一種分離培養(yǎng)臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的成體細胞的分離培養(yǎng)領(lǐng)域,尤其涉及一種分離培養(yǎng)臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的方法：將臍靜脈從華通膠中完全剝離出來；將臍靜脈沿一側(cè)縱向剪開，使其由管狀變?yōu)殚L方形血管壁面，漂洗；加入Ⅱ型膠原酶進行消化；消化完成后將血管取出漂洗，漂洗液與酶解液混合，離心棄上清，使用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。本發(fā)明的細胞分離方法操作簡單，單人可獨立進行，且紅細胞污染較少，可細胞接種后72h再進行換液，細胞貼壁效率更高；原代所得到的血管內(nèi)皮細胞數(shù)量多，P3細胞CD31陽性表達可達95%以上，且在分離制備血管內(nèi)皮細胞同時不影響臍帶間充質(zhì)干細胞的制備，可充分利用實驗材料。
【專利說明】
_種分禹培養(yǎng)臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的成體細胞的分離培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種分離培養(yǎng)臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]
血管是人體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的主體，而整個血管的內(nèi)表面都是由一層內(nèi)皮細胞所覆蓋的。由于內(nèi)皮細胞能夠本身直接與血液接觸，所以它們可以通過多種途徑在血壓調(diào)節(jié)，凝血和纖溶，炎性細胞的黏附和迀移，以及血管形成等生理、病理過程中發(fā)揮重要作用。
[0003]在細胞研究中，血管內(nèi)皮細胞是常用的體外實驗用細胞，而利用人來源的血管內(nèi)皮細胞進行的研究大多數(shù)是以人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelialcellS，HUVEC)為材料來進行的。之所以主要選擇臍帶作為內(nèi)皮細胞的取材來源，一方面，是由于臍帶作為分娩過程中的廢棄物，來源豐富，容易獲取;另一方面，臍帶血管沒有分支，便于操作，而且有著理想的長度，能夠保證細胞的足量收集。
[0004]經(jīng)典的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的分離方法為膠原酶灌注消化法，最早是JaffeEA等在 1973年提出來的[Jaffe EA, Nachman RL, Becker CG, et al.J Clin Invest, 1973,52(11): 2745-2756]，至今被人們廣泛使用，另外還有機械刮取法等相關(guān)方法。
[0005]通過灌注消化法獲得臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的成功率較高，但是灌注操作有一些缺點:首先，在灌注法進行臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的分離過程中，需要將無菌管插入臍靜脈管腔內(nèi)并在這一端使用止血鉗或其它方法進行固定，然后使用PBS清洗并使用酶進行灌注消化來獲得細胞。但是由于臍靜脈管腔較小且比較黏滑，單人進行插管操作比較困難；同時如果固定不牢，在清洗和灌注過程中容易造成漏液，從而影響實驗效果且造成試劑浪費，影響清洗和消化效果;在血管中有淤血或無菌管固定不牢的情況下，再次在沖洗時無法完全沖洗干凈，容易混入血管中的血液，造成紅細胞殘留過多，影響血管內(nèi)皮細胞貼壁效果；另外在進行酶消化過程中，因為較難密閉操作，所以很難實現(xiàn)37°C進行無菌消化過程，影響了酶的消化效率。
[0006]通過機械刮取法獲取臍靜脈血管內(nèi)皮細胞，主要通過機械作用力使細胞脫離，容易造成細胞機械損傷，因此采用度不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]
為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中傳統(tǒng)臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的灌注消化法中存在的單人操作難度較大、容易造成漏液、易被其他細胞污染、酶用量大的問題，發(fā)明人進行綜合考慮，研究出一種適合單人操作、操作相對簡便、不易被污染、酶用量小的分離培養(yǎng)臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的方法。
[0008]本發(fā)明是通過以下步驟得到的: 一種分離培養(yǎng)臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的方法，包括以下步驟:
(1)臍帶清洗后將臍靜脈從華通膠中完全剝離出來；
(2)將臍靜脈沿一側(cè)縱向剪開，使其由管狀變?yōu)殚L方形血管壁面，然后使用無菌生理鹽水對血管壁進行漂洗直至漂洗液澄清無色；
(3)加入Π型膠原酶進行消化，Π型膠原酶質(zhì)量體積比濃度為0.05%-0.1%，酶和臍靜脈的配比為0.25-0.5mL:1cm長血管，消化時間為15_30min，消化在恒溫搖床內(nèi)進行，消化溫度為37°C，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min;
(4)消化完成后將血管取出并使用α-ΜΕΜ培養(yǎng)基對血管進行漂洗，漂洗液與酶解液混合，離心后棄掉上清，使用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
[0009]所述的方法，優(yōu)選步驟(4)中1500r/min離心1min后離心后棄掉上清，使用培養(yǎng)基A重懸細胞沉淀，進行培養(yǎng)，3天后更換培養(yǎng)基為培養(yǎng)基B，細胞融合度達到80%后進行傳代；
所述培養(yǎng)基A和B是向α-ΜΕΜ培養(yǎng)基中添加胎牛血清FBS、堿性成纖維細胞生長因子b-FGF和血管內(nèi)皮細胞生長因子VEGF得到的，
其中，培養(yǎng)基A中胎牛血清FBS的終濃度為20%，堿性成纖維細胞生長因子b-FGF和血管內(nèi)皮細胞生長因子VEGF的終濃度分別為20ng/m L，
培養(yǎng)基B中胎牛血清FBS的終濃度為10%，堿性成纖維細胞生長因子b-FGF和血管內(nèi)皮細胞生長因子VEGF的終濃度分別為10ng/mL。
[0010]所述的方法，優(yōu)選步驟(3)中為減少血管壁平滑肌細胞等其它雜細胞的污染，Π型膠原酶的質(zhì)量體積比濃度為0.05%;酶與臍靜脈的配比為0.5mL:1cm長血管；消化時間為25min0
[0011 ]所述的方法，優(yōu)選步驟(I)中使用無菌眼科剪將臍帶一端沿臍靜脈血管腔剪0.5cm左右小口，然后使用無菌敷料鑷將臍帶沿臍靜脈方向剝開并將臍靜脈完全暴露出來，將臍靜脈從華通膠中完全剝離出來。
[0012]所述的方法，優(yōu)選使用培養(yǎng)基A重懸細胞沉淀計數(shù)后以IX 1Vcm2的密度轉(zhuǎn)入75cm2細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入37°C、5%C02、飽和濕度中進行培養(yǎng)。
[0013]所述的方法，優(yōu)選步驟(I)中細胞可傳至8-10代。
[0014]所述的方法，優(yōu)選步驟(3)中消化使用容器為50mL無菌離心管。
[0015]所述的方法，優(yōu)選步驟(I)中臍帶是24h內(nèi)采集的。
[0016]有益效果:
本發(fā)明的分離內(nèi)皮細胞的方法操作簡單，單人可獨立進行，且紅細胞污染較少，可細胞接種后72h再進行換液，細胞貼壁效率更高；原代所得到的血管內(nèi)皮細胞數(shù)量多，1cm臍帶可得細胞2 XlO6, P3細胞⑶31陽性表達可達95%以上，且在分離制備血管內(nèi)皮細胞同時不影響臍帶間充質(zhì)干細胞的制備，可充分利用實驗材料。
【附圖說明】
[0017]圖1為臍靜脈血管內(nèi)皮細胞體外分離培養(yǎng)后，光學(xué)顯微鏡下形態(tài)，其中A為初始貼壁狀態(tài)，B為長滿后鵝卵石狀；
圖2為臍靜脈血管內(nèi)皮細胞體外成管能力檢測結(jié)果；
圖3為臍靜脈血管內(nèi)皮細胞流式檢測結(jié)果，其中，A為CD31檢測結(jié)果，B為CD34檢測結(jié)果； 圖4為臍靜脈血管內(nèi)皮細胞血管VI因子免疫熒光檢測結(jié)果:圖A為實驗組結(jié)果，圖B為陰性對照結(jié)果。
【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實施實例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此:
實施實例I按照本方案進行臍靜脈血管內(nèi)皮細胞細胞的提取
該實例使用經(jīng)產(chǎn)婦同意授權(quán)的新生兒臍帶作為臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的來源。
[0019]該實驗用到的試劑如下:Π型膠原酶(Sigma)、α-ΜΕΜ培養(yǎng)基(Hyc 1ne，Cat.N0.SH30265.01B)、血管內(nèi)皮生長因子VEGF(Peprotech)、成纖維細胞生長因子FGF(Peprotech)、胎牛血清 FBS(Gibco)、胰蛋白酶(Hyclone)。
[0020](I)將新生兒臍帶(1cm左右)在含1%雙抗的生理鹽水中洗滌三次，去除表面的血污，用無菌眼科剪將臍帶沿臍靜脈方向剪0.5cm左右的小口，然后使用無菌敷料鑷沿切口位置沿臍靜脈縱向方向?qū)⒛殠О情_，從而使臍靜脈完全暴露出來，使用無菌敷料鑷將臍靜脈剝離下來；(2)使用眼科剪將血管縱向剪開管壁，從而將其由管狀剪為長方形血管壁面。將血管壁用含I %雙抗的生理鹽水充分洗滌3-5次；
(3)然后轉(zhuǎn)入50mL無菌離心管中并加入質(zhì)量體積濃度為0.05%的Π型膠原酶，1cm血管使用Π型膠原酶體積為5m L，最后放入37°C恒溫搖床內(nèi)120r/min消化25min;
(4 )消化完成后血管使用20m L α-ΜΕΜ培養(yǎng)基(不含F(xiàn)BS、b_FGF和VEGF)漂洗，收集膠原酶和漂洗液合并后150(^/1!^11離心101^11，使用培養(yǎng)基厶重懸細胞沉淀，計數(shù)后以5\104/孔轉(zhuǎn)入6孔板內(nèi)，放入37 V、5%C02中培養(yǎng)。3天后更換培養(yǎng)基為培養(yǎng)基B，細胞融合度達到80%后進行傳代，后續(xù)培養(yǎng)過程均使用培養(yǎng)基B。培養(yǎng)基A中胎牛血清FBS的終濃度為20%，堿性成纖維細胞生長因子b-FGF和血管內(nèi)皮細胞生長因子VEGF的終濃度分別為20ng/mL，培養(yǎng)基B中胎牛血清FBS的終濃度為10%，堿性成纖維細胞生長因子b-FGF和血管內(nèi)皮細胞生長因子VEGF的終濃度分別為10ng/mL。
[0021]在實施實例I中，1cm臍帶得到初始細胞數(shù)量為2XlO5，3d后換液時漂浮細胞較少，細胞生長至80%融合度需要120h。
[0022]實施實例2膠原酶灌注法進行臍靜脈血管內(nèi)皮細胞細胞的提取該實驗使用的試劑與實施實例I相同。
[0023]按照傳統(tǒng)膠原酶灌注法進行臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的分離，因方法較為成熟，本處不再贅述。在消化過程中，使用質(zhì)量體積濃度為0.05%的Π型膠原酶消化25min，收集細胞后以5父104/孔轉(zhuǎn)入6孔板內(nèi)，放入37°(:、5%0)2中培養(yǎng)，2411后換液去除漂浮的紅細胞，3天后更換培養(yǎng)基為培養(yǎng)基B，細胞融合度達到80%后進行傳代，后續(xù)培養(yǎng)過程均使用培養(yǎng)基B。培養(yǎng)基A中胎牛血清FBS的終濃度為20%，堿性成纖維細胞生長因子b-FGF和血管內(nèi)皮細胞生長因子VEGF的終濃度分別為20ng/mL，培養(yǎng)基B中胎牛血清FBS的終濃度為10%，堿性成纖維細胞生長因子b-FGF和血管內(nèi)皮細胞生長因子VEGF的終濃度分別為10ng/mL。
[0024]在實施實例2中，1cm臍帶得到初始細胞數(shù)量為1.6X 15，3d后換液時漂浮的紅細胞多于實施實例I，細胞生長至80%融合度需要168h。
[0025]實施實例3 同實施例1相比，該實施例步驟(3)中1cm血管使用Π型膠原酶質(zhì)量體積濃度為0.1%，消化時間為15min，其余同實施實例I相同。
[0026]在實施實例3中，1cm臍帶得到初始細胞數(shù)量為1.8X 15，細胞生長至80%融合度需要144h。
[0027]實施實例4
同實施例1相比，該實施例步驟(3)中1cm血管使用Π型膠原酶質(zhì)量體積濃度為0.1%，消化時間為25min，其余同實施實例I相同。
[0028]在實施實例4中，1cm臍帶得到初始細胞數(shù)量為2.2 X 15，細胞生長至80%融合度需要120h，但在貼壁細胞中出現(xiàn)部分長梭形的血管平滑肌細胞，內(nèi)皮細胞純度低于90%。
[0029]實施實例5臍靜脈血管內(nèi)皮細胞鑒定
取實施實例I中傳至第八代的細胞，進行相關(guān)鑒定實驗。
[0030]1、細胞形態(tài)觀察
取第八代臍靜脈血管內(nèi)皮細胞按照I X 15/孔接種到6孔板中，光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，初始時細胞呈梭形，鋪滿后呈鵝卵石狀，例如實施實例I中培養(yǎng)的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞如圖1所示，符合內(nèi)皮細胞的形態(tài)特征。
[0031]2、血管形成實驗
1)96孔培養(yǎng)板板和滅菌的20-200μ1槍頭置于-20°C預(yù)冷，Matrigel(BD)置于4°C冰箱內(nèi)過夜融化；
2)使用預(yù)冷槍頭每孔加入20μ1的Matrigel鋪膠，動作迅速，避免氣泡生成，然后置于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30min;
3)細胞懸液調(diào)整至2X105/mL，以14/孔接種于培養(yǎng)板中，置于37°C、5%C02飽和濕度內(nèi)培養(yǎng)4-8小時后觀察實驗結(jié)果;實驗結(jié)果表明，本方法中分離得到的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞具有體外成血管能力(圖2)。
[0032]3、流式細胞儀檢測細胞表型
在三個上樣管中分別加入5μ1流式抗體IgGl-PE、CD31-PE、CD34-PE(均為BD公司生產(chǎn))，然后取實施實例I中第八代臍靜脈血管內(nèi)皮細胞調(diào)整至2 X 106/m L，每個上樣管中加入100μ?細胞懸液，混勻后避光孵育15min，然后再加200μ1 PBS混勻后上機檢測。實驗重復(fù)檢測三次，結(jié)果表明⑶31陽性率均在90%以上，⑶34陽性率均在10%以下，符合內(nèi)皮細胞標準(圖3 )。
[0033]4、免疫熒光檢測血管VI因子抗原表達情況
O取第八代細胞接種于消毒后的蓋玻片上，待細胞爬滿玻片后取出，用PBS沖洗3遍，然后使用4%多聚甲醛固定20min ；
2) PB S漂洗3次，每次5m i η，加入5%的山羊血清(含有0.5%Tr i t onX-10 O )封閉，室溫20min；
3)加入鼠抗人VI因子相關(guān)抗原單克隆抗體50ul(santacruz)，4°C過夜；
4)PBS溶液漂洗3次，每次3min，使用Alexa Flour? 555標記羊抗大鼠熒光二抗50ul(santa cruz)，室溫下避光孵育45min;
5)PBS溶液漂洗3次，每次5min，然后加入50 ul DAPI(Sigma)，室溫下避光孵育5min；
6)PBS溶液漂洗3次后封片觀察，結(jié)果可見細胞漿內(nèi)有顆粒狀紅色熒光免疫沉積物，證明血管VI因子相關(guān)抗原陽性表達(圖4 )。
[0034]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受實施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應(yīng)為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種分離培養(yǎng)臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)臍帶清洗后將臍靜脈從華通膠中完全剝離出來； (2)將臍靜脈沿一側(cè)縱向剪開，使其由管狀變?yōu)殚L方形血管壁面，然后使用無菌生理鹽水對血管壁進行漂洗直至漂洗液澄清無色； (3)加入Π型膠原酶進行消化，Π型膠原酶質(zhì)量體積比濃度為0.05%-0.1%，酶和臍靜脈的配比為0.25-0.5mL:1cm長血管，消化時間為15_30min，消化在恒溫搖床內(nèi)進行，消化溫度為37°C，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min; (4)消化完成后將血管取出并使用α-ΜΕΜ培養(yǎng)基對血管進行漂洗，漂洗液與酶解液混合，離心后棄掉上清，使用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)中離心后棄掉上清，使用培養(yǎng)基A重懸細胞沉淀，進行培養(yǎng)，3天后更換培養(yǎng)基為培養(yǎng)基B，細胞融合度達到80%后進行傳代； 所述培養(yǎng)基A和B是向α-ΜΕΜ培養(yǎng)基中添加胎牛血清FBS、堿性成纖維細胞生長因子b-FGF和血管內(nèi)皮細胞生長因子VEGF得到的， 其中，培養(yǎng)基A中胎牛血清FBS的終濃度為20%，堿性成纖維細胞生長因子b-FGF和血管內(nèi)皮細胞生長因子VEGF的終濃度分別為20ng/m L， 培養(yǎng)基B中胎牛血清FBS的終濃度為10%，堿性成纖維細胞生長因子b-FGF和血管內(nèi)皮細胞生長因子VEGF的終濃度分別為10ng/mL。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中Π型膠原酶的質(zhì)量體積比濃度為0.05%;酶與臍靜脈的配比為0.5mL:1 cm長血管；消化時間為25min。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)中使用無菌眼科剪將臍帶一端沿臍靜脈血管腔剪0.5cm左右小口，然后使用無菌敷料鑷將臍帶沿臍靜脈方向剝開并將臍靜脈完全暴露出來，將臍靜脈從華通膠中完全剝離出來。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于使用培養(yǎng)基A重懸細胞沉淀計數(shù)后以IX 14/cm2的密度轉(zhuǎn)入75cm2細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入37°C、5%C02、飽和濕度中進行培養(yǎng)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)中細胞可傳至8-10代。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中消化使用容器為50mL無菌離心管。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)中臍帶是24h內(nèi)采集的。
【文檔編號】C12N5/071GK105907704SQ201610336519
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】劉 東, 曲廷瑜, 張秀濤
【申請人】山東省齊魯干細胞工程有限公司