提高重組谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿產(chǎn)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種提高重組谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿產(chǎn)量的方法，以含有咖啡堿生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因CaXMT和TCS1的重組谷氨酸棒狀桿菌作為發(fā)酵菌株，通過向發(fā)酵液中添加前體物質(zhì)黃嘌呤核苷，并采用加壓方式對重組菌細胞進行通透化處理，促進重組工程菌對底物黃嘌呤核苷的吸收，在表達的活性蛋白的催化作用下，使底物黃嘌呤核苷經(jīng)過三次甲基化反應(yīng)和一次核苷水解反應(yīng)，最終生成咖啡堿。本發(fā)明通過改變細胞的通透性，促進底物的吸收，操作步驟簡單、產(chǎn)品純度高，為利用微生物工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿奠定了理論基礎(chǔ)。
【專利說明】
提高重組谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及基因工程及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體地說，涉及提高重組谷氨酸棒狀桿 菌發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿產(chǎn)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 咖啡堿即1，3，7-三甲基黃嘌呤，是風(fēng)靡世界的三大軟飲料植物（茶樹、咖啡和可 可）中嘌呤堿的主體成份?？Х葔A作為一種重要的植物次級代謝產(chǎn)物，具有抗菌、抵御生物 入侵等生理作用。同時，咖啡堿對人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)有較強的興奮作用，適量攝入能夠改善 思維活動，振奮神經(jīng)，消除和抵抗疲勞，是重要的藥物原料和飲料、食品添加劑。
[0003] 咖啡堿的制備方法主要包括化學(xué)合成法和生物技術(shù)法。隨著人們對"綠色天然健 康無公害"食品的不斷推崇，利用微生物體外發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿，成為制備"天然咖啡堿"的發(fā) 展趨勢。采用生物工程技術(shù)手段，通過構(gòu)建重組工程菌，在微生物體內(nèi)過表達咖啡堿生物合 成核心途徑中的關(guān)鍵酶基因，利用表達的活性蛋白，催化底物逐步轉(zhuǎn)化為咖啡堿。
[0004] 但是利用該重組工程菌發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿的過程中存在以下問題：其一，黃嘌呤核 苷作為咖啡堿生物合成核心途徑中的前體物質(zhì)，處于代謝途徑中的關(guān)鍵代謝支點，在微生 物體內(nèi)極易代謝為其它產(chǎn)物，且其轉(zhuǎn)運需要特殊的轉(zhuǎn)運蛋白；其二，表達的活性蛋白主要存 在于胞內(nèi)，與底物的接觸機會受限于細胞膜的通透性，大大降低了該重組工程菌的催化性 能。
[0005] 基于以上現(xiàn)狀，需要尋找一種改善細胞通透性的方式，促進底物黃嘌呤核苷向胞 內(nèi)的轉(zhuǎn)運，從而提尚酶的利用率，進一步提尚咖啡喊的得率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿的工程菌，特別是一種產(chǎn)咖啡堿的重組 谷氨酸棒狀桿菌工程菌。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供一種提高重組谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿產(chǎn)量的 方法。
[0008] 本發(fā)明以構(gòu)建的產(chǎn)咖啡堿重組谷氨酸棒狀桿菌工程菌為載體，通過加壓處理改善 細胞通透性、提高底物黃嘌呤核苷(XR)滲透性，促進細胞對底物的吸收，從而提高重組工程 菌的催化效率，催化黃嘌呤核苷三次甲基化反應(yīng)和一次脫核糖反應(yīng)，最終轉(zhuǎn)化為咖啡堿。
[0009] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種重組谷氨酸棒狀桿菌，所述重組菌是 通過將咖啡堿生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因 CaXMT和TCS1導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌 (Corynebacterium glutamicum)構(gòu)建而成的。
[0010] 本發(fā)明的基因 CaXMT來源于咖啡果，基因 TCS1來源于茶樹。
[0011 ] 通過將所述基因 CaXMT和TCS1構(gòu)建到同一穿梭表達載體PZ8-1上，然后導(dǎo)入谷氨酸 棒狀桿菌中得到重組菌。
[0012]本發(fā)明使用的谷氨酸棒狀桿菌為ATCC 13032。
[0013] 優(yōu)選地，根據(jù)谷氨酸棒狀桿菌的密碼子使用頻率，對兩個目的基因 CaXMT和TCS1的 序列進行密碼子優(yōu)化，再于兩個目的基因序列前面各設(shè)計一段RBS序列。此外，為了使其定 向插入表達載體PZ8-1中，分別在CaXMT基因序列的5 '端加入BamHI酶切位點，在TCS1基因序 列的3 '端加入Ps?酶切位點。最終構(gòu)建得到含有啟動子、核糖體結(jié)合位點（RBS序列）、操縱 子和終止子四大表達元件以及優(yōu)化的CaXMT和TCS1基因序列的表達盒，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0014] 更優(yōu)選地，將上述表達盒連接到載體pZ8-l上，然后導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌中得到重 組菌。
[0015] 本發(fā)明還提供所述重組谷氨酸棒狀桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明進一步提供提高重組谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿產(chǎn)量的方法，其是以 上述構(gòu)建的重組谷氨酸棒狀桿菌作為發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿的菌株，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，向發(fā)酵 液中添加一定濃度的黃嘌呤核苷，并采用加壓方式對所述重組菌細胞進行通透化處理，促 進重組菌對底物黃嘌呤核苷的吸收，從而提高咖啡堿的發(fā)酵產(chǎn)量。
[0017] 所述方法包括以下步驟：
[0018] 1)細胞培養(yǎng):活化重組菌菌株，接種到LB培養(yǎng)基中，30°C，200rpm條件下振蕩培養(yǎng) 12h，4°C離心收獲菌體沉淀;菌體沉淀用不含碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基CGXII清洗2~3次后，重懸 于含有2%葡萄糖的CGXII培養(yǎng)基中，所得菌懸液的有效活菌數(shù)為10 6CFU/mL;
[0019] 2)添加底物：向上述菌懸液中添加一定濃度的黃嘌呤核苷，繼續(xù)30°C，200rpm條件 下振蕩培養(yǎng)8h;
[0020] 3)細胞通透性處理:對上述發(fā)酵體系進行加壓的細胞通透性處理，促進細胞對底 物黃嘌呤核苷的吸收；
[0021] 4)酶催化反應(yīng):將步驟3)的發(fā)酵液繼續(xù)30°C，200rpm條件下振蕩培養(yǎng)120h，直至 OD6〇Qr?值為3.2-3.6時，結(jié)束發(fā)酵。采用超高效液相色譜(UPLC)定量測定發(fā)酵產(chǎn)生的咖啡堿。 [0022]咖啡堿樣品的制備：向4mL發(fā)酵液中加入等體積的乙酸乙酯或氯仿，充分振蕩并靜 置分層后，取有機層，30 °C下真空離心干燥后，重懸于無菌水中，0.22um濾膜過濾后，濾液用 于UPLC檢測分析。
[0023]前述的方法，步驟2)向菌懸液中添加終濃度為0.1-lmg/mL的黃嘌呤核苷。
[0024] 前述的方法，步驟3)加壓處理的條件為0.02-0.05Mpa處理lmin。
[0025] 本發(fā)明所用培養(yǎng)基CGXII的配方為：（NH4)2S〇4 20g/L，K2HP〇4 lg/L，KH2P〇4 10g/L， MgS〇4.7H20 250mg/L，M0PS 42g/L，尿素5g/L，維生素 H (h2mg/L，硫胺素500yg/L，微量元素 0 · 2mg/L，葡萄糖 25g/L，pH值 7 · 0-7 · 2。
[0026] 本發(fā)明通過加壓處理改善細胞通透性，促進重組工程菌對底物黃嘌呤核苷的吸 收，提高重組工程菌催化性能，從而提高咖啡堿的產(chǎn)量。本方法操作步驟簡單，無毒害有機 物質(zhì)殘留，產(chǎn)物能分泌到胞外，分離純化簡單，對提高發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿的產(chǎn)量具有重要意 義，也為利用微生物工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿奠定了理論基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0027] 圖1為本發(fā)明實施例1中構(gòu)建的重組表達載體的質(zhì)粒圖譜。
[0028] 圖2為本發(fā)明實施例2中重組谷氨酸棒狀桿菌工程菌的發(fā)酵液UPLC檢測結(jié)果。其 中，正常對照組是指重組谷氨酸棒狀桿菌直接喂養(yǎng)底物后發(fā)酵液的UPLC檢測結(jié)果;加壓觀 察組是指在對照組同樣操作的基礎(chǔ)上，對發(fā)酵體系做加壓處理后發(fā)酵液的UPLC檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0029]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例 均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0030] 以下實施例中所用的限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、PCR試劑、In-f us ion試劑盒等 均購自TaKaRa生物公司，質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自Axygen公司，大腸桿菌感受 態(tài)細胞trans T1、DNA marker均購自北京全式金生物科技有限公司。所用引物由通用生物 公司合成，全基因合成由南京金斯瑞生物科技公司完成。
[0031] 實施例1產(chǎn)咖啡堿的谷氨酸棒狀桿菌重組工程菌的構(gòu)建
[0032] 1、茶樹咖啡堿生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因 CaXMT和TCS1的獲得
[0033]本實施例中兩個目的基因的原始序列來自于GenBank，其中基因 CaXMT登錄號為 AB048793,基因 TCS1登錄號為AB031280。首先，為了使插入的CaXMT和TCS1基因能夠在谷氨 酸棒狀桿菌中正常表達，需構(gòu)建含有啟動子、核糖體結(jié)合位點（RBS序列）、操縱子和終止子 四大表達元件的表達盒。同時，根據(jù)谷氨酸棒狀桿菌的密碼子使用頻率，對兩個目的基因的 序列進行密碼子優(yōu)化，再于兩個目的基因序列前面各設(shè)計一段RBS序列。此外，為了使其定 向插入表達載體PZ8-1中，分別在CaXMT基因序列的5 '端加入BamHI酶切位點，在TCS1基因序 列的3'端加入PstI酶切位點。最后將優(yōu)化后的基因片段交由南京金斯瑞生物科技公司人工 合成。構(gòu)建得到的表達盒的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0034] 2、重組表達載體的構(gòu)建
[0035] 純化后的表達盒，利用T4DNA連接酶將其與經(jīng)BamHI和PstI消化處理的表達質(zhì)粒 PZ8-1在16°C水浴條件下過夜連接，并將連接液轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞trans T1中，取 100uL轉(zhuǎn)化液涂布于含有50yg/mL卡那霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10_12h，并通過 菌落PCR篩選陽性單克隆，得到的陽性單克隆送公司測序，進一步驗證目的基因序列的正確 性，從而得到重組表達載體pZ8-CaXMT-TCSl，質(zhì)粒圖譜如圖1所示。
[0036] 3、轉(zhuǎn)化宿主及重組工程菌的篩選
[0037] 利用化學(xué)方法制備C.glutamicum ATCC 13032感受態(tài)細胞，并將上述重組表達質(zhì) 粒電轉(zhuǎn)化至C.glutamicum ATCC 13032感受態(tài)細胞中，取100yL轉(zhuǎn)化液涂布于含有25yg/mL 卡那霉素的LB平板上，30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36-48h至長出單菌落，并通過菌落PCR篩選目的重 組菌株。同時，為了排除表達載體PZ8-1的干擾，將不含有目的基因的空質(zhì)粒pZ8-l也電轉(zhuǎn)入 ATCC 13032感受態(tài)細胞中作為對照組CK，最終成功構(gòu)建得到重組工程菌C.glutamicum ATCC 13032/pZ8-CaXMT-TCSl〇
[0038]實施例2重組谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿
[0039] 1、種子培養(yǎng):活化實施例1制備的重組工程菌，接種于40mL含有25yg/mL卡那霉素 的LB培養(yǎng)基中，30 °C、200rpm條件下振蕩培養(yǎng)12h。
[0040] 2、清洗細胞:取40mL發(fā)酵液4°C、6000rpm條件下離心10min，離心結(jié)束后，棄上清收 集菌體，并用不含有碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基CGXII清洗3次，最后重懸于50mL含有2%葡萄糖的 CGXII培養(yǎng)基中，裝液量為50mL/250mL，所得菌懸液的有效活菌數(shù)為106CFU/mL。
[0041] 3、添加底物:無菌條件下，向上述50mL菌懸液中添加終濃度為0.1-lmg/mL的黃嘌 呤核苷，繼續(xù)30 °C，200rpm條件下振蕩培養(yǎng)120h。
[0042] 4、細胞通透性處理:為了促進重組谷氨酸棒狀桿菌對底物XR的吸收，添加完底物 后，對發(fā)酵進行加壓處理，從而改善細胞通透性，加壓條件為0. 〇2MPa，處理lmin。
[0043] 5、酶催化反應(yīng)及咖啡堿的測定
[0044] 將經(jīng)加壓處理后的發(fā)酵液繼續(xù)30°C、200rpm條件下振蕩培養(yǎng)120h，直至0D6Q() nm值為 3.2-3.6時，結(jié)束發(fā)酵。
[0045]取一定體積的發(fā)酵液利用UPLC法檢測發(fā)酵液中咖啡堿的累積情況。
[0046]咖啡堿樣品的制備：向4mL發(fā)酵液中加入等體積的乙酸乙酯或氯仿，充分振蕩并靜 置分層后，取有機層，30 °C下真空離心干燥后，重懸于無菌水中，0.22um濾膜過濾后，濾液用 于UPLC檢測分析。
[0047] 儀器:Waters ACQUITY超高效液相色譜儀
[0048] 色譜柱：Phenomenex kinetex 2.6 um XB-C18 100 A
[0049] 流動相:A:0.2%乙酸水;B:純乙腈
[0050] 梯度洗脫條件：0-8min，A:98%-90% ;8-10min，A:90%-75% ; 10-11.5min;
[0051] A：75% ；11.5min-14min,75%-98% ；14min-18min,A：98%
[0052] 色譜條件:流速，0.4mL/min;柱溫，30 °C ;進樣量，10yL;紫外檢測波長，274nm。
[0053] 為了確定加壓方式能夠有效改善細胞通透性，同時設(shè)置一組不經(jīng)上述步驟4的細 胞通透性處理的重組工程菌作為對照組，直接采用UPLC法測定發(fā)酵液中咖啡堿的含量。 [0054] UPLC檢測結(jié)果如圖2所示，從圖中可以看出，對照組和經(jīng)本發(fā)明提供的改善細胞通 透性方法處理后的觀察組，均能催化黃嘌呤核苷轉(zhuǎn)化為咖啡堿。定量計算結(jié)果顯示，經(jīng)加壓 處理的觀察組發(fā)酵液中，咖啡堿含量達到1.68mg/L，高于對照組的0.14mg/L。
[0055]以上發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果說明，以基因工程方法構(gòu)建的重組谷氨酸棒狀桿菌工程菌為生 物催化劑，經(jīng)過加壓處理改善其細胞通透性，能夠促進重組細胞對底物的吸收，提高催化性 能，進一步提高了重組工程菌從黃嘌呤核苷制備咖啡堿的能力，為今后利用谷氨酸棒狀桿 菌發(fā)酵生產(chǎn)食品安全級咖啡堿奠定了理論基礎(chǔ)，具備工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。
[0056]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權(quán)項】
1. 重組谷氨酸棒狀桿菌，其特征在于，所述重組菌是通過將咖啡堿生物合成途徑中的 關(guān)鍵酶基因〇3乂]\11'和1'031導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌（(]〇^116&3(^61'；[111118111丨3111；[〇11111)構(gòu)建而成 的。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組谷氨酸棒狀桿菌，其特征在于，基因 CaXMT來源于咖啡果， 基因 TCS1來源于茶樹。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組谷氨酸棒狀桿菌，其特征在于，其是將所述基因 CaXMT 和TCS1構(gòu)建到同一穿梭表達載體pZ8-l上，然后導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌中得到的重組菌。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的重組谷氨酸棒狀桿菌，其特征在于，所述谷氨酸棒狀 桿菌為 ATCC 13032。5. 權(quán)利要求1-4任一項所述重組谷氨酸棒狀桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿中的應(yīng)用。6. 提高重組谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿產(chǎn)量的方法，其特征在于，以權(quán)利要求1-4 任一項所述重組谷氨酸棒狀桿菌作為發(fā)酵生產(chǎn)咖啡堿的菌株，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，向發(fā)酵 液中添加一定濃度的黃嘌呤核苷，并采用加壓方式對所述重組菌細胞進行通透化處理，促 進重組菌對底物黃嘌呤核苷的吸收，從而提高咖啡堿的發(fā)酵產(chǎn)量。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 細胞培養(yǎng):活化重組菌菌株，接種到LB培養(yǎng)基中，30°C，200rpm條件下振蕩培養(yǎng)12h，4 °C離心收獲菌體沉淀;菌體沉淀用不含碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基CGXII清洗2~3次后，重懸于含有 2%葡萄糖的CGXII培養(yǎng)基中，所得菌懸液的有效活菌數(shù)為10 6CFU/mL; 2) 添加底物：向上述菌懸液中添加一定濃度的黃噪呤核苷，繼續(xù)30°C，200rpm條件下振 蕩培養(yǎng)8h; 3) 細胞通透性處理：對上述發(fā)酵體系進行加壓的細胞通透性處理，促進細胞對底物黃 嘌呤核苷的吸收； 4) 酶催化反應(yīng):將步驟3)的發(fā)酵液繼續(xù)30°C，200rpm條件下振蕩培養(yǎng)120h，直至OD600nm 值為3.2-3.6時，結(jié)束發(fā)酵。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟3)加壓處理的條件為0.02-0.05Mpa處 理lmin〇9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，所用培養(yǎng)基CGXII的配方為：（NH4)2S〇4 20g/L，K 2HP〇4 lg/L，KH2P〇4 10g/L，MgS〇4.7H20 250mg/L，M0PS 42g/L，尿素5g/L，維生素Η 0 · 2mg/L，硫胺素 500yg/L，微量元素 0 · 2mg/L，葡萄糖 25g/L，pH值 7 · 0-7 · 2。10. 根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項所述的方法，其特征在于，步驟2)向菌懸液中添加終濃度 為0.1-lmg/mL的黃噪呤核苷。
【文檔編號】C12N15/77GK106085941SQ201610475884
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月22日
【發(fā)明人】張正竹, 李萌萌, 鄧威威, 寧井銘, 鄧騁
【申請人】安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)