一種輔助診斷川崎病的核酸標記物及試劑盒的制作方法【專利摘要】本發(fā)明屬于疾病檢測試劑盒，具體涉及利用miRNA作為生物學(xué)標記物輔助診斷川崎病的試劑盒。所述核酸標記物為hsa?miR?223?3p，所述試劑盒中包括對hsa?miR?223?3p進行實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT?qPCR）的引物。本發(fā)明所述試劑盒結(jié)合血常規(guī)、高敏C反應(yīng)蛋白、血沉、心臟超聲檢查，有助于輔助診斷川崎病及預(yù)測冠狀動脈損害?！緦＠f明】一種輔助診斷川崎病的核酸標記物及試劑盒[0001]本發(fā)明屬于疾病檢測試劑盒，具體涉及利用miRNA作為生物學(xué)標記物輔助診斷川崎病的試劑盒?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]川崎病(Kawasakidisease，KD)是一種急性血管炎綜合征，多發(fā)于嬰幼兒，是兒童最常見的后天性心臟病，病變主要累及中小動脈，尤其是冠狀動脈，可形成冠狀動脈擴張或冠狀動脈瘤，是成年后缺血性心臟病的危險因素之一。KD的病因及發(fā)病機制仍不十分清楚，目前研究趨勢認為KD是在一定遺傳易患性的基礎(chǔ)上，由外源性抗原觸發(fā)，引起機體免疫功能紊亂所致，免疫系統(tǒng)的高度活化及血管炎是KD的基本病理特征。KD的診斷目前亦無特異性的實驗室指標，主要根據(jù)臨床表現(xiàn)做出診斷，雖然心臟超聲檢查對KD的診斷起重要作用，但仍缺乏更為敏感及特異性的診斷指標。未經(jīng)治療的KD患兒中25%可發(fā)展成冠狀動脈永久性損害，最終導(dǎo)致冠狀動脈瘤的形成。使用大劑量的靜脈丙種球蛋白（intravenousimmune81〇1^1111，1￥16)(28/1^)聯(lián)合阿斯匹林治療已成為1(0的標準治療，可以使冠狀動脈損害的發(fā)生率降至5%左右，但仍有部分患兒對IVIG治療無反應(yīng)。因此，雖然人們對KD的認識和處理不斷深入，但如何減輕KD血管炎癥從而減輕血管內(nèi)皮損傷，以及如何早期診斷川崎病并及時干預(yù)，一直是有待解決的問題。[0003]申請?zhí)枮?01280024575.6的發(fā)明提供了用于診斷和治療川崎病的組合物和方法。更具體地，KD患者的蛋白質(zhì)組富集安眠蛋白A、細絲蛋白B和細絲蛋白C，所述蛋白用作KD的生物標志物(和潛在的治療靶點）。因此，使用本發(fā)明中提供的組合物和方法檢測這些生物標志物可為遞送至受試者的療法提供信息。[0004]申請?zhí)枮?01280070975.0的發(fā)明提供了川崎病(KD)的生物標志物。在某些方面，本發(fā)明提供了用于檢測KD生物標志物的方法，如用于檢測升高的TOGFC表達。同樣地，本發(fā)明描述了治療具有KD的生物標志物的受試者的方法。[0005]申請?zhí)枮?01310217292.X的發(fā)明提供了PPP3CC基因或其表達產(chǎn)物在治療川崎病中的應(yīng)用。具體地，涉及一種鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶3催化亞基Y亞型蛋白（PPP3CC)基因、蛋白、或其促進劑的用途，用于制備（i)提高1，4,5三磷酸肌醇3激酶C(ITPKC)的表達量和/或活性；和/或（ii)治療川崎病(Kawasakidisease)的藥物組合物。本發(fā)明有益于了解川崎病的發(fā)病機制和路徑，并開發(fā)治療川崎病的藥物。[0006]申請?zhí)枮?01410709423.0發(fā)明公開了快速診斷川崎病的核酸標記物及其試劑盒，該核酸標記物為4種miRNAs(小分子RNAmiR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p)，所述試劑盒中含有針對這4種miRNAs進行熒光定量PCR檢測的引物;診斷川崎病就只需定量分析血清中exosome里的這4種miRNA含量，然后對這4種miRNA的Ct值進行特定的分析即可。本發(fā)明具有取材方便、操作簡單、特異性強、時間花費少、快速準確、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點，能及時、快速、客觀、準確診斷川崎病患兒，尤其是通過一次實驗即可將川崎病與常見易混淆癥狀的病毒感染分開，有傳統(tǒng)診斷方法所不具備的優(yōu)勢。因此，本發(fā)明對川崎病患兒的快速診斷具有極大的臨床應(yīng)用價值，為進一步研制出在川崎病患兒上使用的快速診斷試劑盒提供了方向性。[0007]microRNA(miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼的單鏈小分子RNA，約由21~25個核苷酸組成。miRNA通過與革E1基因mRNA的3非編碼區(qū)（3'-untranslatedregion，3'-UTR)特異性結(jié)合，能夠使mRNA降解或抑制其翻譯，從而發(fā)揮其抑制靶mRNA，達到調(diào)控蛋白水平的作用。當前認為miRNAs可以調(diào)控30%人類編碼蛋白質(zhì)的基因，且一個miRNA可以調(diào)控多個靶基因表達，而同一個基因也可受多種miRNA調(diào)控。miRNA參與細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程，其表達水平的改變可引起多種疾病的發(fā)生，包括心血管疾病。以往普遍認為，miRNA作為細胞內(nèi)內(nèi)源性的RNA調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達。然而，最近的研究表明，miRNA能夠在循環(huán)血液中被檢測到，并可作為疾病的生物學(xué)標志物(參見:MitchellPS，ParkinRK，KrohEM，etal.CirculatingmicroRNAsasstableblood-basedmarkersforcancerdetection[J].ProcNatlAcadSciUSA.2008；105:10513-10518；SkogJ,ffurdingerT,vanRijnS,etal.GlioblastomamicrovesiclestransportRNAandproteinsthatpromotetumourgrowthandprovidediagnosticbiomarkers.[J].NatCellBiol.2008;10:1470-1476)。并且，miRNA以一個非常穩(wěn)定的狀態(tài)存在于血清或血漿中，即使是經(jīng)受反復(fù)冷凍/解凍，也可免受核糖核酸酶的降解。血漿中的miRNA有特異的表達譜，在心血管疾病，如心肌損害、冠狀動脈疾病、心臟衰竭等，其循環(huán)中的miRNA已被證實。川崎病作為最常見的后天性兒童心血管疾病，表現(xiàn)為全身免疫性中小血管炎及血管內(nèi)皮功能障礙，然而其血漿中miRNA的表達及其作用機制，國內(nèi)外報道甚少。【
發(fā)明內(nèi)容】[0008]本發(fā)明的目的是提供一種快速輔助診斷川崎病的核酸標記物。[0009]本發(fā)明的另一目的是提供一種快速輔助診斷川崎病的試劑盒。[0010]為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種輔助診斷川崎病的核酸標記物，所述核酸標記物為hsa-miR-223-3p，具有如SEQ6所示的核苷酸序列TGGGGTATTTGACAAACTGAC〇[0011]優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述核酸標記物hsa-miR-223-3p為血衆(zhòng)中的miRNA。[0012]因此，本發(fā)明要求保護血漿中的miRNA作為川崎病的核酸標記物的應(yīng)用。[0013]本發(fā)明同時要求保護一種輔助診斷川崎病的試劑盒，所述試劑盒包括對血漿中的hsa-miR-223-3p進行定量檢測的試劑。[0014]優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述試劑盒中包括對hsa-miR-223_3p進行實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR)的引物。更優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述引物如SEQ4所示，5'TGTCAGTTTGTCAAATACCCCA37〇[0015]優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述試劑盒中包括陽性參照試劑與隱形參照試劑。[0016]本發(fā)明同時要求保護所述具有SEQ6所述核苷酸序列的miRNA在制備減輕川崎病的血管炎癥反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用。[0017]由于上述技術(shù)方案的應(yīng)用，本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：[0018]1、本發(fā)明有助于川崎病和普通發(fā)熱性疾病的鑒別，通過定量分析血漿中miR-223-3p的含量，能及時、快速、客觀、準確診斷川崎病患兒，尤其是通過一次實驗即可將川崎病與常見易混淆癥狀的病毒感染分開，有傳統(tǒng)診斷方法所不具備的優(yōu)勢。因此，本發(fā)明對川崎病患兒的快速診斷具有極大的臨床應(yīng)用價值，并且為進一步研制出在川崎病患兒上使用的快速診斷試劑盒提供了方向性。[0019]2、由于miRNA芯片和RT-qPCR驗證結(jié)果共同表明：hsa-miR-223-3p在KD急性期血漿中表達顯著性上調(diào)，因此，本發(fā)明所述快速輔助診斷川崎病的核酸標記物結(jié)合血常規(guī)、高敏C反應(yīng)蛋白、血沉、心臟超聲檢查，有助于輔助診斷川崎病及預(yù)測冠狀動脈損害。[0020]3、川崎病在病程2周左右為冠狀動脈損害的高發(fā)期，在早期檢測川崎病血漿中miR-223-3p及IL-6的含量，有助于預(yù)測是否并發(fā)冠狀動脈損害。[0021]4、本發(fā)明具有取材方便、操作簡單、特異性強、時間花費少、快速準確、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點?！靖綀D說明】[0022]圖1為實施例一中單熒光芯片樣品數(shù)據(jù)兩兩比較的散點圖列陣繪制成矩陣圖（散點圖中每一個點代表芯片上的探針點，該點在二維平面中的位置由其X軸坐標和Y軸坐標確定。X軸:對照組數(shù)據(jù)/實驗組數(shù)據(jù);Y軸:實驗組數(shù)據(jù)/對照組數(shù)據(jù)。落在圖形中y=x直線上的點，代表這個探針點在兩張芯片中準化信號值(Foldchange，F(xiàn)C)差異=1;落在圖形中位線兩側(cè)45°線之外的點，其代表這個探針點在兩張芯片中信號值差異FC>2);[0023]圖2為實施例一所得火山圖（灰色點:FC絕對值<2，p>0.05的miRNA。紅色點:FC絕對值22，p<0?05的miRNA，這些miRNA為顯著性差異miRNA。）；[0024]圖3為實施例一中芯片結(jié)果中差異表達miRNAs的聚類分析圖；[0025]圖4為實施例一中hsa-miR-16擴增曲線和溶解曲線；[0026]圖5為實施例一中hsa-miR-33b_3p擴增曲線和溶解曲線；[0027]圖6為實施例一中hsa-miR-223_3p擴增曲線和溶解曲線；[0028]圖7為實施例一中hsa-miR-765擴增曲線和溶解曲線；[0029]圖8為實施例一中KD組與對照組hsa-miR-765、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-33b-3p表達量均值比較；[0030]圖9為實施例二中IL-6濃度曲線；[0031]圖10為實施例二中hsa-miR-16擴增曲線和溶解曲線；[0032]圖11為實施例二中hsa-miR-223_3p擴增曲線和溶解曲線；[0033]圖12為實施例二中各組血漿hsa-miR-223_3p相對表達量比較；[0034]圖13為實施例二中KD急性期與亞急性期CAL組與nCAL組血漿hsa-miR-223-3p相對表達量比較；[0035]圖14為實施例二中各組血漿IL-6水平比較；[0036]圖15為實施例二中KD急性期與亞急性期CAL組與nCAL組血漿IL-6水平比較。具體實施例[0037]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。[0038]實施例一，選取蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院就診的急性期KD患兒6例，及健康兒童6例作為對照，清晨抽取空腹血，分離血漿，提取血漿中總RNA，采用miRNA芯片雜交技術(shù)檢測川崎病組及正常對照組血漿中差異表達的miRNAs。再選取急性期KD患兒及健康兒童各8例，采用實時定量PCR(real_timequantitativePCR，RT_qPCR)技術(shù)驗證芯片結(jié)果。利用TargetScan，PITA和microRNAorg三個數(shù)據(jù)庫對差異miRNAs進行靶基因預(yù)測，使用DAVID生物信息學(xué)分析軟件對共同的靶基因進行G0和KEGG分析，尋找與KD血管炎癥相關(guān)的靶基因。[0039]1.實施例中涉及的儀器[0040]1.1血漿分離及保存的主要儀器[0041]乙二胺四乙酸鉀（EDTA-K2)抗凝管北京積水創(chuàng)格醫(yī)療科技有限公司KDC-40低速離心機安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司Centrifuge5810R臺式高速冷凍離心機Epp'emi.o.ef公司-80°C、4°C冰箱日本SANYOA公司移液器（20-200PL)ThermoScientific公司槍頭（1-200uL)上海百賽生物技術(shù)有限公司[0042]1.2基因芯片檢測需主要儀器G2505C基因芯片微陣列掃描儀Agilent公司G2545A雜交爐Agilent公司G2939A2100Agilent公司2100振蕩器（％00)Agilent公司NanoDropND-SOOO分光光度計ThermoScientific公司9700型PCR儀美國ABI5418離心機E:ppendoef公司5301濃縮儀Eppendoef公司[0043]LX-200離心機其林貝爾LX-300離心機-1其林貝爾GL-88B振蕩器-1其林貝爾GL-3250B磁力攪拌器其林貝爾HB-100金屬浴-2博日CHB-100金屬浴-3博日XMTD-8222電熱恒溫:培養(yǎng)箱精宏實驗設(shè)備BCD-265F冰箱榮事達[0044]1.3RT-qPCR檢測所需主要儀器9700型PCR儀美國ABILightCycler?480II型熒光定量PCR.儀瑞士羅氏公司[0045]0?2m.lPCR管Ax.yg'eiv公司384孔板瑞士羅氏公司l〇P4、20QH.1、Im.l槍頭Axygen公司[0046]2.實施例中涉及的主要試劑[0047]2.1基因芯片檢測需主要試劑[0048]芯片AgilentHumanmiRNA(S:*6〇K，DesignID:046064)Agilent公司AMBION血清血漿試劑盒（AM1556)Agilent公司GeneExpressioiiWashPack(基因表達洗掙包5188-5327)Agilent公司miRKAcompleteLabelingandHybKit(5190-Q456)Agileiit公口JmiRKASpikeInKi(5130-1934)Agilent公司MicroBio~Spm6~~(B：i〇-RAD)(732-6221)Bio-Rad公司Package20backings,8HDarraysperslide(G2534-60015)Agilent公司Package2Dbackings,4arraysperslide(G2534-6Q012)Agilent公'司ChipAgilent公司[0049]2.2RT-qPCR檢測所需主要試劑及引物[0050]PCR引物上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司設(shè)計，上海捷瑞生物工程有限公司合成miScriptII逆轉(zhuǎn)錄試(Qiagen劑盤德國Qiagen公司熒光定量PCRLightCycle-480SYBRGreenIMaster試劑盒瑞士羅氏公司通用引物德國Qiagen公司microR+NA特異性引物上海捷瑞生物工程有限公司[0051]Nuclease-freeH20(無RNA酶水）（公司）[0052]CellDisruptionBuffer(細胞破碎緩沖液）[0053]酚/氯仿[0054]無水乙醇[0055]miScriptHiSpecBuffer[0056]NucleicsMix[0057]miScriptReverseTranscriptaseMix(miScript逆轉(zhuǎn)錄酶混合物）[0058]由11111?熟(1^七口：//\^￥.111：[1^&86.01^/)基因數(shù)據(jù)庫中獲得118&1111?-16、118&111尺-765、hsa-miR-33b-3p、hsa-miR-223_3p的基因序列，米用PrimerPrimier5軟件（美國AppliedBiosystemInc)進行引物設(shè)計。11111?熟上游特異性引物序列如下，見下表。下游引物由Qiagen試劑盒自帶。[0059]引物核酸序列表[0061]3.靶基因預(yù)測軟件及數(shù)據(jù)分析軟件[0062]革巴基因預(yù)測軟件：TargetScan(http://www?targetscan?org/)[0063]PITA(http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html/)[0064]microRNAorg(http://www.microrna.org/microrna/home.do/)[0065]數(shù)據(jù)分析軟件:Venn(http://bioinfogp?cnb?csic?es/tools/venny/)[0066]DAVID功能注釋基因芯片生物信息學(xué)分析軟件（FunctionalAnnotationBioinformaticsMicroarrayAnalysis,DAVID)是一種生物信息數(shù)據(jù)庫，整合了生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具，為大規(guī)模的基因或蛋白列表(成百上千個基因ID或蛋白ID列表)提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息；可以從分子功能（molecularfunction，MF)、生物學(xué)過程(biologicalprocess，BP)、細胞組成（cellularcomponent，CC)三個方面對基因進行功能分析，我們米用DAVID(http://david?abcc?nciferf?gov/，version:6?7)在GeneOntology(細胞組成、分子功能、生物學(xué)過程）、KEGG通路等方面對miRNA靶基因進行功能注釋。[0067]4.臨床資料[0068]4.1基因芯片檢測所用的臨床資料[0069](1)KD組：2013年5月至2013年8月我院收治的急性期KD患兒6例，均符合我國在2006年召開的KD專題討論會中修訂的診斷標準，其中男2例，女4例，年齡7月至3歲10月，中位年齡2歲。[0070](2)正常對照組：同年齡組健康體檢兒童6例。男3例，女3例，年齡1歲5月至3歲1月，中位年齡1歲11月。見下表。[0071]KD患兒及對照組臨床資料表[0074]4.2RT-qPCR檢測所用的臨床資料[0075](1)KD組:2013年9月至2013年10月我院收治的急性期KD患兒8例，診斷標準同前，其中男5例，女3例，年齡11月至4歲8月，中位年齡1歲11月。[0076](2)正常對照組：同年齡組健康體檢兒童8例。男6例，女2例，年齡2月至4歲1月，中位年齡1歲7月。見下表。[0077]KD患兒及對照組臨床資料表[0078][0079]實施例一的具體操作步驟包括：[0080]1.血漿的分離:所有病例均于清晨空腹抽取肘靜脈血2ml，迅速轉(zhuǎn)入乙二胺四乙酸鉀(EDTA-K2)抗凝管中，充分混勻，在2小時內(nèi)4°C條件下820g離心10min。吸取約lml上清液轉(zhuǎn)至潔凈的1.5ml離心管中，4°C條件下16000g離心10min，吸取上清至新的離心管中，置于-80°C冰箱保存?zhèn)溆?。[0081]2.AgilentmiRNA19.0芯片篩選血漿中差異表達的miRNAs，包括以下步驟：[0082]2?1血衆(zhòng)總RNA提?。菏褂胢irVana?RNA分離試劑盒（AppliedBiosystemp/nAMI556)提取總RNA;[0083]2.2miRNA芯片操作流程:取lOOng總RNA起始，定容到2yL，然后去磷酸化，使樣品變性，連接標記。[0084]2.3芯片洗滌:取出芯片于洗液1中洗滌51^11;再將芯片放入洗液2中洗滌5111111(37°〇〇[0085]2.4芯片掃描：利用AgilentScannerG2505C(AgilentTechnologies)掃描儀中選擇相應(yīng)的參數(shù)掃描，得到原始圖像。[0086]上述血漿RNA樣品檢測和實驗評估的結(jié)果表明：[0087]A)樣品總RNA利用NanoDropND-2000定量并經(jīng)AgilentBioanalyzer2100檢測RNA完整性，所用標本質(zhì)量符合要求。[0088]B)實驗結(jié)果評估，medianCV(%)代表重復(fù)性探針變異系數(shù)，medianCV(%)值越小，實驗精度越高，芯片內(nèi)重復(fù)探針的％CV值應(yīng)小于15%，各樣本重復(fù)性比較好，見下表。[0089]KD組與對照組實驗結(jié)果評估表[0091]C)然后進行數(shù)據(jù)分析：[0092]I?米用FeatureExtraction軟件（versionl0.7.1?1，AgilentTechnologies)處理原始圖像提取原始數(shù)據(jù)。接著利用Genespring軟件（version12.5;AgilentTechnologies)進行quantile標準化和后續(xù)處理。單焚光芯片的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過標準化處理，轉(zhuǎn)化為log以2為底的對數(shù)后，在一個二維直角坐標系平面中，繪制散點圖，見圖1。芯片數(shù)據(jù)的散點圖常用于評估兩組數(shù)據(jù)總體分布集中趨勢。[0093]II.在篩選差異miRNA之前，先進行探針過濾，用于比較的每組樣本中至少有一組75%標記為Detected的探針留下進行后續(xù)分析。對于有生物學(xué)重復(fù)的分析，利用T檢驗得到的差異顯著性P值和標準化信號值的差異倍數(shù)，F(xiàn)C值進行篩選，標準為FC22.0且p<0.05。差異篩選結(jié)果，見下表。[0094]KD組與對照組差異篩選結(jié)果[0096]III.將比較所產(chǎn)生的差異表達情況反映到火山圖中去，X軸是差異倍數(shù)以2為底取對數(shù)的值，Y軸是p值以10為底取負對數(shù)的值。在設(shè)生物學(xué)重復(fù)的情況下（即使用統(tǒng)計分析法分析差異表達），給出火山圖，見圖2。[0097]IV.對差異miRNA進行非監(jiān)督層次聚類。計算多個樣品兩兩之間的距離，構(gòu)成距離矩陣，合并距離最近的兩類為一新類，計算新類與當前各類的距離，再合并、計算，直至只有一類為止，用挑選的差異miRNA的表達情況來計算樣品直接的相關(guān)性，一般來說，同一類樣品能通過聚類出現(xiàn)在同一個簇中，聚在同一個簇中的miRNA可能具有相似的生物學(xué)功能。用熱圖（Heatmap)展示，見圖3。[0098]3.RT-qPCR驗證血漿中差異表達的miRNAs，包括以下步驟：[0099]3.1RNA提?。和酒崛】俁NA。[0100]3?2逆轉(zhuǎn)錄合成（cDNA第一鏈）：利用miScriptnReverseTranscriptionKit(Qiagen，Germany)將待測RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系：總RNA，lug;5XmiScriptHiSpecBuffer，4yl;10XNucleicsMix,2yl；miScriptReverseTranscriptaseMix,2yl；Nuclease-freeH20,加至20yl。反應(yīng)程序：37°C60min，95°C5min。逆轉(zhuǎn)錄完畢后加入80ylNuclease-freeH2O儲存在-20°C冰箱備用。[0101](1)從_80°C冰箱中取出RNA，室溫下解凍，按下表在0.2mlPCR管中配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。[0103]【注】若RNA總量不足0.5yg，則取體系所能容納最大體積(6.5yl)[0104](2)ABI9700型PCR儀上37°C保溫60min使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完全后，95°C5min終止反應(yīng)。[0105](3)加入90ylNuclease-freeH20稀釋至100yl儲存在-20°C冰箱，用于后續(xù)實驗。[0106]3.3引物設(shè)計:上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司設(shè)計并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。[0107]3.4熒光定量？〇?:利用1^8111^，(316沙4805￥81?6代6111]\&18七61試劑盒（1?〇。116，Swiss)在LightCycler?480n型熒光定量PCR儀(1?〇(^6,5￥188)上進行反應(yīng)。體系：2\LightCycler?480SYBRGreenIMaster,5iil；lOyMUniversalprimer,0.2yl；lOyMmicroRNA-specificprimer，0?2yl;cDNA，lyl;Nuclease-freeH20,3?6yl。PCR程序：95°ClOmin;95°C10s，60°C30s，40個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后利用熔解曲線檢測產(chǎn)物特異性:從60°C緩慢升溫至97°C，每°C采集5次熒光信號。[0108](1)配制PCR反應(yīng)體系[0110](2)熒光定量PCR循環(huán)條件[0113]上述RT-qPCR驗證血漿中差異表達的miRNAs的結(jié)果顯示：[0114]A)總RNA質(zhì)檢結(jié)果:提取總RNA，利用NanoDrop2000分光光度計測定濃度及0D260/0D280，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。所用標本質(zhì)量符合要求，可用于RT-qPCR檢測。[0115]B)定量判定:RT-qPCR中每個樣本重復(fù)3次，取平均值為Ct值，用SPSS計算出各段各基因表達的平均Ct值，采用相對表達量2_AAet法比較各基因的表達差異：八(^=以細_-AACt=ACt纖亂口n-ACt繼亂口n〇[0116]C)RT-qPCR測定KD患兒血漿中hsa-miR-765、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-33b-3p相對表達量。在RT-qPCR過程中，以hsa-miR-16(內(nèi)參hhsa-miR-TeSjsa-miRjSS-Spjsa-miR-SSb-Sp熒光值和循環(huán)數(shù)作圖，自動得到擴增曲線和溶解曲線（圖4、5、6、7)。基因所得熔解曲線均為單一峰，PCR擴增特異性較好，三次技術(shù)重復(fù)的重復(fù)性較好。[0117]D)兩組間hsa-miR-765、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-33b-3p相對表達量的比較表明：KD組hsa-miR-223-3p、hsa-miR-33b-3p的相對表達量明顯高于正常對照組(p〈0.05);KD組hsa-miR-765相對表達量較正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.50)，見下表，圖8。[0118]KD組miRNAs表達量與正常對照組的相對比值G士s)[0120]注:a?KD組與正常對照組比較p〈0?05。[0121]4.靶基因預(yù)測[0122]分別用1&找6七3〇311，？114，1111(^〇1?祖〇找數(shù)據(jù)庫對差異表達的11111?祖進行靶基因預(yù)測，對三個數(shù)據(jù)庫預(yù)測到的靶基因進行Venny分析取交集，使用DAVID生物信息學(xué)分析軟件對共同的靶基因進行G0和KEGG分析。[0123]祀基因預(yù)測結(jié)果：分別用TargetScan，PITA，microRNAorg數(shù)據(jù)庫對差異hsa-miR-223-3p進行靶基因預(yù)測，對三個數(shù)據(jù)庫預(yù)測到的靶基因進行Venny分析取交集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)測的共同靶基因共有415個，見下表。[0124]hsa-miR-223_3p經(jīng)由TargetScan，PITA，microRNAorg預(yù)測所得的部分革巴基因[0126]對靶基因進行G0分析，從而對這個基因的功能進行描述。G0包括三大板塊，生物學(xué)過程(BP)，細胞組成(CC)和分子功能(MF)，所以有三類結(jié)果。統(tǒng)計每個G0條目中所包括的靶基因個數(shù)，并用統(tǒng)計檢驗的方法計算每個G0條目中靶基因富集的顯著性。計算的結(jié)果會返回一個富集顯著性的P值，小的P值表示靶基因在該G0條目中出現(xiàn)了富集?？梢愿鶕?jù)G0分析的結(jié)果結(jié)合生物學(xué)意義從而挑選用于后續(xù)研究的基因，針對以上415個靶基因，利用DAVID軟件，進行GO分析，將這些基因分別投射至GO的三大應(yīng)用功能上（即分子功能、生物學(xué)過程、細胞組分），結(jié)果顯示hsa-miR-223-3p預(yù)測靶基因集合分別富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄激活等分子功能，轉(zhuǎn)錄、代謝過程的負調(diào)控、發(fā)育進程等生物學(xué)過程及軸突、內(nèi)膜、質(zhì)膜等細胞組成上(p〈0.05)，見下表。[0127]hsa-miR-223-3p預(yù)測靶基因G0生物學(xué)過程分類(部分）[0131]hsa-miR-223-3p預(yù)測靶基因GO細胞組成分類(部分）[0133]hsa-miR-223-3p預(yù)測靶基因G0分子功能分類[0136]利用KEGG數(shù)據(jù)庫對預(yù)測得到的靶基因進行Pathway分析，并且用統(tǒng)計檢驗的方法計算每個Pathway條目中基因富集的顯著性。計算的結(jié)果會返回一個富集顯著性的p值，小的P值表示基因在該Pathway中出現(xiàn)了富集。Pathway分析對實驗結(jié)果有提示的作用，通過革巴基因的Pathway分析，可以找到富集祀基因的Pathway條目，尋找不同樣品的祀基因可能和哪些細胞通路的改變有關(guān)。對415個預(yù)測靶基因進行生物通路富集分析，結(jié)果顯示，在KEGG通路中hsa-miR-223-3p顯著富集于腫瘤通路，以及泛素介導(dǎo)的蛋白水解信號通路中（p〈0.05)，見下表。[0137]hsa-miR-223-3p預(yù)測靶基因的KEGG通路數(shù)據(jù)庫富集分析[0139]與炎癥有關(guān)的靶基因：應(yīng)用DAVID軟件分析發(fā)現(xiàn)與炎癥相關(guān)的靶基因共7個，為IL6ST、F3、EPHA3、SMAD1、HDAC9、NLRP3、HHEX。其GOID為（G0:0050727、G0:0050741、G0:0002675、G0:0050729、G0:0002673、G0:0002526、G0:0006954、G0:0030948、G0:0010574、G0:0030947、G0:0010575)，其主要生物學(xué)功能包括調(diào)控及監(jiān)管炎癥反應(yīng)，參與活化急性炎癥反應(yīng)的血漿蛋白及調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子信號途徑。其中IL6ST涉及了其中大部分生物學(xué)功能。[0140]因此，實施例一表明：miRNA芯片在KD急性期血漿中篩選到7個顯著上調(diào)的miRNAs(hsa-let-7b_5p，hsa-miR-223_3p，hsa_miR-4485，hsa_miR-4644，hsa-miR-4800_5p，hsa_11111?-651〇-5。和]18&-11111?-765)和3個顯著下調(diào)的11111?祖8(]18&1111?-3313-3。，]18&-11111?-4443和hsa-miR-4515)。結(jié)合RT-qPCR驗證結(jié)果，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-223_3p表達顯著性上調(diào)與芯片結(jié)果一致。靶基因預(yù)測分析共獲得415個共同的靶基因，使用DAVID軟件分析發(fā)現(xiàn)與炎癥有關(guān)的靶基因共7個，分別為幾63!'小3、3嫩01、冊409、11^33?擬3和班^乂。結(jié)合微陣列芯片技術(shù)與RT-qPCR技術(shù)我們獲得川崎病急性期血漿中差異表達的miRNAS(3hsa-miR-223-3p可能參與了KD的病理生理過程。[0141]實施例二，以hsa-miR-223-3p為研究對象，探討hsa-miR-223-3p在KD丙種球蛋白治療前后血漿中的表達及其與炎性細胞因子IL-6的相關(guān)性，初步探討hsa-miR-223-3p檢測對KD的臨床意義。選擇30例KD患兒，其中冠狀動脈損傷者10例，非冠狀動脈損傷者20例。發(fā)熱及正常對照組各12例。采用RT-qPCR技術(shù)檢測KD急性期和亞急性期血漿中hsa-miR-223-3p的表達量，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-1inkedimmunosorbentassay，ELISA)法檢測血漿中IL-6水平，比較各組間差異，并分析hsa-miR-223-3p與IL-6的相關(guān)性。[0142]1.實施例涉及的儀器乙二胺四乙酸鉀（EDTA-K2)抗凝管北京積水創(chuàng)格醫(yī)療科技有限公司KDC-40低速離心機安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司Centrifuge5810R臺式高速冷凍離心機_Ep.p.e.ndoef公司.-80°C、4°C冰箱日本SANY0A公司移液器（20-200yL)ThermoScientific公司[0143]槍頭（1-200PL)上海百賽生物技術(shù)有限公司NanoDropND-2000分光光度計ThermoScientific公司9700型PCR議美國AB丨LightCycle-480II型熒光定量PCR儀瑞士羅氏公司0.2mlPCR管Axygen公司384孔板瑞士羅氏公司1你1、200PJ、lml槍頭Axygen公司W(wǎng)ellwash4MK2洗板機芬蘭Thermo公司PYX_DHS數(shù)字顯示隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱上海躍進醫(yī)療器械廠TGL-168離心機上海安亭科學(xué)儀器廠[0144]XW-80A漩渦混合器上海青浦滬西儀器廠DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)千燥箱海精宏實驗設(shè)備有限公司0.1~50ml連續(xù)分液器T0M0SLIFESCLENCEGroup高通量組織研磨器寧波新芝.DENLEYDRAGONWellsc.an祖.30_標儀芬蘭Thermo.公司[0145]分析軟件：AscentsoftwareforMultiskan[0146]2.實施例中涉及的主要試劑[0147]RT-qPCR檢測同第一部分realtimePCR檢測所需主要試劑及引物[0148]酶標抗體工作液（EnzymeConjugate)(公司）[0149]標本稀釋液（SampleBuffer)[0150]濃縮洗滌液(WashBuffer)[0151]標準品（Standards)[0152]底物工作液(TMBSolution)[0153]第一抗體工作液(BiotinylatedAntibody)[0154]終止液（StopSolution)[0155]3.實施例中涉及的臨床資料[0156](1)KD組:2013年8月至2014年8月我院收治的KD患兒30例，均符合我國在2006年召開的KD專題討論會中修訂的診斷標準，其中男18例，女12例，年齡4月至7歲6月，中位年齡1歲6月。根據(jù)KD患兒按病程分為急性期（IVIG治療前，病程第1~11天），亞急性期（IVIG治療后，體溫正常，病程第11~21天）。根據(jù)心臟彩色多普勒檢測結(jié)果將期分為兩組:合并CAL者10例，無冠狀動脈損害(non-Coronaryarterylesion，nCAL)者20例。KD冠狀動脈損傷(CAL)標準：（1)冠狀動脈擴張:冠狀動脈內(nèi)徑〈3歲>2.5mm，3~9歲>3.5mm;(2)冠狀動脈瘤：不同形狀的冠狀動脈擴張，內(nèi)徑>4_，或者冠狀動脈局部擴張與相鄰內(nèi)徑比值超過1.5倍；(3)冠狀動脈內(nèi)膜回聲增強。[0157](2)發(fā)熱對照組：同期同年齡組急性期發(fā)熱住院患兒12例，男7例，女5例，年齡8月至6歲9月，中位年齡2歲5月，血清CRP正常，并排除其他結(jié)締組織疾病如幼年性特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎等。[0158](3)正常對照組：同年齡組健康體檢兒童12例。男8例，女4例，年齡12月至7歲，中位年齡2歲6月。[0159]實施例二具體包括以下步驟：[0160]1.血漿的分離:所有病例均于清晨空腹抽取2ml肘靜脈血，迅速轉(zhuǎn)入乙二胺四乙酸鉀(EDTA-K2)抗凝管中，充分混勻，在2小時內(nèi)4°C條件下820g離心10min。吸取約lml上清液轉(zhuǎn)至潔凈的1.5ml離心管中，4°C條件下16000g離心10min，吸取上清至新的離心管中，分為A、B組，置于-80°C冰箱保存?zhèn)溆茫珹組用于RT-qPCR檢測，B組用于ELISA檢測。[0161]2.RT-qPCR檢測血漿中hsa-miR-223_3p表達量:方法同實施例一中RT-qPCR檢測血漿中差異表達的miRNAs。[0162]3.ELISA法檢測血漿中IL-6水平:血漿在冰上混合物中解凍，用抗人IL-6單抗包被于酶標板上，每孔各加入標準品及血漿l〇〇ul，將反應(yīng)板充分混勻后置37°C40min，用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，在濾紙上印干，每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50ul(空白除外），將反應(yīng)板充分混勻后置37°C20min。再次用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，濾紙上印干，每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應(yīng)板置37°C10min。再次用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，濾紙上印干，每孔加入底物工作液lOOul，置37°C暗處反應(yīng)15min，之后每孔加入100ul終止液硫酸混勻。30分鐘內(nèi)用酶標儀在450nm處測吸光值，記錄0D值，IL-6濃度與0D值成正比，通過繪制標準曲線（圖9)，計算出血漿中IL-6濃度。[0163]4?統(tǒng)計學(xué)分析[0164]利用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)土標準差或中位數(shù)（范圍）表示，組間比較采用T檢驗或Kruskal-WallisH秩和檢驗，兩兩比較采用Nemenyi檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman's秩相關(guān)分析。P〈0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。[0165]5?結(jié)果及分析[0166]1.-般情況比較:下表為各組研究對象的臨床資料，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，KD組與發(fā)熱對照組及正常對照組在性別比例、年齡構(gòu)成上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>〇.05)。[0167]KD患兒及對照組臨床資料[0169]2.KD患兒急性期及亞急性期血漿hsa-miR-223-3p的相對表達量。[0170]2.1KD患兒及對照組兒童血漿hsa-miR-223-3p表達水平檢測[0171]2.1.1總RNA質(zhì)檢結(jié)果[0172]提取總RNA，利用NanoDrop2000分光光度計測定濃度及0D260/0D280，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。所用標本質(zhì)量符合要求，可用于RT-qPCR檢測。[0173]2.1.2定量判定[0174]RT-qPCR中每個樣本重復(fù)3次，取平均值為Ct值，用SPSS計算出各段各基因表達的平均ct值，采用相對表達量PAet法比較各基因的表達差異：Act=ctge_-ctrt*sa;aAct=AAct繼亂口n〇[0175]2.1.3RT-qPCR測定KD患兒血漿中hsa-miR-223_3p表達量。[0176]在RT-qPCR過程中，以hsa-miR_16(內(nèi)參）、hsa-miR-223_3p熒光值和循環(huán)數(shù)作圖，自動得到擴增曲線和溶解曲線（圖10、圖11)?；蛩萌劢馇€均為單一峰，PCR擴增特異性較好，三次技術(shù)重復(fù)的重復(fù)性較好。[0177]2.2各組間1^3-11111?-223-3口相對表達量的比較[0178]KD組患兒急性期血漿hsa-miR-223-3p相對表達量明顯高于發(fā)熱對照組(p〈0.05)及正常對照組（p〈〇.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；發(fā)熱對照組及正常對照組間血漿hsa-miR-223-3p表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。[0179]KD組患兒亞急性血漿hsa-miR-223-3p相對表達量與發(fā)熱對照組及正常對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>〇.〇5)。[0180]KD-CAL組急性期血漿hsa-miR-223-3p相對表達量明顯低于KD-nCAL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈〇.05)ID-CAL組亞急性期血漿hsa-miR-223-3p相對表達量低于KD-nCAL組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>〇.05)，見以下各表格以及圖12、圖13。[0181]KD急性期、亞急性期及發(fā)熱對照組血漿hsa-miR-223-3p表達量與正常對照組的相對比值G±s)[0183]注:a.KD急性期與正常對照組、發(fā)熱對照組比較p〈0.05;b.KD急性期與亞急性期比較p〈0.05;c.兩對照組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義p>0.05。[0184]KD中CAL組與nCAL組血漿hsa-miR-223-3p相對表達量(i±s)[0186]注:A表示CAL組，B表示nCAL組，a.急性期KD-CAL組與KD-nCAL比較p〈0.05;b.亞急性期KD-CAL組與KD-nCAL比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義p>0.05。[0187]3.KD患兒急性期和亞急性期血漿IL-6水平并與正常對照組、發(fā)熱對照組間的比較KD組患兒急性期血漿IL-6水平明顯高于發(fā)熱對照組(p〈0.05)及正常對照組(p〈0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;發(fā)熱對照組及正常對照組間血漿IL-6水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。KD組患兒亞急性血漿IL-6水平與發(fā)熱對照組及正常對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。KD-CAL組急性期血漿IL-6水平明顯高于KD-nCAL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p〈0.05)ID-CAL組亞急性期血漿IL-6水平高于KD-nCAL組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)，見以下各表格以及圖14、圖15。[0188]KD各期與兩對照組血漿IL-6水平(x土s)[0190]注:a.KD急性期與正常對照組、發(fā)熱對照組比較，p〈0.05;b.KD急性期與亞急性期比較p〈〇.05;c.兩對照組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義，p>0.05。[0191]KD中CAL組與nCAL組血漿IL-6水平比較(x土s)[0193]注:A表示CAL組，B表示nCAL組，a?急性期KD-CAL組與KD-nCAL比較，p〈0?05;b?亞急性期KD-CAL組與KD-nCAL比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，p>0.05。[0194]4.hsa-miR-223-3p與IL-6相關(guān)性分析[0195]KD急性期血漿中hsa-miR-223-3p表達量及血漿IL-6水平之間采用Spearman's秩相關(guān)分析，結(jié)果顯示hsa-miR-223-3p表達量與IL-6水平呈負相關(guān)，r=-0.563，p=0.089。[0196]實施例二通過對KD急性期和亞急性期血漿中的hsa-miR-223-3p和IL-6進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hsa-miR-223-3p的表達量在急性期KD患兒血漿中明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;在亞急性期KD患兒血漿中hsa-miR-223-3p的表達量與兩對照組間無明顯差異。KD-CAL組急性期血漿hsa-miR-223-3p表達量明顯低于KD-nCAL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;KD-CAL組亞急性期血衆(zhòng)hsa-miR-223_3p表達量低于KD-nCAL組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示hsa-miR-223-3p在KD血管炎癥中可能具有保護作用，急性期低水平的hsa-miR-223-3p可能是冠狀動脈損害的高危因素。[0197]IL-6水平在急性期KD患兒血漿中明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與文獻[31_32]報道一致;在亞急性期KD患兒血漿中IL-6水平與兩對照組間無明顯差異。KD-CAL組急性期血漿IL-6水平明顯高于KD-nCAL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。KD-CAL組亞急性期血漿IL-6水平高于KD-nCAL組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示IL-6的過多表達可能參與了KD患兒血管炎癥損傷機制。[0198]相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)KD患兒急性期血漿中hsa-miR-223-3p表達量與IL-6水平存在負相關(guān)。因此，我們推測，hsa-miR-223-3p可能在急性期可能通過抑制靶基因IL6ST的轉(zhuǎn)錄后表達，進一步抑制IL-6/STAT信號通路活化，從而減輕KD的血管炎癥反應(yīng)。SEQUENCELISTIM}<110〉蘇州大學(xué)陽屬兒童醫(yī)院"120>一種輔助診斷川崎病的核酸標記物及試劑盒<130^aeo>14<170>Patentlnversion3.5<210;1<211)22<212〉臟<213>人工合成<400)1tagcagcacgtaaatattggeg22[0199]LJ<210:>2<211>21<212>DNA<,213>人工合成<?400)2tggaggagaaggaaggtgatg21(210)3<211>22.<212>DKA<213)人工合成'400,3ragtgc.rtcggeagtgeagecc22^lO/4<213>22<2I2>DNAx213>人工合成<400>4tgtcagttt.gtcaaataeccca22<210>5<211>19<212>DNA<213>Chr22vl〇〇>5aaccacacaacctactacc19<210>6<211>21.<212>DNA〈213、ChrX<400>6tggggtatttgacaaactgac21[0200]<210>7<211，14(212，DNA<213>Chrl7<400>7gggctgcactgccg14-，21〇\8<^21i>15<212>DNA<213>Chr3<400>8aaaacccacgcctcc15<210〉9<211〉.1.5<212>DNA<213>ChrllMOQ>9ttagggtaccgcggc15<210>10<211>12<2I2>DNA<,213：>Chrl5<400〉10gggctgccggga.1.2<210>1.1<211>19:<212>DNA<.213>Chr6<400?11[0201]cttctgtctcttttctctc19<210〉12<211〉1.5<212>DM<213^Chr：4<400>12tccttcctt.cctcgg1§<210>13<211〉16x212>DNA<213>Chrl7(40G>.13gactcctctctctccc16<210>14x2U：>18[0202]<212>DNA<213>Chil<；400>14catcaccttccttctcct18【主權(quán)項】1.一種輔助診斷川崎病的核酸標記物，其特征在于，所述核酸標記物為hsa-miR-223-3p，具有如SEQ6所示的核苷酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的輔助診斷川崎病的核酸標記物，其特征在于，所述核酸標記物hsa-miR-223-3p為血漿中的miRNA。3.-種輔助診斷川崎病的試劑盒，所述試劑盒包括對血衆(zhòng)中的hsa-miR-223-3p進行定量檢測的試劑。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的輔助診斷川崎病的試劑盒，所述試劑盒中包括對hsa-miR-223-3p進行實時定量聚合酶鏈反應(yīng)的引物。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的輔助診斷川崎病的試劑盒，所述引物具有SEQ4所示的核苷酸序列。6.具有SEQ6所述核苷酸序列的miRNA作為川崎病的核酸標記物的應(yīng)用。7.具有SEQ6所述核苷酸序列的miRNA在制備減輕川崎病的血管炎癥反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用?！疚臋n編號】C12Q1/68GK105821119SQ201610065483【公開日】2016年8月3日【申請日】2016年1月29日【發(fā)明人】陳燁,呂海濤【申請人】蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院