油脂代謝相關(guān)蛋白GmNF307在植物油脂代謝調(diào)控中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了油脂代謝相關(guān)蛋白GmNF307在植物油脂代謝調(diào)控中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)：a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白質(zhì)；b)在SEQ ID No.2所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)；c)將SEQ ID No.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與油脂代謝調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)。實驗表明，本發(fā)明提供的油脂代謝相關(guān)蛋白GmNF307，其編碼基因GmNF307的過量表達，可提高植物組織和/或器官總油脂含量和/或提高植物組織和/或器官中部分脂肪酸含量。
【專利說明】
油脂代謝相關(guān)蛋白GmNF307在植物油脂代謝調(diào)控中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中油脂代謝相關(guān)蛋白GmNF307在植物油脂代謝調(diào)控中 的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在世界上的幾種主要產(chǎn)油作物中，大豆總產(chǎn)油量約占30%，居世界植物油產(chǎn)量的 第一位。
[0003] 脂肪酸的合成是植物體中最重要的代謝途徑之一，它存在于植物體的任何一個細 胞中，是生長發(fā)育所必須的，對其合成的阻斷會導(dǎo)致細胞死亡，因而至今為止還沒有發(fā)現(xiàn)一 個阻斷脂肪酸合成的植物突變體。植物同其它真核生物參與脂肪酸合成途徑的酶有很大差 異。從乙酰CoA和丙二酰CoA合成16或18個碳原子的脂肪酸至少需要30個不同的酶催化 的反應(yīng)來完成這一過程，而在動物、真菌及一些細菌中，以上反應(yīng)是由一個存在于胞質(zhì)中的 多酶復(fù)合體完成。在植物中參加脂肪酸合成的酶以可溶的形式獨立存在于質(zhì)體的胞質(zhì)中。
[0004] 大多數(shù)植物中，油脂都以三酰甘油（Triacylglycerols，TAG)的形式儲藏，它的含 量是一個非常重要的農(nóng)藝性狀，TAG的生物合成稱之為Kennedy途徑，如同真核生物中合成 膜甘油酯的途徑，脂肪酸去除CoA后被轉(zhuǎn)移到3-磷酸甘油的1和2位，形成中間產(chǎn)物PA。 PA去磷酸化產(chǎn)生DAG。在TAG合成的最后一步，第三個脂肪酸分子被轉(zhuǎn)移到空的DAG 3'-OH 位置，這一步反應(yīng)是由二酰甘油乙酰轉(zhuǎn)移酶（diacylglycerol acyltransferase，DGAT)催 化的，此反應(yīng)被認為是TAG生物合成中唯一的限速步驟。
[0005] 人們已對脂類合成途徑有了認知，并且已經(jīng)克隆了很多參與脂類合成的酶基因。 然而，在植物中，對脂類合成的調(diào)控機理及其相關(guān)基因仍然知之甚少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何調(diào)控植物油脂代謝。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了油脂代謝相關(guān)蛋白在調(diào)控植物油脂代謝 中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明所提供的油脂代謝相關(guān)蛋白在調(diào)控植物油脂代謝中的應(yīng)用中，所述油脂代 謝相關(guān)蛋白的名稱為GmNF307,為如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)：
[0009] a)氨基酸序列是SEQ ID No. 2所示的蛋白質(zhì)；
[0010] b)在SEQ ID No. 2所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)；
[0011] c)將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加得到的與油脂代謝調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)。
[0012] 其中，SEQ ID No. 2由307個氨基酸殘基組成。
[0013] 為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在SEQ ID No. 2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧 基末端連接上如表1所示的標簽。
[0014] 表1、標簽的序列
[0015]
[0016] 上述c)中的蛋白質(zhì)GmNF307,所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0017] 上述c)中的蛋白質(zhì)GmNF307可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表 達得到。
[0018] 上述c)中的蛋白質(zhì)GmNF307的編碼基因可通過將SEQ ID No. 1所示的DNA序列 中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或 在其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。
[0019] 上述油脂代謝相關(guān)蛋白在調(diào)控植物油脂代謝的應(yīng)用中，所述調(diào)控植物油脂代謝具 體可為調(diào)控植物組織和/或器官總油脂含量和/或調(diào)控植物組織和/或器官中脂肪酸含 量。
[0020] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了與所述GmNF307相關(guān)的生物材料。
[0021] 本發(fā)明所提供的與所述GmNF307相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物油脂代謝的應(yīng)用中， 與所述GmNF307相關(guān)的生物材料，為下述A1)至A20)中的任一種：
[0022] A1)編碼所述GmNF307的核酸分子；
[0023] A2)含有A1)所述核酸分子的表達盒；
[0024] A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體；
[0025] A4)含有A2)所述表達盒的重組載體；
[0026] A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物；
[0027] A6)含有A2)所述表達盒的重組微生物；
[0028] A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；
[0029] A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；
[0030] A9)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；
[0031] A10)含有A2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；
[0032] All)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；
[0033] A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；
[0034] A13)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0035] A14)含有A2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0036] A15)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0037] A16)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0038] A17)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官；
[0039] A18)含有A2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物器官；
[0040] A19)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官；
[0041] A20)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官。
[0042] 上述與所述GmNF307相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物油脂代謝中的應(yīng)用中，A1)所述 核酸分子為如下al)或a2)或a3)所示的基因：
[0043] al)其編碼序列是SEQ ID No. 1的cDNA分子或DNA分子；
[0044] a2)與1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述GmNF307的 cDNA分子或基因組DNA分子；
[0045] a3)在嚴格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述GmNF307的cDNA 分子或基因組DNA分子。
[0046] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也 可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0047] 其中，SEQ ID No. 1由924個核苷酸組成，編碼SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
[0048] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方 法，對本發(fā)明的編碼GmNF307的核苷酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明 分離得到的GmNF307的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要編碼GmNF307且具 有GmNF307功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0049] 這里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本 發(fā)明的編碼SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75%或更高， 或85 %或更高，或90 %或更高，或95 %或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或 計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比（％) 表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。
[0050] 上述生物材料中，所述嚴格條件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下雜交 并洗膜2次，每次5min，又于0. 5 X SSC，0. 1 % SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每 次15min ;或，0? 1XSSPE (或0? 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0051] 上述75%或75%以上同一性，可為80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0052] 上述生物材料中，A2)所述的含有編碼GmNF307的核酸分子的表達盒（GmNF307基 因表達盒），是指能夠在宿主細胞中表達GmNF307的DNA，該DNA不但可包括啟動SiNF-YB8 基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止GmNF307基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進一步，所述表達盒還可 包括增強子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動子包括但不限于：組成型啟動子，組織、器官和發(fā)育 特異的啟動子，和誘導(dǎo)型啟動子。啟動子的例子包括但不限于：花椰菜花葉病毒的組成型 啟動子35S :來自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動子，亮氨酸氨基肽酶（"LAP"，Chao等人（1999) Plant Physiol 120:979-992);來自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子，發(fā)病機理相關(guān)1(PR1)(由 水楊酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羥酸S-甲酯）誘導(dǎo)）；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動 子（PIN2)或LAP啟動子（均可用茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo)）；熱休克啟動子（美國專利5,187， 267);四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子（美國專利5,057, 422);種子特異性啟動子，如谷子種子特異性 啟動子PF128 (CN101063139B (中國專利200710099169. 7))，種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動子 (例如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大豆beta conglycin的啟動子（Beachy等人（1985) EMBO J. 4:3047-3053))。它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用。此處引用的 所有參考文獻均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子 (N0S終止子）、花椰菜花葉病毒CaMV 35S終止子、tml終止子、豌豆rbcS E9終止子和胭脂 氨酸和章魚氨酸合酶終止子（參見，例如：〇dell等人（I9S5)Nature313:810 ;Rosenberg等 人（1987) Gene, 56:125 ;Guerineau 等人（1991) Mol. Gen. Genet, 262:141 ;Proudfoot (1991) Cell, 64:671 ;Sanfacon 等人 Genes Dev.，5:141 ;Mogen 等人（1990)Plant Cell, 2:1261 ; Munroe 等人（1990)Gene, 91:151 ;Ballad 等人（1989)Nucleic Acids Res. 17:7891 ;Joshi 等人（1987)Nucleic Acid Res. ,15:9627)。
[0053] 可用現(xiàn)有的表達載體構(gòu)建含有所述GmNF307基因表達盒的重組載體。所述植 物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如PAHC25、pBin438、 PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA139卜Xa 或 pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司）等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3'端非翻譯 區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷 酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)（Ti)質(zhì)粒基因（如 胭脂堿合成酶基因Nos)、植物基因（如大豆貯存蛋白基因）3'端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類 似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄 增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼 序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源 是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基 因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工， 如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因（GUS基因、螢光 素酶基因等）、抗生素的標記基因（如賦予對卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基因，賦 予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對氨甲 喋呤抗性的dhfr基因，賦予對草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化學(xué)試劑標記基因等（如 抗除莠劑基因）、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全 性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0054] 上述與所述GmNF307的生物材料在調(diào)控植物油脂代謝中的應(yīng)用中，所述載體可為 質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。
[0055] 上述與所述GmNF307的生物材料在調(diào)控植物油脂代謝中的應(yīng)用中，所述的微生物 可為酵母、細菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。
[0056] 上述與所述GmNF307的生物材料在調(diào)控植物油脂代謝中的應(yīng)用中，所述轉(zhuǎn)基因植 物細胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織和轉(zhuǎn)基因植物器官均不包括繁殖材料。
[0057] 上文中，所述調(diào)控植物組織和/或器官總油脂含量為提高植物組織和/或器官總 油脂含量；所述調(diào)控植物組織和/或器官中脂肪酸含量為提高植物組織和/或器官中脂肪 酸含量；所述脂肪酸為棕櫚酸、油酸、亞油酸、亞麻酸和貢多酸中的五種、四種、三種、兩種或 一種。
[0058] 上文中，所述器官具體可為種子；所述植物可為種子植物，所述種子植物可為單子 葉植物和/或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為豆科植物和/或十字花科植物和/ 或菊科植物；所述豆科植物可為大豆、百脈根、苜蓿或水黃皮；所述十字花科植物可為擬南 芥或油菜；所述菊科植物可為向日葵；所述單子葉植物可為玉米。所述大豆具體可為大豆 Williams 82 等品種。
[0059] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0060] 本發(fā)明所提供的一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將所述油脂代謝相關(guān)蛋白的編 碼基因?qū)胧荏w植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物組織和/或器官中總油 脂含量和/或脂肪酸含量高于所述受體植物。
[0061] 上述培育轉(zhuǎn)基因植物的方法中，所述油脂代謝相關(guān)蛋白的編碼基因的編碼序列是 SEQ ID No. 1 的 DNA 分子。
[0062] 上述培育轉(zhuǎn)基因植物的方法中，所述脂肪酸為棕櫚酸、油酸、亞油酸、亞麻酸和貢 多酸中的五種、四種、三種、兩種或一種。
[0063] 上述培育轉(zhuǎn)基因植物的方法中，所述器官具體可為種子；所述植物可為種子植物， 所述種子植物可為單子葉植物和/或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為豆科植物和/ 或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可為大豆、百脈根、苜?；蛩S皮；所述十 字花科植物可為擬南芥或油菜；所述菊科植物可為向日葵；所述單子葉植物可為玉米。所 述大豆具體可為大豆Williams 82等品種。
[0064] 在本發(fā)明的實施例中，所述GmNF307的編碼基因（即SEQ ID No. 1所示的DNA分 子）通過含有GmNF307基因表達盒的GmNF307基因重組表達載體導(dǎo)入所述受體植物中。
[0065] 上述培育轉(zhuǎn)基因植物的方法中，其中所述GmNF307基因可先進行如下修飾，再導(dǎo) 入受體植物中，以達到更好的表達效果：
[0066] 1)根據(jù)實際需要進行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達；例如，可根據(jù)受體植物所 偏愛的密碼子，在保持本發(fā)明所述GmNF307基因的氨基酸序列的同時改變其密碼子以符合 植物偏愛性；優(yōu)化過程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實 現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達，其中GC含量可為35 %、多于45 %、多于50 %或多于約 60% ；
[0067] 2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中 已知的有效的序列進行修飾；
[0068] 3)與各種植物表達的啟動子連接，以利于其在植物中的表達；所述啟動子可包括 組成型、誘導(dǎo)型、時序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動子；啟動子的 選擇將隨著表達時間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性 表達啟動子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時期而定；盡管證明了來源于雙子葉植物的許多 啟動子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動子用于 雙子葉植物中的表達，單子葉植物的啟動子用于單子葉植物中的表達；
[0069] 4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達效率；例如來源于 CaMV的tml，來源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā) 明基因進行連接；
[0070] 5)引入增強子序列，如內(nèi)含子序列（例如來源于Adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序 列（例如來源于TMV，MCMV和AMV)。
[0071] 所述GmNF307基因重組表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒，植物病毒栽體，直接DNA 轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細胞（Weissbach, 1998, Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press, New York, pp. 411-463 ；Geiserson and Corey, 1998, Plant Molecular Biology (2nd Edition). )〇
[0072] 上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述GmNF307基因轉(zhuǎn)化目的植物 得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因， 也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述 轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。
[0073] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了擴增編碼所述GmNF307蛋白的核酸分子全 長或其片段的引物對。
[0074] 本發(fā)明的實驗證明，將GmNF307基因轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中得到的轉(zhuǎn)基因擬南芥種 子中的總油脂含量和/或部分脂肪酸含量顯著高于野生型擬南芥，表明GmNF307蛋白對種 子中總油脂的合成呈正調(diào)控作用，其編碼基因GmNF307的過量表達，可提高轉(zhuǎn)基因植株種 子中總油脂的含量，GmNF307蛋白還可提尚種子中部分脂肪酸的含量，如棕櫚酸（16:0)、油 酸（18:1)、亞油酸（18:2)、亞麻酸（18:3)和貢多酸（20:1)。說明本發(fā)明提供的GmNF307蛋 白是一種與植物油脂代謝調(diào)控相關(guān)的蛋白，可用于改良作物油脂成份和/或培育高油脂和 高產(chǎn)量品種。
[0075] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
【附圖說明】
[0076] 圖1為GmNF307基因在大豆種子的球狀胚、心形胚、子葉、發(fā)育早期、發(fā)育中期、發(fā) 育晚期和干種子中的相對表達量。內(nèi)參是大豆Tublin基因。
[0077] 圖2為載體示意圖。其中A為載體pCR?8八;W/T0P0示意圖，B為pGWB41 l-GmNF307 部分示意圖。
[0078] 圖3為GmNF307基因在野生型擬南芥和三個1~3代純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株 系中的相對表達量。
[0079] WT :野生型擬南芥；0E-13 :T3R純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系0E-13 ;0E-15 : 丁3代純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系0E-15 ;0E-18 :T 3代純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系 0E-18〇
[0080] 圖4為野生型擬南芥和三個1~3代純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系的種子中總油 脂含量測定結(jié)果。
[0081] WT :野生型擬南芥；0E-13義代純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系0E-13 ;0E-15 : 丁3代純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系0E-15 ;0E-18 :T 3代純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系 0E-18 ;*表示與野生型擬南芥相比，具有顯著差異。
[0082] 圖5為野生型擬南芥和三個1~3代純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系的種子中脂肪 酸含量測定結(jié)果。
[0083] WT :野生型擬南芥；0E-13義代純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系0E-13 ;0E-15 : 丁3代純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系0E-15 ;0E-18 :T 3代純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系 0E-18 ;*表示與野生型擬南芥相比，具有顯著差異。
【具體實施方式】
[0084] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為 常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0085] 下述實施例中的載體 pGWB411 (Tsuyoshi Nakagawa，et al.，Development of Series of Gateway Binary Vectors pGWBs, for Realizing Efficient Construction of Fusion Genes for Plant Transformation, JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOEN GINEERING, 2007, Vol. 104, No. 1，34 - 41.)由日本島根大學(xué) Tsuyoshi Nakagawa 博士 (E. mail: tnakagawilife. shimane~u. ac. jp)提供，公眾經(jīng) Tsuyoshi Nakagawa 博士同意后 可從中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所（即
【申請人】）獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相 關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。
[0086] 下述實施例中的大豆Williams 82 (Scott A Jackson, et al. Genome sequence of the palaeopolyploid soybean，Nature，2010，Vol.463，178_183)由美國普渡大學(xué) Scott Jackson教授饋贈，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所（即
【申請人】）獲得，該生 物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。在下文中大豆Williams 82簡稱大豆。
[0087] 下述實施例中的農(nóng)桿菌GV3101 (Lee CW, et al. Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogen defense in Arabidopsis thaliana，Plant Cell, 2009, 21 (9) ,2948-62)公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究 所（即
【申請人】）獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使 用。
[0088] 下述實施例中擬南芥（Arabidopsis thaliana) (Columbia-0 亞型）（Kim H, Hyun Y, Park J, Park M, Kim M, Kim H, Lee M, Moon J, Lee I, Kim J. A genetic link between cold responses and flowering time through FVE in Arabidopsis thaliana. Nature Genetics. 2004, 36:167-171)。公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所（即
【申請人】） 獲得，以重復(fù)本申請實驗。
[0089] 下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實施例中的定量實 驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，數(shù)據(jù)為三次重復(fù)實驗的平均值或平均值土標準差。
[0090] 實施例1、利用油脂代謝相關(guān)蛋白基因培育轉(zhuǎn)基因擬南芥植物
[0091] 本實施例提供了一個來源于大豆的油脂代謝相關(guān)蛋白基因，將其命名為油脂代謝 相關(guān)蛋白GmNF307基因。
[0092] 制備序列表中SEQ ID No. 1所示的DNA分子（即油脂代謝相關(guān)蛋白GmNF307基因， 簡稱GmNF307基因），SEQ ID No. 1所示的DNA分子編碼SEQ ID No. 2所示的蛋白質(zhì)（即油 脂代謝相關(guān)蛋白GmNF307,簡稱GmNF307蛋白）。
[0093] 1、GmNF307基因在大豆不同器官的表達分析
[0094] 1. 1、提取大豆球形胚的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，得到大豆球形胚 cDNA〇
[0095] 1. 2、按照1. 1的方法，將1. 1中的大豆球形胚替換分別為大豆心形胚、大豆子葉、 大豆種子的發(fā)育早期（即種子發(fā)育過程中占飽滿種子（但尚沒脫水）的重量百分比為 8%)、大豆種子的發(fā)育中期（即種子發(fā)育過程中占飽滿種子（但尚未脫水）的重量百分比 為24%)、大豆種子的發(fā)育晚期（即種子發(fā)育過程中占飽滿種子（但尚沒脫水）的重量百 分比為96 % )和大豆干種子，分別得到大豆心形胚cDNA、大豆子葉cDNA、大豆種子的發(fā)育早 期cDNA、大_&種子的發(fā)育中期cDNA、大_&種子的發(fā)育晚期cDNA和大干種子cDNA。
[0096] 1. 3、分別以1. 1和1. 2得到的cDNA為模板，以GmNF307基因引物F : 5' -CTTGAACGCCCTAATGGTGATT-3' 和 GmNF307 基因引物 R :5' -ATCGCTTGGTGGTCCTGTC-3' 為引物，進行實時定量PCR分析，得到GmNF307基因的相對表達量。內(nèi)參是大豆 Tublin 基因，內(nèi)參引物分別為 Tublin F :5' -AACCTCCTCCTCATCGTACT 和 Tublin R : 5' -GACAGCATCAGCCATGITCA-3'。結(jié)果如圖1所示，在大豆球形胚、大豆心形胚、大豆子葉和 大豆干種子中GmNF307基因的表達量較低；種子發(fā)育早期，GmNF307基因的表達量明顯上 升；種子發(fā)育中期GmNF307基因的表達量達到峰值；種子發(fā)育晚期GmNF307基因的表達量 又下降。上述結(jié)果表明GmNF307基因是種子發(fā)育階段特異表達的基因。
[0097] 2、轉(zhuǎn)GmNF307基因植株的獲得
[0098] 2. 1、利用Gateway技術(shù)構(gòu)建過表達載體，具體步驟如下：
[0099] 2. 1. 1、目標基因的獲得：根據(jù)GmNF307基因的開放閱讀框序列設(shè)計引物如下（下 劃線標注attBl和attB2重組位點）：
[0100] 上游引 物 1 :5, -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGCAATCTAAATCTGAAAC TG-3,
[0101] 下游引物 2 :5 ' -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCTGAATAGCAAGACGCCTCT-3，
[0102] 提取大豆幼苗的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，用上游引物1和下游引物2進 行PCR擴增，得到GmNF307基因PCR產(chǎn)物。
[0103] 212、按TQPO? TA Clpning?試劑盒（Invitogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為 12536-017,）說明書自帶操作步驟將2. 1. 1得到的GmNF307基因PCR產(chǎn)物和入門載體 pCR?8/GW/T0P0 (T0P0? TA Cloning?試劑盒中自帶）進行BP重組反應(yīng)，得到BP反應(yīng)產(chǎn) 物。
[0104] 2. 1. 3、將步驟2. 1. 2得到的2. 5 y 1 BP反應(yīng)產(chǎn)物加入50 y 1 T0P10感受態(tài)細胞進 行轉(zhuǎn)化，得到的克隆即為入門克?。╡ntry clone)，該入門克隆中的質(zhì)粒為入門質(zhì)粒，將該 入門質(zhì)粒命名為pCR?8/GW/T0P0- GmNF307(圖2中A)，將入門質(zhì)粒送測序，測序結(jié)果表明 該入門質(zhì)粒含有SEQ ID No. 1所示的cDNA分子。
[0105] 2. 1. 4、將步驟 2. 1. 3 得到的pCR?8/GW/T0P:Q- GmNF307 和 pGWB411 進行 LR 重組 反應(yīng)，得到LR反應(yīng)產(chǎn)物。
[0106] 2. 1.5、將步驟2. 1.4得到的2. 5yl LR反應(yīng)產(chǎn)物加入50yl T0P10感受態(tài)細胞進 行轉(zhuǎn)化，得到的克隆即為目標克隆，該目標克隆中的質(zhì)粒為目標質(zhì)粒，將該目標質(zhì)粒命名為 pGWB411-GmNF307, pGWB411-GmNF307 的測序結(jié)果表明 pGWB411-GmNF307 含有 SEQ ID No. 1 所示的 cDNA 分子。pGWB411-GmNF307 為 GmNF307 基因表達載體，pGWB411-GmNF307 含有 GmNF307基因表達盒，GmNF307基因表達盒中，啟動GmNF307基因轉(zhuǎn)錄的啟動子是花椰菜花 葉病毒35S啟動子（見圖2中B)。
[0107] 2. 2、轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥植株的獲得
[0108] 2. 2. 1、將重組質(zhì)粒pGWB411-GmNF307用電擊法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101，挑取重組 農(nóng)桿菌，將該重組農(nóng)桿菌命名為GV3101/pGWB411-GmNF307。
[0109] 按上述方法，將重組質(zhì)粒pGWB411-GmNF307替換為質(zhì)粒pGWB411，其他步驟均相 同，將得到重組農(nóng)桿菌命名為GV3101 /pGWB411。
[0110] 2. 2. 2、將擬南芥（Arabidopsis thaliana) (Columbia-〇亞型）種子均勾播種在MS 培養(yǎng)基上，于4°C春化3天，然后置于22°C光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周。待小苗長出四片真葉后移 栽至營養(yǎng)缽中培養(yǎng)，保濕2-3天，20-22°C。當(dāng)擬南芥植株生長至大部分花蕾處于即將開花 狀態(tài)時，用培養(yǎng)至對數(shù)期的重組農(nóng)桿菌GV3101/pGWB41 l-GmNF307侵染液轉(zhuǎn)化擬南芥獲得 代轉(zhuǎn)pGWB411-GmNF307擬南芥種子。
[0111] 將代轉(zhuǎn)pGWB411-GmNF307擬南芥種子，于37°C烘箱中烘干（6-8天），然后4°C 春化3天。將代轉(zhuǎn)pGWB411-GmNF307種子在含卡那霉素的MS培養(yǎng)基（卡那霉素在MS培 養(yǎng)基中的濃度為50mg/L)上進行篩選，得到初篩陽性1\代GmNF307基因擬南芥幼苗。
[0112] 提取上述初篩陽性代轉(zhuǎn)GmNF307擬南芥植株葉片總RNA，以反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 作為模板，以 GmNF307 基因引物 F :5' -CTTGAACGCCCTAATGGTGAIT-3' 和 GmNF307 基因 引物R :5' -ATCGCTTGGTGGTCCTGTC-3'為引物進行實時定量PCR分析，得到GmNF307基 因的相對表達量。內(nèi)參是野生型擬南芥AtActin2基因，內(nèi)參引物分別為AtActin2F : 5' -ATGCCCAGAAGTCTTGTTCC-3' 和 AtActin2R:5' -TGCTCATACGGTCAGCGATA-3'。檢測到有 GmNF307基因表達的擬南芥即為陽性轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥。用上述方法繼續(xù)鑒定T :陽 性轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥的后代，獲得16個1~3代純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系。
[0113] 按上述方法，將重組農(nóng)桿菌pGWB411-GmNF307替換為重組農(nóng)桿菌pGWB411，其他步 驟均相同，得到T 3代純合轉(zhuǎn)空載體擬南芥。
[0114] 2. 2. 3、以野生型擬南芥植株為對照，分別鑒定上述步驟的三個1~3代純合轉(zhuǎn) GmNF307基因擬南芥植株株系0E-13、0E-15和0E-18和T 3代純合轉(zhuǎn)空載體擬南芥中目的基 因的表達，鑒定引物和內(nèi)參引物同步驟2. 2. 2。
[0115] 實驗結(jié)果見圖3,野生型擬南芥和1~3代純合轉(zhuǎn)空載體擬南芥均未能檢測出 GmNF307基因的表達，1~ 3代純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系0E-15的GmNF307基因的表達 量為1. 〇, 了3代純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系0E-18的GmNF307基因的表達量為2. 9, T 3 代純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系0E-13的GmNF307基因的表達量為3. 9。
[0116] 實施例2、轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥的表型分析
[0117] 1、種子總油脂含量測定
[0118] 實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)的具體步驟如下：
[0119] 將干燥的種子研磨成粉，稱取100mg到離心管中，平行稱取四份。加入500 y 1的 正己烷，充分混勻，37°C過夜。慢速離心3分鐘，將正己烷吸入稱量過新管中。剩下的粉末 繼續(xù)加正己烷重復(fù)浸泡、然后離心、然后收集正己烷到同一的離心管中。將離心管放入真空 栗中，抽真空，使正己烷完全揮發(fā)。然后再次稱取離心管的重量。離心管前后重量的變化即 是提取的總油脂重量；總油脂量（％ )的計算公式為：
[0120] 總油脂量（％ )=(提取的脂類重量/種子總重量）X 100%。
[0121] 每個株系取30株的種子，實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值土標準差。
[0122] 結(jié)果如圖4所示，野生型擬南芥種子總油脂量為36.0 % ±3 %義代純合轉(zhuǎn) GmNF307基因擬南芥株系0E-18種子總油脂量為40. 1% ±3%;T3R純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬 南芥株系OE-15種子總油脂量為44. 6% ±9%;T3R純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系OE-13 種子總油脂量為41. 1% ±3%。三個轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系種子總油脂量明顯高于野 生型擬南芥種子總油脂量，且差異顯著。野生型擬南芥和1代純合轉(zhuǎn)空載體擬南芥的種子 總油脂量無顯著差異。
[0123] 結(jié)果表明，GmNF307蛋白對種子中總油脂的合成呈正調(diào)控作用，其編碼基因 GmNF307的過量表達，可提高轉(zhuǎn)基因植株種子中總油脂的含量。
[0124] 2、種子脂肪酸含量測定
[0125] 實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)的具體步驟如下：
[0126] 徹底干燥待測種子，研磨成粉，取10mg加入螺口的2ml離心管中，每份樣品平行 稱取四份。加入l〇yl的17:0脂肪酸（Sigma公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為51610)10mg/ml 做內(nèi)標。加含2. 5 %濃硫酸的甲醇溶液lml，85 °C水浴中保溫1小時，期間晃動數(shù)次。自然 冷卻后，取上清500 yl到新管中，加入600 yl的0. 9% NaCl溶液、300正己烷，震蕩混勻 幾分鐘，4000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清至新管中。通風(fēng)櫥中過夜使正己烷揮發(fā)完全，然后加 入50 yl乙酸乙酯溶解甲酯化的脂肪酸。將甲酯化的脂肪酸樣品用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測 (Perkin-Elmer Turbomass)各個組分的相對含量，然后各個成分的脂肪酸與加入的17:0 內(nèi)標比較得出相對含量。（Shen，B.，et al.，The homeobox gene GLABRA2affects seed oil content in Arabidopsis, Plant Mol. Biol. , 60, 377-387, 2006.)
[0127] 每個株系取30株的種子，實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值土標準差。
[0128] 結(jié)果如圖5所示，共檢測11種脂肪酸含量，其中三個轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株 系的擬南芥種子中棕櫚酸（16:0)、油酸（18:1)、亞油酸（18:2)、亞麻酸（18:3)和貢多酸 (20:1)的含量均高于野生型擬南芥，且達到顯著水平。野生型擬南芥、1~ 3代純合轉(zhuǎn)GmNF307 基因擬南芥株系〇E_15、T3R純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系0E-18和T 3代純合轉(zhuǎn)GmNF307 基因擬南芥株系0E-13的種子中棕櫚酸（16:0)占種子總重量的百分比的平均值分別為 3. 5%、4.0%、3. 8%和3.8% ;油酸（18:1)占種子總重量的百分比的平均值分別為4.0%、 5. 0%、4. 4%和4.4% ;亞油酸（18:2)占種子總重量的百分比的平均值分別為7.6%、 10. 0%、9. 2%和9.2% ;亞麻酸（18:3)占種子總重量的百分比的平均值分別為5.8%、 7. 8%、7. 0%和6.6% ;貢多酸（20:1)占種子總重量的百分比的平均值分別為7.8%、 9. 4%、8. 8%和8. 6%。野生型擬南芥、1~3代純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系0E-15、1~3代 純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系0E-18和1~ 3代純合轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系0E-13的種 子中芥子酸（22:1)占種子總重量的百分比的平均值分別為5. 3%、5. 9%、5. 9%和5. 8%， 三個轉(zhuǎn)GmNF307基因擬南芥株系的擬南芥種子中芥子酸（22:1)的含量雖高于野生型擬南 芥，但未達到顯著水平。其它5種脂肪酸的含量與對照相比無明顯差異，這5種脂肪酸包括 硬脂酸（18:0)、花生酸（20:0)、花生二烯酸（20:2)、花生三烯酸（20:3)、山崳酸（22:0)。野 生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥的種子中上述脂肪酸含量無顯著差異。
[0129] 結(jié)果表明，GmNF307基因的過量表達可以提高種子中部分脂肪酸的含量，如棕櫚酸 (16:0)、油酸（18:1)、亞油酸（18:2)、亞麻酸（18:3)和貢多酸（20:1)。
【主權(quán)項】
1. GmNF307在調(diào)控植物組織和/或器官總油脂含量和/或調(diào)控植物組織和/或器官中 脂肪酸含量中的應(yīng)用；所述GmNF307為a)或b)或c): a) 氣基酸序列是SEQ ID No. 2所不的蛋白質(zhì)； b) 在SEQ ID No. 2所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)； c) 將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加得到的與油脂代謝調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)。2. 與權(quán)利要求1所述GmNF307相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物組織和/或器官總油脂含量 和/或調(diào)控植物組織和/或器官中脂肪酸含量中的應(yīng)用； 所述與權(quán)利要求1所述GmNF307相關(guān)的生物材料，為下述A1)至A20)中的任一種： A1)編碼權(quán)利要求1所述GmNF307的核酸分子； A2)含有A1)所述核酸分子的表達盒； A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體； A4)含有A2)所述表達盒的重組載體； A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物； A6)含有A2)所述表達盒的重組微生物； A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物； A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物； A9)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細胞系； A10)含有A2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物細胞系； All)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系； A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系； A13)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織； A14)含有A2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物組織； A15)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織； A16)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織； A17)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官； A18)含有A2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物器官； A19)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官； A20)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：A1)所述核酸分子為如下1)或2)或3) 所示的基因： 1) 其編碼序列是SEQ ID No. 1的cDNA分子或DNA分子； 2) 與1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼權(quán)利要求1所述油脂 代謝相關(guān)蛋白的cDNA分子或基因組DNA分子； 3) 在嚴格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權(quán)利要求1所述油脂代謝 相關(guān)蛋白的cDNA分子或基因組DNA分子。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其特征在于：所述調(diào)控植物組織和/或器官總 油脂含量為提高植物組織和/或器官總油脂含量；所述調(diào)控植物組織和/或器官中脂肪酸 含量為提高植物組織和/或器官中脂肪酸含量；所述脂肪酸為棕櫚酸、油酸、亞油酸、亞麻 酸和貢多酸中的五種、四種、三種、兩種或一種。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的應(yīng)用，其特征在于：所述器官為種子；所述植物為種子 植物。6. -種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將權(quán)利要求1所述油脂代謝相關(guān)蛋白的編碼基因 導(dǎo)入受體植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物組織和/或器官中總油脂含量 和/或脂肪酸含量高于所述受體植物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述油脂代謝相關(guān)蛋白的編碼基因的編 碼序列是SEQ ID No. 1的DNA分子。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述脂肪酸為棕櫚酸、油酸、亞油酸、 亞麻酸和貢多酸中的五種、四種、三種、兩種或一種。9. 根據(jù)權(quán)利要求6-8任一所述的方法，其特征在于：所述器官為種子；所述植物為種子 植物。10. 擴增編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子全長或其片段的引物對。
【文檔編號】C12N15/62GK106032390SQ201510115633
【公開日】2016年10月19日
【申請日】2015年3月17日
【發(fā)明人】張勁松, 陳受宜, 陸翔, 滿為群, 來永才, 李煒, 欒曉燕, 杜維廣, 畢影東, 張萬科, 馬彪, 林晴, 何鍶潔
【申請人】中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所