一種中國被毛孢優(yōu)質(zhì)菌株的獲取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物科學(xué)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種中國被毛抱優(yōu)質(zhì)菌株的獲取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 冬蟲夏草[0曲iocordyceps sinensis(Berk. )G.H. Sung et al.]是我國傳統(tǒng)名貴 中藥，與人身、鹿茸齊名，具有多種藥理作用，近年來，由于市場需求逐年增加，野生資源難 W滿足需要，而人工培植冬蟲夏草由于技術(shù)及成本等方面的原因，產(chǎn)量有限，導(dǎo)致冬蟲夏草 的價(jià)格居高不下。冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體因具有某些方面與冬蟲夏草相類似的功效，受到越 來越多的青睞，良好的菌種來源是發(fā)酵的關(guān)鍵制約因素，多年的研究證實(shí)，中國被毛抱為冬 蟲夏草菌的無性型，獲得一株優(yōu)質(zhì)的中國被毛抱菌株將對中國被毛抱的發(fā)酵工業(yè)起著重大 的推動(dòng)作用。
[0003] 傳統(tǒng)的獲得中國被毛抱菌株的方式有組織分離（蟲體分離、子實(shí)體部位分離）、子 囊抱子分離和基內(nèi)分離幾種模式，基內(nèi)分離由于操作的復(fù)雜與其有關(guān)的內(nèi)容鮮有報(bào)道，組 織分離和子囊抱子分離均可W獲得較多的中國被毛抱菌株，但是獲得的菌株品質(zhì)良莽不 齊，后期需進(jìn)行大量的篩選工作，篩選出適合用于發(fā)酵的少數(shù)菌株進(jìn)行發(fā)酵，或通過各種形 式的誘導(dǎo)，W消除菌株發(fā)酵過程中產(chǎn)徒產(chǎn)黑色素或者菌株在傳代較少次數(shù)后即發(fā)生退化而 影響產(chǎn)量的不利因素，但運(yùn)往往需要較長的周期和繁雜的選育工作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種不損傷騙幅蛾幼蟲表皮前提下 獲取幼蟲消化液中（主要為腸液）中國被毛抱菌株的方法，運(yùn)種方法操作簡單不會(huì)使騙幅蛾 幼蟲受到損傷，獲得菌株的數(shù)量較多，且獲得的菌株不需經(jīng)過篩選及誘導(dǎo)直接可作為工業(yè) 發(fā)酵的初始菌株，菌絲體產(chǎn)量較高。
[0005] 本發(fā)明W被中國被毛抱感染后的中華騙幅蛾幼蟲消化道中（腸液為主）中的蟲菌 體為分離中國被毛抱菌株的初始材料，鱗翅目幼蟲消化道的pH多在8.5-11之間，而屬于鱗 翅目的騙幅蛾幼蟲的消化道偏堿性，多次測定的數(shù)據(jù)顯示在9-11之間。作為中華騙幅蛾幼 蟲的專一性寄主-中國被毛抱的最適生長pH值為5.5-7之間，而PH4-5.5及PH7-8之間生長極 為緩慢，在pH4與P冊的臨界值上幾乎不生長，PH4-8之外無在論培養(yǎng)基還是模擬腸液中中國 被毛抱菌體均不生長。傳統(tǒng)觀念上也認(rèn)為騙幅蛾幼蟲消化道的抑并不支持中國毛抱任何菌 體形態(tài)的生長，在實(shí)驗(yàn)研究中卻發(fā)現(xiàn)，騙幅蛾幼蟲消化道內(nèi)存在形態(tài)飽滿且處于增殖中的 蟲菌體，如附圖1所示，且W此蟲菌體為試材分離中國被毛抱菌株不僅分離的成功率較高， 每次分離培養(yǎng)均可獲得較多的菌株外，分離到的菌株在后期的菌種發(fā)酵中均表現(xiàn)出了優(yōu)良 的性能，騙幅蛾幼蟲特有的生理結(jié)構(gòu)維持了中國被毛抱W蟲菌體狀態(tài)在消化道內(nèi)生長并順 利增殖，同時(shí)，在運(yùn)特殊的生理環(huán)境下，中國被毛抱菌體完成了 "自然選育"的過程，不再需 要后期的誘導(dǎo)和篩選，為工業(yè)發(fā)酵菌株的選擇提供了較大的便利。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種中國被毛抱優(yōu)質(zhì)菌株的獲取方法，包 括如下步驟：
[0007] 1.收集幅蛾幼蟲消化液(主要為腸液）：
[000引取經(jīng)過侵染處理的騙幅蛾幼蟲，做化-24h饑餓處理，排空嗦囊內(nèi)食物殘?jiān)?，卡?幼蟲使其無法前后移動(dòng)，出于本能，蟲子會(huì)自然吐出消化液(主要為腸液，P朋-11之間）。將 幼蟲放回潔凈區(qū)繼續(xù)飼養(yǎng)。
[0009] 2.菌落培養(yǎng)
[0010] 收集消化液（主要為腸液)并進(jìn)行稀釋，將稀釋液涂布于帶有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿表 面，待菌落長至直徑為2-4mm時(shí)進(jìn)行單菌落轉(zhuǎn)管培養(yǎng)，防止菌落長大后交叉生長。待菌落直 徑為1.5-2.5cm時(shí)，即可作為中國被毛抱發(fā)酵的初始菌株。
[0011] -些實(shí)施例中，本發(fā)明步驟1所述的騙幅蛾幼蟲為3-5齡，W保證每只蟲的反吐物 的排出量大于0.化L。
[0012] -些實(shí)施例中，本發(fā)明步驟1所述的幼蟲饑餓處理所處的環(huán)境為:溫度8-12°C，相 對濕度65-85%，無光照。
[0013] -些實(shí)施例中，本發(fā)明步驟1所述的卡住幼蟲為在幼蟲胸腹部上方覆蓋一塊濾紙， 露出幼蟲的頭部及胸部1-2節(jié)部位，拇指及食指固定在蟲體兩邊的濾紙上，使得蟲子無法前 后移動(dòng)。
[0014] 一些實(shí)施例中，本發(fā)明步驟1所述的濾紙的大小為長:寬：10-15cm:7-10cm。
[0015] -些實(shí)施例中，本發(fā)明步驟2所述消化液(主要為腸液)的稀釋，優(yōu)選地稀釋至每10 yL稀釋液中菌體個(gè)數(shù)為8~12個(gè)。
[0016] -些實(shí)施例中，本發(fā)明步驟2所述培養(yǎng)皿培養(yǎng)基的配方為(質(zhì)量比）：葡萄糖28-32、 蛋白腺8-12、酵母提取物8-12、無水硫酸儀0.8-1.2、憐酸二氨鐘0.2-0.3、瓊脂16-20、抗生 素2-3、水800-1200，p冊.5-7,優(yōu)選的為葡萄糖30、蛋白腺10、酵母提取物10、無水硫酸儀1、 憐酸二氨鐘0.25、瓊脂18、抗生素2.5、水1000,抗生素優(yōu)選的為慶大霉素、阿奇霉素、青霉素 中的一種或多種。
[0017] -些實(shí)施例中，本發(fā)明步驟2所述的轉(zhuǎn)管培養(yǎng)，其中試管培養(yǎng)基的配方為（質(zhì)量 比）：葡萄糖28-32、蛋白腺8-12、酵母提取物8-12、無水硫酸儀0.8-1.2、憐酸二氨鐘0.2- 0.3、瓊脂16-20、水800-1200，p冊.5-7,優(yōu)選的為葡萄糖30、蛋白腺10、酵母提取物10、無水 硫酸儀1、憐酸二氨鐘0.25、瓊脂18、水1000。
[0018] -些實(shí)施例中，本發(fā)明步驟2菌落培養(yǎng)的環(huán)境為：避光、溫度15-18Γ、相對濕度 45%-65%。
[0019] 此外，本發(fā)明通過觀察菌落形態(tài)、顯微觀察分生抱子狀態(tài)，并對獲得的中華被毛抱 菌株進(jìn)行了 ITS特異性PCR擴(kuò)增并測序，測序比對結(jié)果為冬蟲夏草[Ophiocordyceps sinensis(Berk. )G.H.Sung et al.]，表明本發(fā)明所述的方法得到的菌株為真正的中國被 毛抱菌株。
[0020] 由W上技術(shù)方案可知，整個(gè)操作過程不會(huì)對騙幅蛾幼蟲造成損傷，收集完消化液 (主要為腸液)的幼蟲可W繼續(xù)正常生長，而且可W長成冬蟲夏草。
【附圖說明】
[0021] 圖1，巧光顯微鏡下腸道中出芽增殖的蟲菌體；
[0022] 圖2,單菌落分離培養(yǎng)菌落的顯微鏡檢-產(chǎn)抱結(jié)構(gòu)及分生抱子；
[0023] 圖3，轉(zhuǎn)管斜面上的菌落培養(yǎng)；
[0024] 圖4，本發(fā)明獲得中國被毛抱DNA序列的BLAST對比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 本發(fā)明實(shí)施例公開了一種中國被毛抱優(yōu)質(zhì)菌株的獲取方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W 借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng) 域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳 的實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本發(fā)明所述 方法進(jìn)行改動(dòng)或者適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0026] 為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明提供的一種中國被毛抱優(yōu)質(zhì)菌 株的獲取方法進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0027] 實(shí)施例1:本發(fā)明所述方法獲取優(yōu)質(zhì)中國被毛抱菌株 [00%] 1.收集幅蛾幼蟲消化液
[0029] (1)取經(jīng)過侵染處理的3齡騙幅蛾幼蟲50條，于無菌環(huán)境下用脫脂棉薩取75%酒精 溶液擦拭蟲體表面進(jìn)行消毒。
[0030] (2)取一張濾紙平鋪于經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)皿表面，在濾紙上噴灑少量無菌水，使濾紙 充分潤濕，滿盈但不溢出水分。將幼蟲放在濾紙上，為防止撕咬，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)一條蟲。于溫 度8 °C、相對濕度65 %、無光條件下做化饑餓處理。
[0031] (3)將幼蟲平放于桌面，在幼蟲胸腹部上方覆蓋小塊濾紙(長*寬，10*7cm)，露出幼 蟲的頭部及胸部1-2節(jié)部位，拇指及食指固定在蟲體兩邊的濾紙上，使得蟲子無法前后移 動(dòng)，出于本能，幼蟲會(huì)自然吐出消化液(主要為腸液，pH值10)。將幼蟲放回潔凈區(qū)繼續(xù)飼養(yǎng)。
[0032] 2.菌落的培養(yǎng)
[0033] (1)將50條幼蟲吐出的消化液(腸液)合并在一起，加入無菌水逐級稀釋，至每10化 稀釋液中菌體個(gè)數(shù)為8個(gè)。每10化稀釋液涂布于一個(gè)直徑9cm的帶有培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿 中，后將涂布好的平板置于避光、15°C、45%相對濕度條件下培養(yǎng)40d后，得到2589個(gè)直徑為 2-4mm的菌落，所采用的培養(yǎng)基配方為:葡萄糖30、蛋白腺10、酵母提取物10、無水硫酸儀1、 憐酸二氨鐘0.25、瓊脂18、慶大霉素2.5、水1000，P冊.0。
[0034] (2)分別轉(zhuǎn)管，進(jìn)行單菌落培養(yǎng)，60天后獲得直徑為1.5-2.5cm單菌落2371個(gè)，可作 為中國被毛抱發(fā)酵的初始菌株。試管培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖30、蛋白腺10、酵母提取物10、 無水硫酸儀1、憐酸二氨鐘0.25、瓊脂18、水1000，P冊.8。
[0035] 實(shí)