一種可實(shí)現(xiàn)三維支架循環(huán)灌流的循環(huán)灌流生物反應(yīng)器裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)、組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，是一種可實(shí)現(xiàn)組織工程三維支架內(nèi)種子細(xì)胞氧分及營養(yǎng)物質(zhì)持續(xù)供給的新裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]組織工程是結(jié)合工程學(xué)和生命科學(xué)的原理和方法，對(duì)正常和病理兩種狀態(tài)下的哺乳類動(dòng)物組織結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系進(jìn)行最基本的研究，并且開發(fā)具有生物學(xué)性能的替代品用于修復(fù)、維持或改善受損組織或器官功能的學(xué)科。其基本原理為:將正常組織細(xì)胞吸附于生物相容性良好的生物材料上形成復(fù)合物，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，細(xì)胞擴(kuò)增同時(shí)生物材料逐漸降解吸收，從而形成具有特定形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的相應(yīng)組織、器官，達(dá)到促進(jìn)組織再生、修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的。組織工程的核心是建立由細(xì)胞和生物材料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體。作為組織工程的載體，支架是組織工程研究的一個(gè)重點(diǎn)內(nèi)容，不僅提供細(xì)胞生長的三維環(huán)境和新陳代謝的場(chǎng)所，也決定新生組織器官的形狀和大小。其中，脫細(xì)胞支架因其保留完整的血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞外基質(zhì)成分而使之成為組織工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前，隨著組織工程技術(shù)和材料學(xué)的發(fā)展，一些結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的組織器官，如皮膚、血管、骨、軟骨等已可被人工構(gòu)建，為器官移植患者的治療帶來了曙光。但對(duì)于結(jié)構(gòu)及功能相對(duì)復(fù)雜的器官組織，仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。其中，大塊三維支架內(nèi)細(xì)胞氧分及營養(yǎng)物質(zhì)的持續(xù)、有效供應(yīng)是一大難題。如何實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在三維支架內(nèi)長期培養(yǎng)與功能維持是我們重點(diǎn)考慮問題。組織工程生物反應(yīng)器的出現(xiàn)為組織工程器官的構(gòu)建提供了技術(shù)支持。
[0003]在組織工程生物反應(yīng)器發(fā)展過程中，先后出現(xiàn)了平板型生物反應(yīng)器、旋轉(zhuǎn)瓶型生物反應(yīng)器、中空纖維型生物反應(yīng)器、灌流床支架型生物反應(yīng)器、種子細(xì)胞包裹/懸浮型生物反應(yīng)器等。但上述反應(yīng)器無法解決大塊三維組織模塊內(nèi)部細(xì)胞的氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)問題，其適用性較為局限，主要為細(xì)胞、微囊、微小的組織模塊等。為此，在構(gòu)建適用于大塊三維支架的生物反應(yīng)器時(shí)需要考慮到:I)灌流液可以影響到三維支架內(nèi)部深處的種子細(xì)胞；2)提供模擬體內(nèi)生理?xiàng)l件的持續(xù)灌流;3)提供模擬體內(nèi)生理環(huán)境下的生物、力學(xué)環(huán)境和充足的營養(yǎng)交換。通過調(diào)控灌流速度，以及壓力負(fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)的支持下實(shí)現(xiàn)支架內(nèi)灌流液的持續(xù)循環(huán)灌注。
[0004]本發(fā)明基于已有循環(huán)灌流生物反應(yīng)器基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，為體外培養(yǎng)組織工程器官提供一種簡(jiǎn)便循環(huán)灌流裝置，為三維條件下干細(xì)胞分化和細(xì)胞生長的研究提供技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對(duì)目前組織工程三維支架內(nèi)細(xì)胞因氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)的供養(yǎng)不足而不能長期存活、活率低等問題而提出，公開了一種循環(huán)灌流生物反應(yīng)器裝置，為三維支架內(nèi)細(xì)胞提供持續(xù)的營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，為三維條件下干細(xì)胞分化和細(xì)胞生長的研究提供技術(shù)支持，克服現(xiàn)有靜態(tài)培養(yǎng)的缺陷，構(gòu)建有功能活性的組織工程器官。從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在三維支架內(nèi)的長期培養(yǎng)和功能維持，實(shí)現(xiàn)組織工程器官的構(gòu)建，并在保證細(xì)胞活性的情況下實(shí)現(xiàn)再細(xì)胞化支架在體外的長期培養(yǎng)。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
[0007]本發(fā)明公開了一種循環(huán)灌流生物反應(yīng)器裝置，裝置包括生物反應(yīng)器和灌流裝置、灌流裝置包括蠕動(dòng)栗和設(shè)置于蠕動(dòng)栗上的管道系統(tǒng)，生物反應(yīng)器包括無菌培養(yǎng)室和密閉吻合蓋。生物反應(yīng)器內(nèi)可連接三維支架，可滿足其內(nèi)三維支架所需培養(yǎng)空間，避免培養(yǎng)液的大量浪費(fèi)，方便對(duì)無菌室內(nèi)三維支架進(jìn)行操作，無菌培養(yǎng)室儲(chǔ)存培養(yǎng)液及放置三維支架，蠕動(dòng)栗可通過設(shè)置灌流模式、灌流速度、灌流量等來調(diào)節(jié)控制，適應(yīng)不同的研究需求與組織構(gòu)建需求。
[0008]作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的生物反應(yīng)器的側(cè)壁上開設(shè)有反應(yīng)器上液體輸入端，密閉吻合蓋上開設(shè)有反應(yīng)器上液體輸入端和氣體進(jìn)口，反應(yīng)器上液體輸出端置于無菌培養(yǎng)室內(nèi)的液平面以下。
[0009]作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的管道系統(tǒng)為硅膠管樣結(jié)構(gòu)，包括硅膠流入段和硅膠流出段，硅膠流入段上的管道系統(tǒng)入口端與反應(yīng)器上液體輸出端相連，硅膠流出段上的管道系統(tǒng)出口端與反應(yīng)器上液體輸入端相連。從而使之形成一個(gè)密閉的循環(huán)灌流生物反應(yīng)器裝置；
[0010]作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的氣體進(jìn)口上連接有氣體過濾器。氣體過濾器可以保證反應(yīng)器外進(jìn)入無菌培養(yǎng)室內(nèi)的氧氣、二氧化碳等氣體無菌，以保證無菌培養(yǎng)室內(nèi)的無菌狀態(tài)，同時(shí)滿足培養(yǎng)液充足氣體供養(yǎng)。
[0011]作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的反應(yīng)器上液體輸入端與反應(yīng)器上液體輸出端為可拆卸置換的獨(dú)立管狀樣結(jié)構(gòu)。該設(shè)計(jì)可避免密閉吻合蓋過于繁重，同時(shí)其與生物反應(yīng)器的吻合性好，可保證整個(gè)反應(yīng)器系統(tǒng)的密閉性。
[0012]作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的密閉吻合蓋與無菌培養(yǎng)室體部吻合處設(shè)置為磨砂。保證反應(yīng)器裝置的密閉性。
[0013]作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的反應(yīng)器上液體輸入端兩端細(xì)小，分別與硅膠管及套管針相連，中間直徑增大，呈現(xiàn)滴壺樣結(jié)構(gòu)，所述的反應(yīng)器上液體輸入端與反應(yīng)器側(cè)壁呈70-80°夾角。而非垂直進(jìn)入，一方面該設(shè)計(jì)可使硅膠管道系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生的氣體位于輸入端管內(nèi)液平面以上，從而有效避免硅膠管道系統(tǒng)內(nèi)氣泡進(jìn)入支架內(nèi)。另一方面，可使三維支架的流入口與側(cè)壁上的液體輸入端順勢(shì)相連，而不引起支架的扯拉變形。
[0014]作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的生物反應(yīng)器由透明樣材料或者一次性無菌材料制成。所述的透明樣材料耐熱、耐高溫，可耐受120-200度的高壓蒸汽滅菌，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)器裝置的反復(fù)多次使用，且容器的透明設(shè)計(jì)可更方便進(jìn)行觀察。所述的一次性無菌材料為透明、無毒、性能穩(wěn)定的一次性材料，其使用方便、高效、避免交叉污染，在細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境下不會(huì)釋放毒性物質(zhì)影響細(xì)胞生長，容器的透明樣設(shè)計(jì)同樣可方便觀察。
[0015]作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的透明樣材料為透明樣硼娃玻璃或石英玻璃。
[0016]作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的管道系統(tǒng)為可耐受120-200度的高壓蒸汽滅菌的娃膠管。娃膠管耐高溫、性能穩(wěn)定。
[0017]本發(fā)明與已存在的肝組織工程生物反應(yīng)器相比具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):
[0018]第一，生物反應(yīng)器無菌培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)液經(jīng)反應(yīng)器的液體輸出端進(jìn)入密閉管道系統(tǒng)，在蠕動(dòng)栗的控制下，經(jīng)反應(yīng)器液體輸入端，再次流進(jìn)三維支架內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)液在整個(gè)三維支架內(nèi)的完全循環(huán)，為支架內(nèi)細(xì)胞提供有效的營養(yǎng)供給、氣體交換，提高支架內(nèi)部細(xì)胞的存活率，以及三維支架再細(xì)胞化效率，另外，蠕動(dòng)栗的脈動(dòng)刺激，模擬體內(nèi)血流。
[0019]第二，反應(yīng)器上設(shè)有氣體進(jìn)口，其上置有氣體過濾器，可以保證反應(yīng)器外進(jìn)入無菌培養(yǎng)室內(nèi)的氧氣、二氧化碳等氣體無菌，以滿足培養(yǎng)液充足氣體供養(yǎng)。
[0020]第三，反應(yīng)器上液體輸入端借鑒一次性輸液管“莫非氏滴管”的設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)成兩端細(xì)小，分別與硅膠管及套管針相連，中間直徑增大，呈現(xiàn)滴壺樣結(jié)構(gòu)。所述液體輸入端與反應(yīng)器側(cè)壁呈一70-80°夾角，而非垂直進(jìn)入，該設(shè)計(jì)一方面可使硅膠管道系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生的氣體位于輸入端管內(nèi)液平面以上，從而有效避免硅膠管道系統(tǒng)內(nèi)氣泡進(jìn)入支架內(nèi)。另一方面，該設(shè)計(jì)可使三維支架與與側(cè)壁上的液體輸入端順勢(shì)相連，而不引起支架的扯拉變形。
[0021]第四，整個(gè)灌流系統(tǒng)簡(jiǎn)單，操作方便，通過調(diào)節(jié)、設(shè)置蠕動(dòng)栗上的灌流模式、灌流速度、灌流壓力等即可控制支架內(nèi)的培養(yǎng)液灌流。
【附圖說明】
[0022]圖1為體外循環(huán)灌流生物反應(yīng)器裝置的原理結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖；
[0023]圖中，I為生物反應(yīng)器，2為灌流裝置，3為無菌培養(yǎng)室，4為管道系統(tǒng)，5為反應(yīng)器上液體輸入端，6為反應(yīng)器上液體輸出端，7為氣體進(jìn)口，8管道系統(tǒng)入口端，9為管道系統(tǒng)出口端，1為氣體過濾器，11為密閉吻合蓋。
【具體實(shí)施方式】
[0024]圖1為體外循環(huán)灌流生物反應(yīng)器裝置的原理結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖；本發(fā)明公開了一種循環(huán)灌流生物反應(yīng)器裝置，裝置包括生物反應(yīng)器I和灌流裝置2，灌流裝置2包括蠕動(dòng)栗和設(shè)置于蠕動(dòng)栗上的管道系統(tǒng)4，生物反應(yīng)器I包括無菌培養(yǎng)室3和密閉吻合蓋U。生物反應(yīng)器I的側(cè)壁上開設(shè)有反應(yīng)器上液體輸入端5，密閉吻合蓋11上開設(shè)有反應(yīng)器上液體輸入端5和氣體進(jìn)口
7。管道系統(tǒng)4為硅膠管樣結(jié)構(gòu)，包括硅膠流入段和硅膠流出段，硅膠流入段上的管道系統(tǒng)入口端8與反應(yīng)器上液體輸出端6相連，硅膠流出段上的管道系統(tǒng)出口端9與反應(yīng)器上液體輸入端5相連，氣體進(jìn)口 7上連接有氣體過濾器10，反應(yīng)器上液體輸入端5與反應(yīng)器上液體輸出端6為可拆卸置換的獨(dú)立管狀樣結(jié)構(gòu)，密閉吻合蓋11與無菌培養(yǎng)室3體部吻合處設(shè)置為磨砂，反應(yīng)器上液體輸入端5兩端細(xì)小，分別與硅膠管及套管針相連，中間直徑增大，呈現(xiàn)滴壺樣結(jié)構(gòu)，所述的反應(yīng)器上液體輸入端5與反應(yīng)器側(cè)壁呈70-80°夾角，生物反應(yīng)器I由透明樣材料或者一次性無菌材料制成，透明樣材料為透明樣硼硅玻璃或石英玻璃，管道系統(tǒng)4為可耐受120-200度的高壓蒸汽滅菌的硅膠管，一次性無菌材料透明、無毒、性能穩(wěn)定，在細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境性不會(huì)釋放毒性物質(zhì)。
[0025]本發(fā)明公開的循環(huán)灌流生物反應(yīng)器I系統(tǒng)模擬體內(nèi)血流情