氨酸，以熒光編碼的多聚賴氨酸為內(nèi)核材料采用反向微乳液法將其包裹在二氧化硅基質(zhì)中制備成多色光學(xué)編碼硅殼納米棒。本發(fā)明的多色光學(xué)編碼硅殼納米棒具有熒光強、生物相容性好、親水性好、染料泄露少、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點。文檔編號C09K11/07GK101333436SQ200810032009公開日2008年12月31日申請日期2008年8月6日優(yōu)先權(quán)日2008年8月6日發(fā)明者何曉曉,王柯敏,秦迪嵐,譚蔚泓申請人:湖南大學(xué)