利用通用報(bào)告物的數(shù)字測(cè)定的制作方法
【專利說(shuō)明】利用通用報(bào)告物的數(shù)字測(cè)定
[0001] 對(duì)優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 根據(jù)35 U.S.C.§119(e)，本申請(qǐng)要求2013年3月15日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序 列號(hào)61/789,703以及2013年8月12日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/864,792的權(quán)益。 這兩個(gè)優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容為了所有目的通過(guò)引用并入本文。
[0003] 對(duì)其他材料的交叉引用
[0004] 本申請(qǐng)為了所有目的通過(guò)引用并入下列材料的全部?jī)?nèi)容:2006年5月9日發(fā)布的美 國(guó)專利號(hào)7,041,481;2010年7月8日公布的美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2010/0173394 A1;2011年9 月8日公布的美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2011/0217712 Al;2012年6月21日公布的美國(guó)專利申請(qǐng) 公布號(hào)2012/0152369 Al;2013年2月14日公布的美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2013/0040841 A1; 2012年8月23日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/692,635;2013年8月22日提交的美國(guó)專 利申請(qǐng)序列號(hào)13/973，940; 2013年12月6日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)14/099,750 ;2014年 2月13日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)14/171，754; 2014年2月3日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序列 號(hào) 14/171,761;以及Joseph R.Lakowicz,PRINCIPLES OF FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(第 二版，1999)。
[0005] 盟直
[0006] 測(cè)定通常依靠檢測(cè)樣品中分析物的單獨(dú)拷貝的存在或活性的能力。在示例性 數(shù)字測(cè)定中，樣品被分離為體積基本相等的一組分區(qū)，每個(gè)分區(qū)包含平均小于約一個(gè)拷貝 的分析物。如果分析物的拷貝隨機(jī)分布在分區(qū)之間，某些分區(qū)將不包含拷貝，其他分區(qū)僅包 含一個(gè)拷貝，并且，如果分區(qū)的數(shù)量足夠大，又其他分區(qū)將包含兩個(gè)拷貝、三個(gè)拷貝和甚至 更多數(shù)量的拷貝?；诜謪^(qū)中分析物的給定平均濃度在一個(gè)分區(qū)中實(shí)際發(fā)現(xiàn)〇個(gè)、1個(gè)、2個(gè)、 3個(gè)或更多拷貝的概率，通過(guò)泊松分布來(lái)描述。相反，分區(qū)中分析物的濃度(并因此樣品中的 濃度)可以從發(fā)現(xiàn)一個(gè)分區(qū)中給定數(shù)量的拷貝的概率來(lái)估算。
[0007] 沒(méi)有發(fā)現(xiàn)拷貝和發(fā)現(xiàn)一個(gè)或更多個(gè)拷貝的概率的估值可以在數(shù)字測(cè)定中測(cè)量?？?以檢驗(yàn)每個(gè)分區(qū)以確定該分區(qū)是包含分析物的至少一個(gè)拷貝的陽(yáng)性分區(qū)，或是不包含分析 物的拷貝的陰性分區(qū)。分區(qū)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)拷貝的概率可以通過(guò)為陰性的被檢驗(yàn)分區(qū)的分?jǐn)?shù)來(lái) 估計(jì)（"陰性分?jǐn)?shù)"），以及發(fā)現(xiàn)至少一個(gè)拷貝的概率通過(guò)為陽(yáng)性的被檢驗(yàn)分區(qū)的分?jǐn)?shù)來(lái)估計(jì) ("陽(yáng)性分?jǐn)?shù)"）。陽(yáng)性分?jǐn)?shù)或陰性分?jǐn)?shù)隨后可以用于確定分區(qū)中的分析物的濃度，諸如以泊 松統(tǒng)計(jì)。
[0008] 數(shù)字測(cè)定往往依賴分區(qū)中核酸靶的擴(kuò)增以使得能夠檢測(cè)分析物的單個(gè)拷貝。擴(kuò)增 可以經(jīng)由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來(lái)進(jìn)行以實(shí)現(xiàn)數(shù)字PCR測(cè)定。靶的擴(kuò)增可以從包含在反應(yīng)中 的熒光探針進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)。具體地，探針可以包括熒光團(tuán)，其提供指示靶是否已被擴(kuò)增的熒 光信號(hào)。
[0009] 數(shù)字PCR測(cè)定可以被多重化以允許在相同組的分區(qū)中檢測(cè)兩個(gè)或更多個(gè)不同靶的 存在。靶的擴(kuò)增可以通過(guò)利用靶特異性的探針來(lái)區(qū)分。不過(guò)，此類探針可能是昂貴的，并且 可能需要定制合成，這進(jìn)一步增加了成本。
[0010]
[0011] 本公開(kāi)內(nèi)容提供用于測(cè)定一組分區(qū)中的一個(gè)或更多個(gè)靶的數(shù)字測(cè)定系統(tǒng)，包括方 法、設(shè)備和組合物，所述分區(qū)包含靶擴(kuò)增的通用報(bào)告物。
[0012] 附圖簡(jiǎn)述
[0013] 圖1是根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的各方面，執(zhí)行相同組分區(qū)中的至少兩個(gè)靶的多重?cái)?shù)字測(cè) 定的示例性方法的流程圖，每個(gè)分區(qū)包含用于靶的引物和擴(kuò)增的通用報(bào)告物。
[0014]圖2是根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的各方面，經(jīng)配置以執(zhí)行圖1的方法的選定方面的示例性系 統(tǒng)。
[0015] 圖3是根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的各方面，示出經(jīng)執(zhí)行以測(cè)定包含通用報(bào)告物的分區(qū)中的 一對(duì)靶(靶A和B)的圖1方法的選擇的示例性方面的示意圖，用于擴(kuò)增分區(qū)中的靶和用通用 報(bào)告物檢測(cè)的策略在可從其形成分區(qū)的示例性整體相(bulk phase)中展示(擴(kuò)增箭頭和擴(kuò) 增子以虛線示出）。
[0016] 圖4是根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的各方面的示例性數(shù)據(jù)的圖，該數(shù)據(jù)包括可以從對(duì)如圖3中 的靶A和B的測(cè)定的不同組的分區(qū)（通道1-5)中收集的熒光幅值(例如，熒光強(qiáng)度（int..))， 每個(gè)組中存在靶B引物(Fb和Rb)的不同濃度，并且在該圖中標(biāo)識(shí)了每個(gè)條帶的分區(qū)。
[0017]圖5是根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的各方面的分區(qū)中的擴(kuò)增子大小與從該分區(qū)測(cè)量的熒光強(qiáng) 度（int.)之間的示例性關(guān)系的圖。
[0018] 圖6是根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的各方面的示例性數(shù)據(jù)的圖，該數(shù)據(jù)包括可以從如對(duì)圖3中 的靶A和B的測(cè)定的不同組的分區(qū)(通道1-5)中收集的熒光幅值(例如，熒光強(qiáng)度），生成對(duì)每 個(gè)組中的靶B的不同擴(kuò)增子大小，并且在該圖中標(biāo)識(shí)了每個(gè)條帶的分區(qū)。
[0019] 圖7是根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的各方面的對(duì)如在圖4中收集和呈現(xiàn)的示例性數(shù)據(jù)的圖，但 是極大數(shù)量的分區(qū)對(duì)兩個(gè)靶是陽(yáng)性的。
[0020] 圖8是根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的各方面，示出經(jīng)執(zhí)行以測(cè)定具有相同通用報(bào)告物的分區(qū) 中的一對(duì)靶(祀A和B)的圖1的方法的選擇的示例性方面的另一示意圖，該圖基本如圖3所示 構(gòu)建，并且示出了使用具有不同解鏈溫度的引物以生成該靶對(duì)的相同長(zhǎng)度的擴(kuò)增子，但是 以不同的效率產(chǎn)生不同的擴(kuò)增子產(chǎn)量。
[0021] 圖9是根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的各方面示例性數(shù)據(jù)的圖，該數(shù)據(jù)包括可以從根據(jù)圖8的相 同反應(yīng)混合物形成的不同組的分區(qū)（通道1-5)中收集的熒光幅值，靶的擴(kuò)增單一退火溫度 下在孔中執(zhí)行，該孔包含優(yōu)化到這一退火溫度的引物組以及未優(yōu)化到這一退火溫度但是仍 然能夠以較低的效率擴(kuò)增的一個(gè)引物組，且圖中的每個(gè)條帶的分區(qū)根據(jù)靶含量標(biāo)識(shí)。
[0022]圖10是大體根據(jù)在圖4和7中描述的策略，從液滴收集的熒光幅值數(shù)據(jù)的曲線圖。 [0023]圖11是大體根據(jù)在圖5和6中描述的策略，從液滴收集的熒光幅值數(shù)據(jù)的曲線圖。 [0024]圖12是大體根據(jù)在圖8和9中描述的策略，從液滴收集的熒光幅值數(shù)據(jù)的曲線圖。
[0025] 圖13A到13D是根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的各方面，在擴(kuò)增液滴的β-葡糖醛酸酶(GUSB)靶的 剪接形式和未剪接形式后，在來(lái)自包含樣品(分別是Α到D)的不同稀釋度的液滴的一對(duì)波長(zhǎng) 方案（通道1和通道2)中收集的擴(kuò)增數(shù)據(jù)的散點(diǎn)圖，每個(gè)液滴包含相同的通用報(bào)告物（ EvaGreen?染料），并且液滴的每個(gè)簇根據(jù)靶含量來(lái)標(biāo)識(shí)(分別是剪接/未剪接）。
[0026] 圖14是根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的各方面，從圖13A到13D(樣品A到D)的數(shù)據(jù)計(jì)算的GUSB靶 的剪接形式和未剪接形式的濃度以及每個(gè)樣品的計(jì)算的靶濃度的比率(剪接:未剪接）的 圖。
[0027] 圖15是根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的各方面，從在具有通用報(bào)告物的液滴中執(zhí)行的三個(gè)不同 的靶基因（cDNA)測(cè)定收集的擴(kuò)增數(shù)據(jù)的圖，每個(gè)靶基因（cDNA)測(cè)定檢測(cè)來(lái)自靶基因的不同 剪接形式的 cDNA(CAMTAl、TPM3或ABUM1)。
[0028] 圖16是根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的各方面，通過(guò)在來(lái)自圖15的靶基因測(cè)定的液滴中生成的 擴(kuò)增子的毛細(xì)管電泳獲得的擴(kuò)增數(shù)據(jù)的曲線圖。
[0029]圖17是根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的各方面，使用來(lái)自如在圖15中執(zhí)行的ABLIM1測(cè)定的擴(kuò)增 數(shù)據(jù)，在包含通用報(bào)告物和測(cè)定的腦RNA樣品的不同的濃度的液滴中對(duì)長(zhǎng)的選擇性剪接形 式的和短的選擇性剪接形式的ABUM1 cDNA計(jì)算的濃度的圖解。
[0030] 圖18是根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的各方面，從在具有通用報(bào)告物的液滴中執(zhí)行的三種不同 的選擇性剪接測(cè)定(ABLIM1、TPM3和CAMTA1)收集的擴(kuò)增數(shù)據(jù)的一系列散點(diǎn)圖，每種不同的 剪接測(cè)定使用從三種不同組織源(腦、心臟和骨骼肌)獲得的RNA/cDNA，并且每個(gè)曲線中的 液滴的每個(gè)簇根據(jù)選擇性剪接的靶的靶含量(短形式(S)/長(zhǎng)形式(L))來(lái)標(biāo)識(shí)。
[0031] 圖19是根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的各方面，從在具有通用報(bào)告物和從多種指示的組織源之 一獲得的RNA/cDNA的液滴中進(jìn)行的三種不同選擇性剪接測(cè)定(ABUM1、CAMTA1和TPM3)計(jì)算 的濃度數(shù)據(jù)(長(zhǎng)形式(L)百分比）的圖解。
[0032] 圖20是根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的各方面，示出可以從包含通用報(bào)告物的分區(qū)獲得的擴(kuò)增 數(shù)據(jù)的示意圖，隨著時(shí)間推移出現(xiàn)陽(yáng)性分區(qū)的檢測(cè)的信號(hào)幅值的衰減（左側(cè)），或通過(guò)熱調(diào) 節(jié)穩(wěn)定的信號(hào)幅值(右側(cè)）。
[0033] 圖21是根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的各方面，示出可以從通過(guò)通用報(bào)告物進(jìn)行的三種不同的 靶(A、B和C)的單重測(cè)定和多重測(cè)定獲得的擴(kuò)增數(shù)據(jù)的示意圖，對(duì)于每個(gè)靶的擴(kuò)增策略在對(duì) 應(yīng)的數(shù)據(jù)部分的上方示意性地示出。
[0034] 圖22是根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的各方面，對(duì)從模板和各種引物二聚體擴(kuò)增的靶的示意性 比較，該引物二聚體可以與僅通過(guò)一個(gè)靶和通用報(bào)告物執(zhí)行的圖1的數(shù)字測(cè)定中的靶區(qū)分 開(kāi)。
[0035]圖23是根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的各方面，可以在具有圖22中的引物和模板的數(shù)字測(cè)定中 收集的示例性發(fā)光數(shù)據(jù)的曲線圖，至少一個(gè)副產(chǎn)物（引物二聚體）只在液滴的子集（陰性靶 液滴)中被擴(kuò)增。
[0036] 登述
[0037] 本公開(kāi)內(nèi)容提供用于測(cè)定一組分區(qū)中的一個(gè)或更多個(gè)靶的數(shù)字測(cè)定系統(tǒng)，包括方 法、設(shè)備和組合物，所述分區(qū)包括靶擴(kuò)增的通用報(bào)告物。
[0038] 提供一種執(zhí)行數(shù)字測(cè)定的示例性方法。在該方法中，可以形成分區(qū)，每個(gè)分區(qū)包括 相同混合物的一部分?；旌衔锟梢园谝话泻偷诙?，并且還可以包含對(duì)任一靶的擴(kuò)增 靈敏的通用報(bào)告物。只有一個(gè)子集的分區(qū)各自可以包含第一靶的至少一個(gè)拷貝，以及只有 一個(gè)不同子集的分區(qū)各自可以包含第二靶的至少一個(gè)拷貝。第一靶和第二靶可以在分區(qū)中 擴(kuò)增。擴(kuò)增數(shù)據(jù)可以從用于多個(gè)分區(qū)的通用報(bào)告物收集。分區(qū)中第一靶的擴(kuò)增可以與第二 靶的擴(kuò)增區(qū)分開(kāi)?？梢源_定每個(gè)靶的水平。
[0039] 提供執(zhí)行數(shù)字測(cè)定的另一種示例性方法。在該方法中，可以形成分區(qū)，每個(gè)分區(qū)包 括相同混合物的一部分?；旌衔锟梢园胁⑶疫€可以包含對(duì)靶的擴(kuò)增靈敏的通用報(bào)告 物。只有一個(gè)子集的分區(qū)各自可以包含靶的至少一個(gè)拷貝。靶和至少一種副產(chǎn)物可以在分 區(qū)中擴(kuò)增。擴(kuò)增數(shù)據(jù)可以從用于多個(gè)分區(qū)的通用報(bào)告物收集。靶和副產(chǎn)物在分區(qū)中的擴(kuò)增 可以在數(shù)據(jù)中彼此區(qū)分開(kāi)，或靶和副產(chǎn)物在分區(qū)中的擴(kuò)增都不可以在數(shù)據(jù)中彼此區(qū)分開(kāi)。 可以確定靶的水平。
[0040] 提供執(zhí)行數(shù)字測(cè)定的又一種示例性方法。在該方法中，可以形成分區(qū)，每個(gè)分區(qū)包 括相同混合物的一部分?；旌衔锟梢园幸约皩?duì)靶的擴(kuò)增靈敏的通用報(bào)告物。只有一個(gè) 子集的分區(qū)各自可以包含靶的至少一個(gè)拷貝。分區(qū)可以經(jīng)熱循環(huán)以擴(kuò)增靶。來(lái)自熱循環(huán)的 分區(qū)的待檢測(cè)的信號(hào)可以通過(guò)將分區(qū)冷卻到室溫以下、將分區(qū)加熱到80攝氏度以上并將分 區(qū)再次冷卻到室溫以下來(lái)穩(wěn)定?？梢詮挠糜诙鄠€(gè)分區(qū)的通用報(bào)告物收集擴(kuò)增數(shù)據(jù)?？梢源_ 定革G的水平。
[0041] 提供執(zhí)行多重?cái)?shù)字測(cè)定的又另一種方法。在該方法中，可以選擇引物及其濃度用 于第一和第二靶的擴(kuò)增，以生成可用通用報(bào)告物區(qū)分開(kāi)的對(duì)應(yīng)的第一和第二擴(kuò)增子?？梢?形成分區(qū)，每個(gè)分區(qū)包含通用報(bào)告物和在選擇的濃度的引物。用于每個(gè)靶的模板可以局部 占有存在于分區(qū)中。第一靶和第二靶可以在分區(qū)中擴(kuò)增。由通用報(bào)告物發(fā)射的光可以從單 個(gè)分區(qū)檢測(cè)。每個(gè)靶的水平可以基于檢測(cè)的光來(lái)確定。
[0042] 提供用于執(zhí)行多重測(cè)定的組合物。組合物可以包含多個(gè)液滴，每個(gè)液滴包含足以 擴(kuò)增第一靶和第二靶的擴(kuò)增試劑，并且還包含對(duì)任一靶的擴(kuò)增靈敏的通用報(bào)告物。只有液 滴的子集各自可以包含第一靶的至少一個(gè)拷貝，以及只有液滴的不同子集各自可以包含第 二靶的至少一個(gè)拷貝。連續(xù)相可以圍繞每個(gè)液滴。
[0043] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是在生物醫(yī)學(xué)研究、臨床診斷和法醫(yī)學(xué)等等中普遍存在的 技術(shù)。受過(guò)技術(shù)訓(xùn)練的人員熟悉各種形式的多重PCR，包括端點(diǎn)多重PCR、多重基于探針的定 量PCR和基于SYBR?染料的多重化。這些方法中的每種方法有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。端點(diǎn)PCR可以 支持高水平的多重化，但是通常需要消耗時(shí)間的凝膠電泳以檢測(cè)擴(kuò)增的產(chǎn)物。多重基于探 針的定量PCR是動(dòng)力學(xué)（"實(shí)時(shí)"）測(cè)定，該測(cè)定不像端點(diǎn)PCR，不需要PCR后的處理用于檢測(cè)， 但是擴(kuò)增子檢測(cè)受儀器性能限制?？缮藤?gòu)的實(shí)時(shí)PCR儀器可以支持使用多達(dá)四個(gè)熒光團(tuán)并 因此支持使用四個(gè)探針，多重化受四個(gè)擴(kuò)增子限制（每個(gè)探針一個(gè)擴(kuò)增子）。最后，基于 SYBR?染料的多重化是便宜的，因?yàn)樗恍枰獦?biāo)記的探針并且較不耗時(shí)。不過(guò)，該方法依 賴熔融曲線分析來(lái)檢測(cè)各種PCR產(chǎn)物，并且不允許產(chǎn)物的直接定量。而且，熔融曲線分析可 能不具有區(qū)分具有類似解鏈溫度的擴(kuò)增子的分辨率。目前沒(méi)有方法可用于僅使用DNA嵌入 染料作為擴(kuò)增報(bào)告物直接檢測(cè)和定量在單管中擴(kuò)增的多個(gè)DNA靶。
[0044] 本公開(kāi)內(nèi)容提供用于分區(qū)諸如乳滴中的多重PCR以及用DNA嵌入染料對(duì)其檢測(cè)的 新穎方法。該方法包括多個(gè)DNA靶的擴(kuò)增、檢測(cè)和定量。靶擴(kuò)增可以在具有DNA嵌入染料例如 EvaGreen?染料以及若干引物對(duì)諸如用于每個(gè)靶的一引物對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)PCR混合物中完成?？?以以操縱每個(gè)靶的擴(kuò)增子產(chǎn)率的方式將不同濃度的引物對(duì)組合在各種混合物中?；诋a(chǎn) 率，擴(kuò)增的產(chǎn)物可以根據(jù)從嵌入染料檢測(cè)到的信號(hào)幅值被區(qū)分開(kāi)。
[0045] 該策略的要素可以是通過(guò)改變引物濃度操縱熒光輸出的能力。引物濃度直接影響 產(chǎn)率并且間接影響擴(kuò)增子結(jié)合的染料的熒光。用于多重反應(yīng)中每個(gè)靶的引物濃度可以進(jìn)行 調(diào)節(jié)以對(duì)多個(gè)擴(kuò)增的靶中的每個(gè)產(chǎn)生不同信號(hào)幅值。擴(kuò)增的靶可以通過(guò)數(shù)據(jù)中的相應(yīng)的擴(kuò) 增簇的位置來(lái)標(biāo)識(shí)和通過(guò)在每個(gè)簇中存在的分區(qū)的數(shù)量來(lái)定量。
[0046] 本文公開(kāi)的方法可以允許只使用DNA結(jié)合染料作為報(bào)告物檢測(cè)和定量在單孔中擴(kuò) 增的相同或不同大小的多個(gè)擴(kuò)增子。這種方法比常規(guī)的端點(diǎn)PCR多重化具有優(yōu)點(diǎn)。例如，該 方法節(jié)約時(shí)間：不需要PCR產(chǎn)物的進(jìn)一步處理，例如凝膠電泳和成像以檢測(cè)擴(kuò)增子?？蛇x地 或另外地，該方法可以提供擴(kuò)增子大小的獨(dú)立性:類似(例如，相等)或不同長(zhǎng)度的擴(kuò)增子可 以從相同的多重反應(yīng)檢測(cè)到。與之相比，類似長(zhǎng)度的擴(kuò)增子通常不能被凝膠電泳分辨，限制 了在常規(guī)端點(diǎn)PCR中多重化類似大小擴(kuò)增子的能力。本文公開(kāi)的方法不同于多重基于探針 的定量PCR，因?yàn)樵摲椒梢圆皇褂眯蛄刑禺愋蕴结榿?lái)執(zhí)行，序列特異性探針比嵌入染料明 顯更貴。本文公開(kāi)的方法不同于使用實(shí)時(shí)儀器的基于SYBR?染料的多重話。例如，擴(kuò)增子 可以在沒(méi)有熔融曲線分析的情況下區(qū)分開(kāi)。
[0047]本公開(kāi)內(nèi)容的進(jìn)一步方面在下列章節(jié)中展示：（1)以通用報(bào)告物的多重?cái)?shù)字測(cè)定 的綜述以及(II)實(shí)施例。
[0048] I.以通用報(bào)告物的多重?cái)?shù)字測(cè)定的綜述
[0049] 本節(jié)提供用通用報(bào)告物執(zhí)行的多重?cái)?shù)字測(cè)定的綜述;參見(jiàn)圖1-9。
[0050] 圖1是用通用報(bào)告物執(zhí)行多重?cái)?shù)字測(cè)定的示例性方法50的流程圖。對(duì)方法50呈現(xiàn) 的步驟可以以任何合適的順序和以任何合適的組合來(lái)執(zhí)行。此外，所述步驟可以與本公開(kāi) 內(nèi)容的任何其他合適步驟、方面和/或特征組合和/或被任何其他合適步驟、方面和/或特征 更改，所述其他合適步驟、方面和/或特征包括在上面交叉引用中列出的通過(guò)引用并入本文 的專利文獻(xiàn)中描述的那些。
[0051] 在52指示，可以選擇引物及其濃度以生成用在分區(qū)中的通用報(bào)告物可區(qū)分開(kāi)的至 少一對(duì)擴(kuò)增子。當(dāng)通用報(bào)告物結(jié)合到擴(kuò)增子時(shí)，相對(duì)于未結(jié)合或結(jié)合到單鏈核酸，通用報(bào)告 物可以更明亮地發(fā)熒光。每個(gè)擴(kuò)增子(可互換地稱為擴(kuò)增靶)可以是雙鏈的并且可以對(duì)應(yīng)于 被擴(kuò)增的不同靶。擴(kuò)增子可以在分區(qū)中彼此區(qū)分開(kāi)，因?yàn)槊總€(gè)擴(kuò)增子用不同的特征產(chǎn)率生 成(所述特征產(chǎn)率可以使用任何合適的量度，例如擴(kuò)增子的質(zhì)量、總組合長(zhǎng)度等來(lái)描述）。結(jié) 果是結(jié)合到分區(qū)中的每個(gè)擴(kuò)增子的通用報(bào)告物的特征、不同量以及從結(jié)合的報(bào)告物檢測(cè)到 的熒光的可區(qū)分幅值?？梢陨蓴U(kuò)增子對(duì)的質(zhì)量的不同產(chǎn)率，因?yàn)閿U(kuò)增子對(duì)為不同長(zhǎng)度和/ 或被復(fù)制至不同的最終拷貝數(shù)和/或質(zhì)量。
[0052] 擴(kuò)增子對(duì)可以是被擴(kuò)增到單個(gè)分區(qū)中的相同拷貝數(shù)的更長(zhǎng)擴(kuò)增子和更短擴(kuò)增子。 在這種情況下，更長(zhǎng)擴(kuò)增子通常比更短擴(kuò)增子結(jié)合更多的報(bào)告物拷貝并且給出更強(qiáng)的熒光 信號(hào)。在其他情況下，在其他事物相等的情況下，更長(zhǎng)擴(kuò)增子可以被擴(kuò)增到比更短擴(kuò)增子更 少的拷貝數(shù)。
[0053]擴(kuò)增子對(duì)可以在長(zhǎng)度方面類似或等同并