一種核苷酸序列及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種核苷酸序列及其用途，具體涉及將IL?2的cDNA序列和LMP2A的cDNA序列融合、優(yōu)化后獲得的核苷酸序列，本發(fā)明獲得活體疫苗的以病毒基因及基因產(chǎn)物為靶點，利用EBV陽性腫瘤細胞與正常細胞的差異，選擇性地殺傷腫瘤細胞，為病毒相關(guān)腫瘤的特異性治療提供了新的方法和實驗基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種核苷酸序列及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種核苷酸序列及其用途，屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是 1964年Epstein和Barr在研究非洲兒童的惡 性淋巴瘤時，從瘤細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的一種嗜人類淋巴細胞的γ皰疹病毒，基因組全長 184kb。目前可感染人類的EBV有兩種亞型:EBV-1和EBV-2，其區(qū)別在于編碼核抗原的基因構(gòu) 成不同。EBV可引起兩種不同類型的感染，一種是增殖性感染，另一種是非增殖性感染，在一 定條件下或某些誘導(dǎo)因子的作用下，潛伏的EBV基因組可被激活而轉(zhuǎn)化為增殖性感染。此 外，受EBV感染和轉(zhuǎn)化的宿主細胞在不斷的分裂和增殖過程中如果受到某些輔助因子的促 發(fā)，個別細胞可發(fā)生染色體易位等異常，從而導(dǎo)致細胞轉(zhuǎn)化為惡性增殖。目前研究發(fā)現(xiàn)EBV 感染與多種人類腫瘤發(fā)生相關(guān)，包括伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、胃癌、鼻咽癌等，認為 EBV在這些腫瘤發(fā)生中起到相當(dāng)重要的作用，因此在1997年IARC( International Agency for Research on Cancer)已經(jīng)把EBV歸為第一類致癌因素。因此，研制安全有效的EB病毒 疫苗，從而預(yù)防該病毒引起的諸多疾病及腫瘤的發(fā)生已成為當(dāng)務(wù)之急。
[0003] 由于EBV的潛在致癌性，EBV減毒活疫苗不適合對健康人預(yù)防，在EBV亞單位疫苗基 礎(chǔ)上開展的疫苗研究已成為國內(nèi)外研究的熱點，但至今沒有EB病毒亞單位疫苗的報導(dǎo)。近 年來研究表明體內(nèi)外EBV潛伏感染的所有B細胞中均有潛伏膜蛋白基因 LMP2A表達，研究證 實約50%的EBV相關(guān)胃癌LMP2A陽性，而且LMP2A是鼻咽癌、淋巴瘤等腫瘤細胞穩(wěn)定表達的少 數(shù)EBV保守抗原之一，具有潛在的T細胞激活表位，能介導(dǎo)殺傷性T細胞發(fā)揮作用。LMP2A可成 為EBV相關(guān)腫瘤免疫治療的理想靶抗原，如果把該基因單獨或者聯(lián)合轉(zhuǎn)入表達載體，則可能 表達這種靶抗原，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性的細胞免疫和體液免疫，預(yù)防EBV感染以及殺傷EBV 陽性腫瘤細胞。
[0004] 白細胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是一種細胞因子信使蛋白，其CDNA為462bp， 其首次發(fā)現(xiàn)是作為T細胞增殖因子，從有絲分裂原刺激培養(yǎng)的淋巴細胞中純化出來。IL-2可 以激活部分免疫系統(tǒng)，通過刺激免疫系統(tǒng)血細胞的生長來調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)，除了能刺 激T細胞增殖外，它還可以增強NK細胞的功能，激活淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)，可促進 輔助性T淋巴細胞(⑶4+T)的增殖。
[0005] IL-2是一種理想的治療癌癥的細胞因子。目前被認為是調(diào)節(jié)T細胞反應(yīng)的重要細 胞因子，可以調(diào)節(jié)T細胞活化、擴張和死亡，促進記憶性T細胞在多種細胞因子及受體信號中 持續(xù)表達，IL-2還能促進NK細胞、CD8+T細胞和LAK細胞的有絲分裂，增加荷瘤器官內(nèi)效應(yīng)細 胞的數(shù)量和殺傷腫瘤的活性，同時并不刺激正常細胞的增殖。IL-2也對其它一些免疫細胞， 包括B細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等都有影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種核苷酸序列及其用途，具體涉及將IL-2的CDNA序列和 LMP2A的cDNA序列融合、優(yōu)化后獲得的核苷酸序列，以及該序列在制備預(yù)防和治療EB病毒陽 性腫瘤藥物中應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明核苷酸序列如SEQ ID No.l所示，該核苷酸序列是由IL-2的cDNA序列、 LMP2A的cDNA序列以及融合片段組成，IL-2的cDNA序列的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示， LMP2A的cDNA序列的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，融合片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。本發(fā)明核苷酸序列具體合成過程如下：
[0008] 以a-2的cDNA為模板，上游引物F1，下游重疊引物F2，進行PCR擴增，PCR擴增條件： 95 °C預(yù)變性5min; 95 °C變性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸lmin;變性-退火-延伸過程進行30 個循環(huán)，最后72°C延長lOmin。
[0009] 獲得IL-2片段，F(xiàn)1的核苷酸序列為SEQ ID No.5所示，F(xiàn)2的核苷酸序列為SEQ ID No. 6所示；
[001 0]以LMP2A的cDNA為模板，上游重疊引物F3，下游引物F4，進行PCR擴增，PCR擴增條 件:95 °C預(yù)變性5min; 95 °C變性30s，58 °C退火30s，72 °C延伸3min;變性-退火-延伸過程進行 40個循環(huán)，最后72°C延長10min。
[0011] 獲得LMP2A片段，F(xiàn)3的核苷酸序列為SEQ ID No.7所示，F(xiàn)4的核苷酸序列為SEQ ID No. 8所示。
[0012] 將IL-2片段和LMP2A片段用T4DNA連接酶連接后，用引物F1和引物F4進行PCR擴增， 獲得融合基因 LMPI-2;PCR擴增條件:94°C預(yù)變性2min;94°C變性3〇8,60°(：退火3〇8,72°(：延 伸1.5min;變性-退火-延伸過程進行40個循環(huán)，最后72°C延長10min。
[0013] 獲得的融合基因 LMPI-2，5 '端比IL-2多出8個堿基"GAGAATTC"，3 '端比LMP2A多出8 個堿基 "GTCGACGC"。
[0014]本發(fā)明中，還包括含有核苷酸序列SEQ ID No.l的質(zhì)?；蛘呋铙w疫苗，以及由核苷 酸序列SEQ ID No.l的編碼的蛋白。
[0015] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：
[0016] 本發(fā)明獲得活體疫苗的以病毒基因及基因產(chǎn)物為靶點，利用EBV陽性腫瘤細胞與 正常細胞的差異，選擇性地殺傷腫瘤細胞，為病毒相關(guān)腫瘤的特異性治療提供了新的方法 和實驗基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0017]圖1為rBCG對EBV陽性腫瘤的治療作用圖其中，A.疫苗治療組;B. BCG對照組；
[0018]圖2為rBCG免疫小鼠腫瘤組織浸潤淋巴細胞圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng) 該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修 改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0020]實施例1核苷酸序列SEQ ID No.l的合成過程
[0021] 核苷酸序列SEQ ID No.l是由IL-2的cDNA序列、LMP2A的cDNA序列以及融合片段組 成，IL-2的cDNA序列的核苷酸序列如SEQ ID如.2所示，110^的(^嫩序列的核苷酸序列如 SEQ ID No.3所示，融合片段的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。本發(fā)明核苷酸序列具體合 成過程如下：
[0022]以IL-2的cDNA為模板，上游引物F1，下游重疊引物F2，進行PCR擴增，95 °C預(yù)變性 5min; 95 °C變性30s，60 °C退火45s，72°C延伸2min;變性-退火-延伸過程進行60個循環(huán)，最后 72°C 延長 lOmin。
[0023] 獲得IL-2片段，F(xiàn)1的核苷酸序列為SEQ ID No.5所示，F(xiàn)2的核苷酸序列為SEQ ID No. 6所示；
[0024] 以LMP2A的cDNA為模板，上游重疊引物F3，下游引物F4，進行PCR擴增，獲得LMP2A片 段，F(xiàn)3的核苷酸序列為SEQ ID No.7所示，F(xiàn)4的核苷酸序列為SEQ ID No.8所示。
[0025] 將IL-2片段和LMP2A片段用T4DNA連接酶連接后，用引物F1和引物F4進行PCR擴增， 獲得融合基因 LMPI-2;PCR擴增條件:94°C預(yù)變性lmin;94°C變性458,60°(：退火458,72°(：延 伸1.5min;變性-退火-延伸過程進行40個循環(huán)，最后72°C延長10min。
[0026] 實施例2融合基因 LMPI-2與質(zhì)粒pMV261的連接及轉(zhuǎn)化
[0027] 純化后的基因 LMPI-2和質(zhì)粒pMV261用EcoR I和Sal I酶切后，進行連接;依次加入 LMPI-2基因片段0.1-0.3pmoL，pMV261 lyL，T4DNA 連接酶 1.5yL，用 ddH20 調(diào)至 5yL，再加入連 接緩沖液5yL，16 °C反應(yīng)過夜。
[0028] 將異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)50yl涂于制備的細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基LB固體平板上，室 溫放置2h。從超低溫冰箱中取出感受態(tài)E . co 1 i DH5a細胞，冰浴融化。取30-40μ1 E. co 1 i DH5a細胞與重組質(zhì)粒輕輕混合，冰浴20-30min，42°C熱擊90s，立即冰浴3min;加 lml液體LB 培養(yǎng)基(不含抗生素），37°C培養(yǎng)2h; 12 000r/min(半徑10cm)離心3min，細菌沉淀用LB液體 培養(yǎng)基進行回溶;取適量用LB培養(yǎng)基稀釋后涂布于LB(含IPTG)平板上，37°C培養(yǎng)9h-20h;取 單菌落，做PCR擴增鑒定;取重組正確的細菌，提取質(zhì)粒，即得pMVLMPI-2質(zhì)粒。雙酶切鑒定后 進行測序，測序結(jié)果顯示，細菌中含有核苷酸序列SEQ ID No. 1。
[0029] 實施例3重組BCG的構(gòu)建及表達
[0030] 制備卡介苗(BCG)感受態(tài)：卡介苗(Bacillus Calmette_Gu6rin，簡稱BCG，中文名 稱來自于其
【發(fā)明人】卡氏-介氏）是用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗，使用活的無毒牛型結(jié)核桿菌 (Mycobacterium bovis)制成。
[0031] BCG在Middlebrook7H9培養(yǎng)基37°C搖床培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速為150rpm);待培養(yǎng)液0D600值約 0.6時將BCG菌液加入離心管中，冰浴2h;將BCG菌液加入離心管中，在冰盒中預(yù)冷2h; 4°C離 心:8000rpm，離心15min，丟棄上清;用原始體積的1/10、預(yù)冷的體積濃度為10 %甘油重懸菌 體;重復(fù)上述操作共五次;棄上清，加入原始體積1/50的體積濃度為10 %甘油重懸菌體即得 到感受態(tài)細菌，放置室溫下備用。
[0032] 重組BCG的構(gòu)建
[0033] 將卡介苗(BCG)在Middlebrook7H9中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，冰浴1小時后收集細菌， 用10 %的甘油洗3次后，即為BCG的感受態(tài)。取5 X 106個BCG感受態(tài)細胞，然后將純化的 pMVLMPI-2質(zhì)粒用電穿孔法轉(zhuǎn)化BCG，電穿參數(shù)為:0.4cm的電穿孔杯，電壓2.5KV電容25yF， 電阻1000Ω。作用時間11.6毫秒。37°(：條件下培養(yǎng)10小時后取10(^1涂布在含5〇1^/1111卡那 霉素的Middlebrook7H10固體培養(yǎng)基的離心試管內(nèi)斜面上，37°C繼續(xù)培養(yǎng)直至發(fā)現(xiàn)克隆；3- 4周后挑選陽性克隆，先進行抗酸染色初步鑒定，明確后在含20ml液體培養(yǎng)基的離心試管里 搖床生長。
[0034]試驗例1本發(fā)明在制備預(yù)防和治療EB病毒陽性腫瘤藥物中應(yīng)用 [0035] GT39 (EB病毒陽性胃癌細胞）、FIFC標(biāo)記的兔抗鼠 CD4、PE標(biāo)記的兔抗鼠 CD8a購自BD Pharmingen TM公司；CTL殺傷活性檢測試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；小鼠淋巴細胞分離液購 自天津灝洋生物制品有限公司；中性蛋白酶DISPASE購自Roche公司；6周齡的C57BL/6小鼠， 購自北京華阜康生物科技股份有限公司；鼠 IFN-ELISP0T預(yù)包被試劑盒購自北京曠博生物 技術(shù)有限公司。
[0036] (1)EB病毒陽性腫瘤預(yù)防模型的建立及免疫策略
[0037] 雌性6周齡的C57BL/6小鼠隨機分4組，每組中有18只小鼠，用6只進行腫瘤細胞的 形態(tài)學(xué)實驗、6只需進行免疫機制分析、最后6只需進行生存觀測。第一組注射PBS作為對照； 第二組注射BCG作為對照；第三組注射含空載體pMV261的BCG作對照；第四組注射含目的基 因的重組BCG。
[0038]培養(yǎng)GT39細胞，收集指數(shù)生長期細胞，用PBS調(diào)整細胞濃度，倒置顯微鏡計數(shù)，使?jié)?度為1X107個/ml。無菌操作在2只C57BL/6雌性小鼠右肋腹側(cè)皮下，分別一次性接種250μ1/ 鼠。1個月后處死荷瘤小鼠，無菌操作剝下瘤體。碾碎瘤體并勻漿，加4°C冰冷后的PBS混合， 200目濾網(wǎng)過濾腫瘤細胞，用PBS調(diào)細胞濃度為2 X 105個/ml，最后一次免疫后10天將培養(yǎng)好 的腫瘤細胞無菌操作250μν鼠接種于C57BL/6雌性小鼠右肋腹側(cè)皮下，9天后隨機分組。
[0039] 對實驗小鼠 C57BL/6在進行腫瘤接種前30天，連續(xù)3次進行疫苗接種，中間間隔10 天，免疫時采用右肋腹側(cè)皮下注射的方式進行，第一組于右肋腹側(cè)皮下注射250ylPBS/次/ 只作對照；第二組皮下注射250μ1 BCG(5X108個細菌溶于250μ1 PBS中）/次/只；第三組注 射含空載體PMV261的BCG(5X108個細菌溶于250μ1 PBS中）/次/只；第四組注射含目的基因 的重組BCG(5 X 108個細菌溶于250μ1 PBS中）/次/只。在最后一次免疫后10天接種腫瘤細 胞。在接種腫瘤細胞后40天斷頸處死小鼠，手術(shù)剝離腫瘤并測定各種數(shù)據(jù)。
[0040] (2)疫苗抑瘤活性測量與分析
[0041] 觀察小鼠皮下腫瘤的生長情況，當(dāng)可觸及腫瘤結(jié)節(jié)時，記錄其成瘤時間；然后每間 隔2天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤垂直長徑(X)及短徑(Υ)，計算其體積，公式為：腫瘤體積V = XX Y2/2,第40天(從接種腫瘤細胞起)處死小鼠，手術(shù)剝離腫瘤，稱取瘤重，進行分析。統(tǒng)計各組 瘤體積并計算抑瘤率，腫瘤生長抑制率的計算公式:抑制率（％ )=(對照組平均瘤重-實驗 組平均瘤重）+對照組平均瘤重X 100%。
[0042] (3) ELI SA法檢測血清中特異性抗體
[0043] 最后一次免疫后第10、20天，取各實驗組小鼠眼眶靜脈血，室溫下4h，然后離心 (4000rpm，離心半徑10cm)10min，取血清，-20°C保存。用表達純化的IL-2、LMP2A包被ELISA 板，檢測血清中有無特異性抗體及其滴度。
[0044] 具體步驟如下：
[0045] 1)用包被液稀釋純化的蛋白質(zhì)IL-2、LMP2A至濃度為3μg/ml，100yl/孔包被平板， 冰箱內(nèi)4 °C過夜；
[0046] 2)24小時后，將包被液棄去，用ddH20洗板2次并在吸水紙上扣干；
[0047] 3) 2 %酪蛋白溶液封閉4h，然后吸去封閉液，于吸水紙上扣干；
[0048] 4)將100μΙ/孔用PBS倍比稀釋后的小鼠血清加入酶標(biāo)板，37°C孵育lh;
[0049] 5)用PBST洗板，共5次，然后加入羊抗鼠 IgG(HRP標(biāo)記）抗體0.1μg/ml，37°C孵育 0.5h；
[0050] 6)PBS洗5次后，用A、B液(H2〇2+TMB)顯色，時間為15min，最后用100μΙ/孔硫酸（1M) 終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測450nm的0D值。
[0051] (4)CTL殺傷活性檢測
[0052] 1)制備效應(yīng)細胞:無菌操作獲得rBCG免疫后的小鼠脾細胞懸液，以2.5μg/ml PHA- P刺激淋巴細胞生長，C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天，把收獲的細胞作效應(yīng)細胞。
[0053] 2)制備靶細胞:EB病毒陽性腫瘤細胞置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。
[0054] 3)檢測CTL活性的檢測(乳酸脫氫酶釋放法）：
[0055] 按照試劑盒Non-Radioactive Cytotxixity Assay(Promega公司）說明書操作規(guī) 程進行：
[0056]自然釋放組（效應(yīng)細胞）：收集并調(diào)整其細胞濃度，每孔加50μ1，最后補足至100μΙ (用無血清培養(yǎng)基）；
[0057]自然釋放組(靶細胞）：收集并調(diào)整其細胞濃度，每孔加 IX 105個/50μ1，最后補足 至1〇〇μ1 (用無血清培養(yǎng)基）；
[0058]最大釋放組(靶細胞）：收集并調(diào)整其細胞濃度，每孔加1Χ105個/50μ1，
[0059]最后補足至100μΙ(用無血清培養(yǎng)基）；
[0060]背景釋放組:加 100μΙ無血清培養(yǎng)基；
[0061 ] 實驗組:每孔加稀釋的效應(yīng)細胞濃度分別是1Χ106個/50μ1、2Χ10 6個/50μ1、4Χ 106個/50μ1，靶細胞1 X 105個/50μ1; 1200rpm離心5min(離心半徑8cm)，使其充分接觸，然后 在37 °C下二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h。
[0062]在細胞孵育結(jié)束前40min，將20μ1 5 X裂解液加入到靶細胞最大釋放孔，培養(yǎng)結(jié)束 后，3000rpm離心5min。將離心后獲得的上清50μ1移入新96孔酶標(biāo)板中，每孔加入50μ1底物， 避光30min，然后加50μ1終止液，完成后讀出490nm吸光值。
[0063] CTL殺傷率的計算：
[0064] 實驗組=實驗組平均-培養(yǎng)基背景平均；效應(yīng)細胞自然釋放值=效應(yīng)細胞組自然 釋放平均-培養(yǎng)基背景平均；靶細胞自然釋放值=靶細胞組自然釋放平均-培養(yǎng)基背景平 均;靶細胞最大釋放值=靶細胞組最大釋放平均-體積糾正值平均。
[0065] 殺傷率（％ )=實驗組釋放-效應(yīng)細胞自然釋放-靶細胞自然釋放/靶細胞最大釋 放-靶細胞自然釋放X 1〇〇 %
[0066] (5)免疫小鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)觀察
[0067]對rBCG免疫后小鼠的腫瘤組織石蠟切片進行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察分析其 組織形態(tài)學(xué)變化及免疫后腫瘤組織中腫瘤浸潤淋巴細胞是否出現(xiàn)。具體步驟如下：
[0068] 1)腫瘤的剝離與固定:從免疫小鼠體內(nèi)剝離腫瘤，放入4 %多聚甲醛溶液中固定， 以維持細胞的固有形態(tài)與結(jié)構(gòu)；
[0069] 2)組織的脫水與透明化處理：腫瘤經(jīng)60 %、70 %、80 %乙醇逐級脫水各2h，然后浸 入95%、無水乙醇各2次，每次1.5h，逐步脫去腫瘤組織中的水份。將脫水后的組織塊浸入二 甲苯中進行透明處理；
[0070] 3)包埋:把已透明化處理的腫瘤組織放入溶化的蠟中，置于恒溫箱保溫。當(dāng)組織中 完全被石蠟浸入后包埋;先疊好幾個小紙盒，倒入溶化后的液體石蠟，然后將浸透蠟的組織 置于其中，蠟冷卻凝固后腫瘤可在其中長期保存；
[0071] 4)切片:將包埋后的腫瘤固定于切片機上，開始進行切片，切成5μπι的薄片，為防皺 褶的出現(xiàn)，將切下的薄片放入42°C水中；
[0072] 5)貼片與烤片:將切片在水中伸展之后，用預(yù)先涂有1:1蛋白甘油液的載玻片從水 中撈取薄片，將薄片置于中心，晾干后置于37°C干燥箱中烘干；
[0073] 6)脫蠟:將切片放入二甲苯20min以溶去石蠟，然后將其放入另一二甲苯液體漂洗 20min，最后放入二甲苯、無水乙醇（1:1)溶液中3min;
[0074] 7)復(fù)原：脫蠟完成后將其置于無水乙醇2min，然后放入另一新的無水乙醇2min以 除去二甲苯;然后放入體積分數(shù)為90 %、80 %、70 %、60 %、50 %的酒精中各浸泡2min，最后 放入蒸餾水中泡2min;
[0075] 8)初染:將在蒸餾水中放置后的切片取出浸入蘇木精染液lOmin;然后水中泡洗2-3min；
[0076] 細胞質(zhì)脫色：用鹽酸酒精分化至切片呈磚紅色(約15-20s)，然后用自來水沖洗；
[0077] 9)藍化:用1 %氨水處理l-2min，然后水漂洗l-2min;
[0078] 10)脫水:將切片重新置于體積分數(shù)為65%、75%、85%、95%乙醇逐級脫水，時間 各2min;
[0079] 11)復(fù)染:將切片置于體積分數(shù)為95 %酒精伊紅混合液中染色5min，然后用無水乙 醇浸泡2min，共2次，以完成對組織細胞的脫水；
[0080] 12)透明化處理:經(jīng)二甲苯二次各8min浸泡，使切處透明化及除去組織中的乙醇；
[0081] 13)封固：將切片從第二次浸泡的二甲苯中取出，即可滴上中性加拿大樹膠，蓋上 蓋玻片封固，平放于干燥處，稍加重壓，待干燥后觀察。
[0082] (6)統(tǒng)計學(xué)分析
[0083]對各組數(shù)據(jù)整理后采用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，成瘤時間以及腫瘤的重 量、體積的采用隨機單因素方差分析(AN0VA)統(tǒng)計處理。每兩者之間差異進行t檢驗，以P彡 〇. 05差異有統(tǒng)計學(xué)意義，PS0.01作為差異非常顯著性標(biāo)準(zhǔn)。
[0084] (7)結(jié)果
[0085] 1)小鼠成瘤時間
[0086]各組小鼠的成瘤時間如表1所示，第一組時間約為9天，第二組、第三組成瘤時間與 第一組相比無顯著性差異;第四組成瘤時間最晚，約為20天左右才可以觸摸至腫瘤結(jié)節(jié)。與 各對照組相比，差異達顯著水平(P<〇.05)，見表1。
[0087] 表1各組免疫小鼠皮下接種腫瘤細胞的成瘤時間
[0088]
[0089] 注:*表示與對照組相比，差異顯著(P<0.05)
[0090] 2)小鼠的存活情況
[0091] 在皮下接種腫瘤細胞后的100天內(nèi)，第三天觀察小鼠的存活情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第一、 第二、第三，三個對照組在接種45天內(nèi)全都死亡，而第四組重組BCG免疫后的小鼠在90天仍 有1只存活，與其余各組相比，差異達顯著水平(P<〇.05)。
[0092] 3)重組BCG對腫瘤的抑制作用
[0093] 結(jié)果見表2,可以看出，第一、二、三組平均瘤重差異不顯著，與各對照組相比，第四 組平均重量明顯降低，其對腫瘤的抑制率為85%，與對照組的差異達顯著水平(PS0.05)。 [0094] 表2重組BCG對腫瘤的抑制作用(P〈0 · 01)
[0095]
[0096] 注:*表示與對照組相比，差異顯著(P<0 · 05)
[0097] 4) ELI SA法檢測血清中特異性抗體
[0098] 對于IL-2蛋白的包板，在最后一次免疫后10天，第四組的抗體滴度為1:15800,在 最后一次免疫后30天，第四組的抗體為1:5600。對于LMP2A蛋白包被的平板，分別為1:11000 和1:990，都達非常顯著水平(？〈0.01)，見表3、表4。
[0099]表3各組小鼠血清抗體ELI SA檢測結(jié)果（IL-2包板）
[0100]
[0101] 注:表示與對照組相比，差異非常顯著(P〈〇. 01)
[0102] 表4各組小鼠血清抗體ELI SA檢測結(jié)果(LMP2A蛋白包板）
[0103]
[0104] 注:表示與對照組相比，差異非常顯著(P〈0.01)
[0105] 5)特異性CTL檢測
[0106] 按試劑盒操作方法，設(shè)定效靶比(E/T)分別為10:1、20:1、40:1，測定0D490nm值，分 析CTL活性，隨效靶比逐步增加，重組目的蛋白免疫組殺傷能力增加，這說明產(chǎn)生了對腫瘤 細胞的特異性殺傷能力，而其它各組變化不明顯，重組BCG組與對照組相比差異顯著（P〈 0.05)，結(jié)果如表5,圖1所示。
[0107] 表5CTL特異性殺傷活性（％)
[0108]
[0109] 注表示與對照組相比，差異顯著(PS0.05)
[0110] 6)形態(tài)學(xué)觀察腫瘤浸潤淋巴細胞
[0111] 通過對免疫小鼠腫瘤組織的切片觀察，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過重組BCG免疫的腫瘤組織局部 有淋巴細胞浸潤現(xiàn)象，如圖2中箭頭所示。
【主權(quán)項】
1. 一種核苷酸序列，其特征在于，核苷酸序列為SEQ ID No. 1。2. 含有如權(quán)利要求1所述核苷酸序列SEQ ID No. 1的質(zhì)粒。3. 含有如權(quán)利要求1所述核苷酸序列SEQ ID No. 1的活體疫苗。4. 如權(quán)利要求1所述核苷酸序列中的融合片段SEQ ID No.4。5. 合成如權(quán)利要求1所述核苷酸序列時用的引物，其特征在于，F(xiàn)1的核苷酸序列為SEQ ID No.5，F(xiàn)2的核苷酸序列為SEQ ID No.6;F3的核苷酸序列為SEQ ID No.7，F(xiàn)4的核苷酸序 列為SEQ ID No.8。6. 如權(quán)利要求1所述核苷酸序列在制備預(yù)防和治療EB病毒陽性腫瘤藥物中應(yīng)用。7. 如權(quán)利要求1所述質(zhì)粒在制備預(yù)防和治療EB病毒陽性腫瘤藥物中應(yīng)用。8. 如權(quán)利要求1所述活體疫苗在制備預(yù)防和治療EB病毒陽性腫瘤藥物中應(yīng)用。
【文檔編號】A61P35/00GK106086051SQ201610497033
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月29日
【發(fā)明人】薛慶節(jié), 閆迎春, 李運清, 呂厚東, 陳廷
【申請人】濟寧醫(yī)學(xué)院