一種用于檢測口蹄疫病毒A型和Asia1型混合感染的引物、試劑盒、使用方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測口蹄疫病毒A型和Asia1型混合感染的RT?PCR引物、試劑盒、使用方法及其應(yīng)用，所述的引物包括引物對(duì)FMDA和FMDAsia，其中，引物對(duì)FMDA包括：上游引物FMDAF：5′?GCAACCCAGATGTTGAT?3′，下游引物FMDAR：5′?CCACATGGACTATGGAA?3′，引物對(duì)FMDAsia：上游引物FMDAsiaF：5′?CTGGGTTTTACAAACCTGTG?3′，下游引物FMDAsiaR：5′?CTCTGACGTCACAATTGGC?3′。本發(fā)明試劑盒的使用方法包括患病動(dòng)物新鮮樣品的采集，核酸提??；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳檢測。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省工省時(shí)，提高了檢測的準(zhǔn)確性和特異性。本發(fā)明能快速、方便的檢測口蹄疫A型與Asia1型毒株或A型和Asia1型混合感染，可用于口蹄疫病毒流行病學(xué)調(diào)查與分析，具有廣闊的市場應(yīng)用前景和較大的經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說明】
-種用于檢測口蹄疫病毒A型和As i a1型混合感染的引物、試 劑盒、使用方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種用于檢測口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的引物、試劑盒、使 用方法及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫（a地thae epizooticae;foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒 引起的一種人獸共患的急性、熱性、高度接觸性傳染病，其臨診特征是在口腔粘膜、四肢下 端及乳等處皮膚形成水瘤和爛斑。該病傳播迅速，流行面廣，成年動(dòng)物多取良性經(jīng)過，幼齡 動(dòng)物多因屯、肌受損而死亡率較高?？谔阋邚V泛流行于世界各地，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，各 國政府及國際組織高度重視，被列為全球各國共同商定撲滅的頭號(hào)法定傳染病。隨著國際 貿(mào)易的日趨增加，物質(zhì)交流和國際交往越來越頻繁，給口蹄疫的預(yù)防和控制增加了難度，因 此世界各國都花費(fèi)大量人力、物力和財(cái)力來研究、控制和消滅口蹄疫。
[0003] 口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth disease virus)屬于微RNA病毒科中的口蹄疫病毒 屬，是RNA病毒中最小的一個(gè)?？谔阋卟《揪哂卸嘈托?、易變異的特點(diǎn)。根據(jù)其血清學(xué)特性， 可W分為7個(gè)血清型，即A、0、C、SAT1 (南非I)、SAT2(南非II型）、SAT3(南非III型）及Asia 1 型（亞洲1型）。各個(gè)血清型間無交叉免疫現(xiàn)象。每一個(gè)血清型又包含若干個(gè)亞型，同型各個(gè) 亞型之間也僅有部分交叉免疫性。該病毒的運(yùn)種特性給口蹄疫的防制帶來了許多困難。
[0004] 口蹄疫病毒在患病動(dòng)物的水瘤液、水瘤皮、淋己液及發(fā)熱期血液內(nèi)的含量最高，其 次是各組織器官、分泌物、排泄物，可長期存在并向外排毒，退熱后病毒可W出現(xiàn)于乳、糞、 尿、淚、誕水及各臟器中?？谔阋卟《緦?duì)外界環(huán)境的抵抗力很強(qiáng)，耐干燥。在自然條件下，含 毒組織及污染的飼料、飲水、飼草、皮毛及±壤等所含病毒在數(shù)日乃至數(shù)周內(nèi)仍具有感染 性。口蹄疫病毒對(duì)酸和堿都特別敏感，在pH3.0和pH9. OW上的緩沖液中，病毒感染性將瞬間 消失，2 %~4 %氨氧化鋼、3 %~5 %福爾馬林溶液、5%氨水、0.2%~0.5%過氧乙酸或5 % 次氯酸鋼等均為口蹄疫病毒良好的消毒劑。
[0005] 口蹄疫是一種傳染性極強(qiáng)的傳染病，一經(jīng)發(fā)生往往呈流行性，在牧區(qū)，多呈現(xiàn)大流 行，疫情一旦發(fā)生，可隨動(dòng)物的流動(dòng)迅速蔓延，經(jīng)過一定時(shí)期后疫情才逐漸平息?？谔阋呖?感染多種動(dòng)物，偶蹄目動(dòng)物易感性最高，易感性高低的順序依次為黃牛、奶牛、巧牛、水牛、 豬、羊、駱駝。
[0006] 對(duì)于口蹄疫的防治目前尚無特效藥物療法，主要采取綜合防制措施及對(duì)癥療法。 最根本的辦法是消除患病動(dòng)物、帶毒動(dòng)物和徹底消毒，切斷傳播途徑。因此應(yīng)加強(qiáng)檢疫和口 蹄疫監(jiān)測，W防口蹄疫擴(kuò)散。
[0007] 目前，根據(jù)流行病學(xué)、臨診癥狀和病例剖檢特點(diǎn)可W做出口蹄疫的初步診斷，但確 診需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。病毒的分離與鑒定和血清學(xué)診斷是實(shí)驗(yàn)室診斷常用的方法，但較 費(fèi)時(shí)費(fèi)力，耗時(shí)較長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于檢測口蹄疫病毒A型和Asial型混合 感染的引物、試劑盒、使用方法及其應(yīng)用，采用本發(fā)明的試劑盒，能夠在=個(gè)小時(shí)內(nèi)做出診 斷，為口蹄疫臨床診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查提供一種有效的分子生物學(xué)診斷方法。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種用于檢測口蹄疫病毒A型和 As ial型混合感染的引物，所述的引物包括引物對(duì)FMDA和FMDAs ia，其中，
[0010] 引物對(duì) FMDA:
[0011] 上游引物FMDAF: 5' -GCAACCCAGATGTTGAT-3'
[0012] 下游引物FMDAR: 5' -CCACATGGACTATGGAA-3'
[0013] 引物對(duì) FMDAsia:
[0014] 上游引物FMDAsiaF: 5' -CTGGGTTTTACAAACCTGTG-3'
[0015] 下游引物FMDAsiaR: 5'-CTCTGACGTCACAATTGGC-3'。
[0016] -種用于檢測口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的試劑盒，所述的試劑盒包括引 物對(duì)FMDA和FMDAs ia，其中，
[0017] 引物對(duì) FMDA:
[001 引上游引物FMDAF: 5' -GCAACCCAGATGTTGAT-3'
[0019] 下游引物FMDAR: 5' -CCACATGGACTATGGAA-3'
[0020] 引物對(duì) FMDAsia:
[0021] 上游引物FMDAsiaF: 5' -CTGGGTTTTACAAACCTGTG-3'
[0022] 下游引物FMDAsiaR: 5'-CTCTGACGTCACAATTGGC-3'。
[0023] 所述的試劑盒還包括5 XRT Buffer、dNTPs、Taq酶、RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶、超純 水、裂解液和沖洗液。
[0024] 所述的試劑盒還包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。
[00巧]所述的裂解液的組分為:徑基哇嘟3~5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、憐酸S氯乙醋3.2~5.2測、 異硫氯酸苯醋1.5~3.5山1、聚乙締基化咯燒酬1.3~3.5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、氯化鋼0.3~0.5M和 巧樣酸鋼0.6~0.9M。
[00%] 所述的沖洗液的組分為：S徑甲基氨基甲燒1 OiiM，乙二胺四乙酸IiiM，乙醇60~ 80% (體積分?jǐn)?shù)）；抑7.0。
[0027] -種用于檢測口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的試劑盒的使用方法，包括W下 步驟：
[0028] (1)樣品的采集
[0029] (2)樣品RNA的提取
[0030] (3)RT-PCR
[0031] 對(duì)樣品RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25iil:5XRT Buffer 扣l、12.5iiM dNTPs 化 l、125iiM上游引物FMDAF和125iiM下游引物FMDAR各化l、125iiM上游引物FMDAsiaF和125iiM下 游引物FMDAsiaR各化1、25UAU Taq酶0.扣1、2.抓AU RNA酶抑制劑化1、2.5咖反轉(zhuǎn)錄酶化 1、超純水3.化1和SngAU RNA化1;
[0032] RT-PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?0。[30111111，94。[3111111;94。[403,55。[453,72。[303，共35個(gè)循 環(huán)；72°C3min;
[0033] (4)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測
[0034] 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。
[0035] 所述的樣品的采集分為固體狀動(dòng)物組織的采集或液體狀動(dòng)物組織的采集;其中，
[0036] 固體狀動(dòng)物組織的采集方法為:無菌采集動(dòng)物組織病料O.l-lOOmg，裝入無 RNA酶 污染的離屯、管中備用；
[0037] 液體狀動(dòng)物組織的采集分為分泌液的采集或血液的采集，分泌液的采集方法為： 用鼻咽拭子采集鼻咽液，裝入無 RNA酶污染的離屯、管中備用;血液的采集方法為:取全血、血 清或血漿IO-IOOiU，加入無 RNA酶污染的離屯、管中備用。
[0038]所述的樣品RNA的提取，具體方法為：
[0039] (1)將固體狀的動(dòng)物組織先進(jìn)行研磨處理，液體狀的動(dòng)物組織直接用于提?。?br>[0040] (2)在研磨后成糊狀的動(dòng)物組織20-100mg或液體狀動(dòng)物組織20-100iil中，加裂解 液50化1，12000巧m離屯、30s，分離出上清液；
[0041 ] (3)將上清液轉(zhuǎn)入離屯、管中，加無水乙醇50化1，分次轉(zhuǎn)到RNA純化柱上，12000巧m 離屯、30s，得到粗提的RNA;
[0042] (4)用沖洗液50化1沖洗RNA純化柱，12000巧m離屯、30s;
[0043] (5)將RNA純化柱轉(zhuǎn)到另一離屯、管，加超純水50iil，12000rpm離屯、30s，得到病毒及 組織基因組的RNA，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0044] -種用于檢測口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的試劑盒在檢測口蹄疫病毒A型 和Asial型混合感染方面的應(yīng)用。
[0045] 本發(fā)明的有益效果
[0046] 1、本發(fā)明對(duì)核酸提取過程進(jìn)行改進(jìn)，即采用與現(xiàn)有試劑盒不同配方的裂解液和沖 洗液，大大縮短了核酸提取時(shí)間，使核酸的提取時(shí)間由原來的1-2小時(shí)縮短為2分鐘，節(jié)省了 核酸提取的時(shí)間，從而提高了試劑盒的使用效率，使試劑盒的檢驗(yàn)更加快捷、經(jīng)濟(jì)。其中，本 發(fā)明的裂解液可W使樣品迅速裂解，釋放出RNA。沖洗液可有效除去蛋白質(zhì)、鹽類及雜質(zhì)等， 使所提取的RNA更加純凈。
[0047] 2、本發(fā)明W 口蹄疫病毒3D基因組序列作為目的基因區(qū)域，設(shè)計(jì)能夠檢測A型和 Asial型的特異性引物，同等條件下不能擴(kuò)增口蹄疫其他血清型，具有很高的特異性。同時(shí)， 本發(fā)明的試劑盒具有很高的靈敏度，最低檢測限為0.1 pgAU。
[004引3、本發(fā)明提供了一種用于檢測口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的試劑盒，該試 劑盒能快速、準(zhǔn)確的檢測出口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染毒株?？蓪?duì)口蹄疫感染的A型 和Asial型單個(gè)樣品檢測，也可對(duì)臨床病例中A型和Asial型混合感染的檢測，可用于口蹄疫 病毒病原普查、分子流行病學(xué)調(diào)查及疫苗篩選和監(jiān)測。
[0049] 4、本發(fā)明的方法是建立在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上的，檢測中提供了陰性對(duì)照和陽性對(duì) 照，大大提高了檢測的準(zhǔn)確度，降低假陽性的出現(xiàn)幾率，特異性較強(qiáng)，省時(shí)省力，該試劑盒將 檢測時(shí)間縮短至3小時(shí)，大大提高了工作效率。
[0050] 5、本發(fā)明特別適合于口蹄疫病毒感染的大量臨床樣本的快速診斷，可W為臨床和 科研上口蹄疫病防治和治療提供科學(xué)依據(jù)，而且對(duì)提高口蹄疫病毒病原的檢測、監(jiān)控、疫苗 研制等具有重要意義。
【附圖說明】
[0051 ]圖1為RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖；其中，泳道M代表化2000DNA MarkeH 從上到下依次為2000bp、1 OOObp、750bp、500bp、250bp、1 OObp )，泳道1 為口蹄疫病毒 Asial型陰性對(duì)照，2為口蹄疫病毒Asial型陽性對(duì)照，3為口蹄疫病毒Asial型樣品;4為口蹄 疫病毒A型陰性對(duì)照，5為口蹄疫病毒A型陽性對(duì)照，6為口蹄疫病毒A型樣品；7為口蹄疫病毒 陰性對(duì)照，8為口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染陽性對(duì)照，9為口蹄疫病毒A型和Asial型 混合感染樣品。
[0化2]圖2為RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖；其中，泳道M代表化2000DNA MarkeH 從上到下依次為 2000bp、1000 bp、750bp、500bp、250bp、IOObp )，泳道 1 代表口 蹄疫病 毒A型和Asiar混合感染的樣品；泳道2-6分別代表口蹄疫病毒0型、C型、SATl (南非I)、SAT2 (南非II型)及SAT3(南非HI型)樣品。
【具體實(shí)施方式】
[0053] W下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0054] 本發(fā)明所用的聚乙締基化咯燒酬的相對(duì)分子量為40000。
[0化5] 本發(fā)明所用的徑基哇嘟為2-徑基哇嘟。
[0056] 實(shí)施例1用于檢測口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的試劑盒 [0化7] 1、引物的設(shè)計(jì)
[0化引根據(jù)口蹄疫病毒的3D基因組序列，設(shè)計(jì)引物對(duì)FMDA和FMDAsia,其中，
[0化9] 引物對(duì)FMDA:
[0060] 上游引物FMDAF: 5' -GCAACCCAGATGTTGAT-3'(沈Q ID NO. 1)
[0061] 下游引物FMD0R:5'-CCACATGGACTATGGAA-3'(沈Q ID N0.2)
[0062] 引物對(duì) FMDAsia:
[0063] 上游引物FMDAsiaF:5'-CTGGGTTTTACAAACCTGTG-3'(沈Q ID N0.3)
[0064] 下游引物尸]\?^31曰尺:5'-(：1'口'64〔61'〔4〔441766(：-3'(569 10^.4)。
[00化]2、RNA的提取
[0066] W確診攜帶口蹄疫病毒A型和AsiaI型混合感染的黃牛為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，提取樣品RNA， 包括W下步驟：
[0067] (1)樣品的采集
[0068] 采集黃牛全血10化1，加入無 RNA酶污染的離屯、管中備用。
[0069] (2)樣品RNA的提取
[0070] (a)在采集的10化1全血中，加裂解液50化1,1200化pm離屯、30s，分離出上清液；
[0071] (C)將上清液轉(zhuǎn)入離屯、管中，加無水乙醇50化1，分次轉(zhuǎn)到RNA純化柱上，12000巧m 離屯、30s，得到粗提的RNA;
[0072] (d)用沖洗液50化1沖洗RNA純化柱，12000巧m離屯、30s;
[0073] (e)將RNA純化柱轉(zhuǎn)到另一離屯、管，加超純水50iil，12000巧m離屯、30s，得到病毒及 組織基因組的RNA，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0074] 裂解液的組分為：徑基哇嘟3% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、憐酸S氯乙醋3.化M、異硫氯酸苯醋 3.5iiM、聚乙締基化咯燒酬1.3 % (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、氯化鋼0.3M和巧樣酸鋼0.9M。
[00巧]沖洗液的組分為：=徑甲基氨基甲燒IOiiM,乙二胺四乙酸IiiM,乙醇60% (體積分 數(shù)）;抑7.0。
[0076] 3^RT-PCR
[0077] W樣品RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，同時(shí)W豬水瘤病病毒為陰性對(duì)照，W 口蹄疫 病毒A型和Asia 1型混合感染為陽性對(duì)照，提取陰性對(duì)照和陽性對(duì)照樣品的RNA，RT-PCR擴(kuò) 增，反應(yīng)體系25山：5XRT Buffer扣1、12.5咖dNTPs 5iU、125iiM上游引物FMDAF和125測下 游引物FMDAR各化1、125測上游引物FMDAsiaF和125測下游引物FMDAsiaR各化1、25UAU Taq 酶0.化1、2.抓AU RNA酶抑制劑化l、2.5iiM反轉(zhuǎn)錄酶化1、超純水3.化1和5ngAU RNA化1。 [007引 RT-PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?0°C30min，94°C3min;94°C40s，55°C45s，72°C30s，共 35 個(gè)循 環(huán)；72°C3min。
[0079] 4、RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測
[0080] 取RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物扣1和Loading Buffer 5山混勻，加到含邸的1.0%的瓊脂糖凝 膠中，同時(shí)加入陰性對(duì)照、陽性對(duì)照的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和DL2000DNA Marker，電壓為120V， 電泳35min，然后在凝膠成像儀中觀察結(jié)果(結(jié)果見圖1)。
[0081] 實(shí)施例2用于檢測口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的試劑盒
[0082] 實(shí)施例2的試劑盒與實(shí)施例1的試劑盒基本相同，不同之處在于:本實(shí)施例的裂解 液的組分為徑基哇嘟5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、憐酸=氯乙醋化M、異硫氯酸苯醋2.5iiM、聚乙締基化 咯燒酬2% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、氯化鋼0.5M和巧樣酸鋼0.6M。沖洗液的組分為S徑甲基氨基甲燒10 咖，乙二胺四乙酸化M，乙醇80 % (體積分?jǐn)?shù)）；抑7.0。
[0083] 本實(shí)施例W確診攜帶口蹄疫病毒A型的黃牛為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，W豬水瘤病病毒為陰性 對(duì)照，W 口蹄疫病毒A型為陽性對(duì)照，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果見圖1 (檢測方 法同實(shí)施例1)。
[0084] 實(shí)施例3用于檢測口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的試劑盒
[0085] 實(shí)施例3的試劑盒與實(shí)施例1的試劑盒基本相同，不同之處在于:本實(shí)施例的裂解 液的組分為徑基哇嘟4% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、憐酸=氯乙醋5.2iiM、異硫氯酸苯醋l.SiiM、聚乙締基 化咯燒酬3.5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、氯化鋼0.4M和巧樣酸鋼0.8M。沖洗液的組分為S徑甲基氨基甲 燒1 OiiM，乙二胺四乙酸IiiM，乙醇70 % (體積分?jǐn)?shù)）；抑7.0。
[0086] 本實(shí)施例W確診攜帶口蹄疫病毒Asial型的黃牛為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，W豬水瘤病病毒為 陰性對(duì)照，W 口蹄疫病毒AsiaI為陽性對(duì)照，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果見圖1 (檢測方法同實(shí)施例1)。
[0087] 使用本發(fā)明實(shí)施例1的試劑盒提取不同樣品的基因組RNA，對(duì)提取的基因組RNA的 濃度和純度進(jìn)行測定，結(jié)果見下表。
[008引表本發(fā)明試劑盒提取的基因組RNA濃度和純度的測定結(jié)果 「OOROl
LUUW」 化：KiNAm殷半巧ng/tu ; W兀殷化但巧KiNA化ZbUnm邪ZSUnm鮮ti'、」W兀殷化但 (260/280)，通過吸光度比值來判斷RNA的純度，從上表可W看出，吸光度值在1.8~2.0之 間，說明提取的RNA純度較好。
[0091] 表中樣品1、2、3、4、5、6、7分別為使用該試劑盒從10化1血清中提取約0.96iig、1.06 ]ig、l .01]ig、l .0f5]ig、0.99iig、l .0化g、l .Olug基因組RNA。
[0092] 實(shí)驗(yàn)例
[0093] 1、用于檢測口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的試劑盒特異性實(shí)驗(yàn)
[0094] W確診攜帶口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的黃牛為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，驗(yàn)證本發(fā)明檢 測口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的RT-PCR試劑盒的特異性，包括W下步驟：
[0095] (1)樣品的采集
[0096] 采集黃牛全血10化1，加入無 RNA酶污染的離屯、管中備用。
[0097] (2)樣品RNA的提取(裂解液和沖洗液的配方同實(shí)施例1)
[0098] (a)在采集的10化1全血中，加裂解液50化1,1200化pm離屯、30s，分離出上清液；
[0099] (C)將上清液轉(zhuǎn)入離屯、管中，加無水乙醇50化1，分次轉(zhuǎn)到RNA純化柱上，12000巧m 離屯、30s，得到粗提的RNA;
[0100] (d)用沖洗液50化1沖洗RNA純化柱，12000巧m離屯、30s;
[0101] (e)將RNA純化柱轉(zhuǎn)到另一離屯、管，加超純水50iil，12000rpm離屯、30s，得到病毒及 組織基因組的RNA，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0102] (3)RT-PCR
[0103] W樣品RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，同時(shí)Wo型、C型、SATl(南非I)、SAT2(南非II 型）及SAT3 (南非HI型）樣品為對(duì)照，提取對(duì)照樣品的RNA，RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25山：5 X RT Buffer 5iil、12.化M dNTPs 5iU、125iiM上游引物FMDAF和 125咖下游引物FMDAR各化 1、 125礎(chǔ)上游引物FMDAsiaF和125咖下游引物FMDAsiaR各化1、25UAU Taq酶0.化1、2.抓AU RNA酶抑制劑化l、2.5iiM反轉(zhuǎn)錄酶化1、超純水3.化1和SngAU RNA化1。
[0104] RT-PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?0°C30min，94°C3min;94°C40s，55°C45s，72°C30s，共 35 個(gè)循 環(huán)；72°C3min。
[0105] (4)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測
[0106] 取RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物扣1和Loading Buffer 5山混勻，加到含邸的1.0%的瓊脂糖凝 膠中，同時(shí)加入對(duì)照的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和化2000DNA Marker,電壓為120V，電泳35min，然后 在凝膠成像儀中觀察結(jié)果(結(jié)果見圖2)。
[0107] 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，本發(fā)明樣品RNA的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在86化和2(K)bp出現(xiàn) 條帶，對(duì)照的口蹄疫病毒Asial型擴(kuò)增片段為2(K)bp，口蹄疫病毒A型擴(kuò)增片段為86化P，證明 本發(fā)明RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為口蹄疫病毒A型和Asial型目的片段，與預(yù)期相符，證明本發(fā)明RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為口蹄疫病毒A型和Asiar混合感染目的片段。同時(shí)，對(duì)照的0型、C型、SATl (南 非I)、SAT2(南非II型)及SAT3(南非III型)樣品RT-PCR擴(kuò)增未出現(xiàn)特異性條帶，說明本發(fā)明 的RT-PCR試劑盒具有良好的特異性。
[0108] 2、用于檢測口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)
[0109] 將提取的RNA取化g/山作10倍系列稀釋，分別取化g/山、IOOngAU、IOngAU、IngAi 1、IOOpg/山、IOpgAU、IpgAU、0.1 pg/山、0.0 lpg/山、0.0 OlpgAU RNA進(jìn)行RT-PCR-步法進(jìn) 行擴(kuò)增，結(jié)果表明本發(fā)明的最低檢測限為0.1 pgAU,運(yùn)比普通的RT-PCR兩步法的敏感性 (IpgAU)高出 10 倍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的引物，其特征在于，所述的引物 包括引物對(duì)FMDA和FMDAs ia，其中， 引物對(duì)FMDA: 上游引物FMDAF: 5' -GCAACCCAGATGTTGAT-3' 下游引物FMDAR: 5' -CCACATGGACTATGGAA-3' 引物對(duì)FMDAs ia: 上游引物FMDAsiaF: 5' -CTGGGTTTTACAAACCTGTG-3' 下游引物 FMDAsiaRj' -CTCTGACGTCACAATTGGC-3'。2. -種用于檢測口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的試劑盒，其特征在于，所述的試 劑盒包括引物對(duì)FMDA和FMDAs ia，其中， 引物對(duì)FMDA: 上游引物FMDAF: 5' -GCAACCCAGATGTTGAT-3' 下游引物FMDAR: 5' -CCACATGGACTATGGAA-3' 引物對(duì)FMDAs ia: 上游引物FMDAsiaF: 5' -CTGGGTTTTACAAACCTGTG-3' 下游引物 FMDAsiaRj' -CTCTGACGTCACAATTGGC-3'。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的試劑盒，其特 征在于，所述的試劑盒還包括5XRT Buffer、dNTPs、Taq酶、RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶、超純 水、裂解液和沖洗液。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的試劑盒，其特 征在于，所述的試劑盒還包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的試劑盒，其特 征在于，所述的裂解液的組分為:羥基喹啉3~5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、磷酸三氯乙酯3.2~5.2μΜ、 異硫氰酸苯酯1.5~3.5μΜ、聚乙烯基吡咯烷酮1.3~3.5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、氯化鈉0.3~0.5Μ和 朽1檬酸鈉〇. 6~0.9Μ。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測口蹄疫病毒Α型和Asial型混合感染的試劑盒，其特 征在于，所述的沖洗液的組分為:三羥甲基氨基甲烷1〇μΜ，乙二胺四乙酸ΙμΜ，乙醇60~80% (體積分?jǐn)?shù)）;ρΗ 7.0。7. -種如權(quán)利要求3所述的用于檢測口蹄疫病毒Α型和Asial型混合感染的試劑盒的使 用方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 樣品的采集 (2) 樣品RNA的提取 (3) RT-PCR 對(duì)樣品RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25yl:5XRT Buffer 5μ1、12.5μΜ dNTPs 5μ1、 125μΜ上游引物FMDAF和125μΜ下游引物FMDAR各ΙμL、125μΜ上游引物FMDAs iaF和125μΜ下游 引物FMDAsiaR各ΙμL、25UAU Taq酶0 · 5μ1、2· 5υ/μ1 RNA酶抑制劑ΙμL、2 · 5μΜ反轉(zhuǎn)錄酶ΙμL、 超純水3.5μ1 和5ng/yl RNA 5μ1; RT-PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?〇1€3〇111丨11，941€31^11;94 1€4〇8,551€458,721€3〇8，共35個(gè)循環(huán)；72 °C3min； (4) RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于檢測口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的試劑盒的使用 方法，其特征在于，所述的樣品的采集分為固體狀動(dòng)物組織的采集或液體狀動(dòng)物組織的采 集;其中， 固體狀動(dòng)物組織的采集方法為:無菌采集動(dòng)物組織病料O.l-lOOmg，裝入無 RNA酶污染 的離心管中備用； 液體狀動(dòng)物組織的采集分為分泌液的采集或血液的采集，分泌液的采集方法為：用鼻 咽拭子采集鼻咽液，裝入無 RNA酶污染的離心管中備用;血液的采集方法為:取全血、血清或 血漿10-100μ 1，加入無 RNA酶污染的離心管中備用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于檢測口蹄疫病毒Α型和Asial型混合感染的試劑盒的使用 方法，其特征在于，所述的樣品RNA的提取，具體方法為： (1) 將固體狀的動(dòng)物組織先進(jìn)行研磨處理，液體狀的動(dòng)物組織直接用于提取； (2) 在研磨后成糊狀的動(dòng)物組織20-100mg或液體狀動(dòng)物組織20-100μ1中，加裂解液500 μL，12000rpm離心30s，分離出上清液； (3) 將上清液轉(zhuǎn)入離心管中，加無水乙醇500μ1，分次轉(zhuǎn)到RNA純化柱上，12000rpm離心 30s，得到粗提的RNA; (4) 用沖洗液500μ1沖洗RNA純化柱，12000rpm離心30s; (5) 將RNA純化柱轉(zhuǎn)到另一離心管，加超純水50yl，12000rpm離心30s，得到病毒及組織 基因組的RNA，于-20 °C保存?zhèn)溆谩?0. -種如權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)所述的用于檢測口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的 試劑盒在檢測口蹄疫病毒A型和As ial型混合感染方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105861752SQ201610346010
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月23日
【發(fā)明人】李海利, 徐引弟, 朱文豪, 焦文強(qiáng), 蘭亞莉, 徐照學(xué), 藺萍
【申請(qǐng)人】河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所