CaCl2,重懸細(xì)胞，靜置5min;離心吸出上清。
[0096] 本發(fā)明所述轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法在轉(zhuǎn)化后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選。所述篩選可以按照 本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行。
[0097]在一些實(shí)施方案中，所述篩選具體為無菌水中重懸細(xì)胞涂布SC-Leu-Ura培養(yǎng)板進(jìn) 行篩選。其中所述SC-Leu-Ura培養(yǎng)板為缺省亮氨酸和尿嘧啶的合成完全培養(yǎng)基平板。SC-Leu-Ura培養(yǎng)基具體配制方法為合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺省亮氨酸和尿嘧 啶的混合氨基酸粉末2g/L，2 %瓊脂粉。
[0098]本發(fā)明所述轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法在篩選后還可以進(jìn)一步在SC-Leu-Ura培養(yǎng)板 上對(duì)篩選獲得的單菌落進(jìn)行劃線分純。
[0099] 由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法，利用Cas9蛋白 在MAT基因座處產(chǎn)生雙鏈斷裂，外源導(dǎo)入的MAT片段對(duì)該雙鏈斷裂進(jìn)行修補(bǔ)，轉(zhuǎn)換釀酒酵母 交配型。本發(fā)明所述轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法可高效、快速轉(zhuǎn)換釀酒酵母單倍體交配型，不依 賴釀酒酵母自身染色體結(jié)構(gòu)HMLa和HMRa，無需經(jīng)過二倍體釀酒酵母階段，且無需對(duì)待轉(zhuǎn)換 釀酒酵母菌株進(jìn)行誘導(dǎo)等處理，直接獲得相反交配型釀酒酵母菌株，實(shí)驗(yàn)周期短。
[0100] 為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述。如無特殊 說明，本發(fā)明所述質(zhì)粒、載體等均可通過商業(yè)渠道購(gòu)買得到。如pTOPO平末端載體為商業(yè)載 體pCR-Blunt II-TOPO vector(Invitrogen/Life 了6。1111。1。8168,45-〇245)。卩1^426+ SNR52p-gRNA是根據(jù)商業(yè)化載體Addgene plasmid#43802改造而來。
[0101] 實(shí)施例1
[0102] 利用基于CRISPR/Cas9技術(shù)的釀酒酵母交配型轉(zhuǎn)換技術(shù)，對(duì)釀酒酵母BY4741進(jìn)行 交配型轉(zhuǎn)換，包括以下步驟：
[0103] 1、利用LiOAc轉(zhuǎn)化法將攜帶Cas9基因的質(zhì)粒pRS415+Cas9轉(zhuǎn)化入釀酒酵母菌株 BY4741中，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于SC-Leu平板上進(jìn)行篩選，30°C培養(yǎng)2天。挑取單克隆轉(zhuǎn)化子 在SC-Leu平板上劃線分純，備用。
[0104] 2、構(gòu)建靶位點(diǎn)為MATa的guide-RNA質(zhì)粒，其構(gòu)建步驟如下：
[0105] a)選擇 protospacer 為acaaaaatatttctaacaat;
[0106] b)合成弓丨物："GCAGTGAAAGATAAATGATCacaaaaatatttctaacaatGTTTTA GAGCTAGAAATAGC，，和 "GCTATTTCTAGCTCTAAAACattgttagaaatatttttgtGA TCATTTATCTTTCACTGC";
[0107] c)退火粘合兩個(gè)引物，得到雙鏈DNA;
[0108] d)利用限制性內(nèi)切酶Notl和CIP消化質(zhì)粒pRS426+SNR52p-gRNA，使之線性化；
[0109] e)利用Gibson組裝將線性化質(zhì)粒和雙鏈DNA進(jìn)行組裝；
[0110] f)將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化如DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于LB+Carb平板上，37°C培 養(yǎng) 12h;
[0111] g)挑取5個(gè)單菌落接種于5mL LB+Carb液體培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒， 進(jìn)行Sanger測(cè)序；
[0112] h)測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為 pRS426+SNR52P-gRNA.MATa。
[0113] 3、構(gòu)建ΜΑΤα表達(dá)盒質(zhì)粒，其構(gòu)建步驟如下：
[0114] a)合成引物：
[0115] MAT-amp1i fy-F：ACGATAACTGGTTGGAAAGCGTAA
[0116] MAT-amp1i fy-R：AGACTTGTGGCGAAGATGAATAGT；
[0117] b)以釀酒酵母BY4742基因組為模板，使用Thermo Scientif icPhusi〇nx高保真 DNA聚合酶進(jìn)行PCR獲得DNA片段ΜΑΤα表達(dá)盒，并進(jìn)行瓊脂糖電泳回收，目標(biāo)片段長(zhǎng)度為 3398bp；
[0118] c)利用平末端質(zhì)?？寺?，將ΜΑΤα表達(dá)盒連接到pTOPO平末端載體上，大腸桿菌DH5a 轉(zhuǎn)化后涂布于LB+Kan平板上，37°C過夜培養(yǎng)；
[0119] d)挑取3個(gè)單菌落接種于5mL LB+Carb液體培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒， 進(jìn)行Sanger測(cè)序；
[0120] e)測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為ρΤ0Ρ0+ΜΑΤα。
[0121] 4、利用限制性內(nèi)切酶Nsil對(duì)質(zhì)粒ρΤ0Ρ0+ΜΑΤα進(jìn)行消化。
[0122] 5、釀酒酵母轉(zhuǎn)化，其步驟如下：
[0123] a)挑取攜帶pRS415+Cas9質(zhì)粒的ΒΥ4741單菌落于5mL SC-Leu液體培養(yǎng)基中，30°C 過夜培養(yǎng)；
[0124] b)測(cè)量過夜培養(yǎng)的釀酒酵母培養(yǎng)液0D6QQ，接種過夜培養(yǎng)液到5mL YPD液體培養(yǎng)基 中（0 · 1250D6(x)/mL)，30°C、220rpm條件下培養(yǎng)至0D6QQ達(dá)到0 · 5(約需要3 · 5h-4.5h);
[0125] c)吸取1.5mL步驟b)得到的釀酒酵母培養(yǎng)液至1.5mL EP管內(nèi)，5000rpm離心lmin， 收集細(xì)胞；用lmL無菌水重懸細(xì)胞，同上離心，收集細(xì)胞；用lmL 0.1M LiOAc重懸細(xì)胞，同上 離心，收集細(xì)胞；用移液器吸除900yL上清，剩余的100yL LiOAc重懸細(xì)胞，置于冰上，得到感 受態(tài)細(xì)胞。
[0126] d)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化體系，其中質(zhì)粒DNA為pRS426+SNR52p-gRNA · MATa，50ng; ρΤΟΡΟ+ΜΑΤα酶 切體系，5yL，加水補(bǔ)至150yL:
[0127] 成分體積(yL) 50%PEG3350 620 1 MLiOAc 90
[0128] ssDNA(10mg/mL) 40 質(zhì)粒DNA 150
[0129] e)將lOOyL感受態(tài)細(xì)胞中加入至轉(zhuǎn)化體系中，吹吸均勻，最高速渦旋10s; 30°C培養(yǎng) 箱中孵育30min;加入90yL DMSO，渦旋震蕩10s ; 42°C熱激15min; 3600rpm離心30s，收集細(xì) 胞；吸出上請(qǐng)，加入400yL 5mM CaCl2，重懸細(xì)胞，靜置5min; 3600rpm離心30s，吸出上請(qǐng)，在 無菌水中重懸后涂布SC-Leu-Ura篩選培養(yǎng)板篩選。
[0130] 6、待酵母在篩選培養(yǎng)板上生長(zhǎng)2天，挑取單菌落于SC-Leu-Ura平板上劃線分純。
[0131 ] 7、利用酵母菌落PCR方法驗(yàn)證分純后的菌株交配型（Huxley，C.，et al .Trends Genet(1990)，6,236)，統(tǒng)計(jì)釀酒酵母菌株BY4741交配型轉(zhuǎn)換為ΜΑΤα的效率結(jié)果見圖3。隨后 挑選ΜΑΤα交配型的菌株進(jìn)行保存，命名為ΒΥ4741 -ΜΑΤα。
[0132] 結(jié)果顯示利用在對(duì)ΒΥ4741進(jìn)行交配型轉(zhuǎn)換時(shí)，分別挑選96的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行交配型的 驗(yàn)證。對(duì)照組(轉(zhuǎn)化PRS426質(zhì)粒或者轉(zhuǎn)化pRS426質(zhì)粒和ρΤΟΡΟ+ΜΑΤα酶切DNA片段)基本保持 原交配型（100%和94.79%)，并未能獲得轉(zhuǎn)換交配型的單倍體酵母菌株。對(duì)照組（轉(zhuǎn)化 pRS426+SNR52p-gRNA. MATa質(zhì)粒）中有9.38 %的菌株轉(zhuǎn)換交配型至ΜΑΤα的單倍體菌株，其余 為二倍體菌株，說明所選擇的Cas9蛋白替代了Ho蛋白的功能，在對(duì)酵母菌株MATa表達(dá)盒進(jìn) 行切割后導(dǎo)致HMLa對(duì)雙鏈斷裂進(jìn)行修復(fù)，同時(shí)轉(zhuǎn)換了酵母菌株的交配型。實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)化 pRS426+SNR52p-gRNA. MATa質(zhì)粒和ρΤΟΡΟ+ΜΑΤα酶切DNA片段)利用本發(fā)明方法對(duì)酵母菌株進(jìn) 行交配型的轉(zhuǎn)換，篩選得到的交配型轉(zhuǎn)換后的單倍體酵母菌株比例為26.04%，明顯高于對(duì) 照組，說明本發(fā)明所述方法可以有效轉(zhuǎn)換釀酒酵母交配型。
[0133] 實(shí)施例2
[0134] 利用基于CRISPR/Cas9技術(shù)的釀酒酵母交配型轉(zhuǎn)換技術(shù)，對(duì)釀酒酵母ΒΥ4742進(jìn)行 交配型轉(zhuǎn)換，包括以下步驟：
[0135] 1、利用LiOAC轉(zhuǎn)化法將攜帶Cas9基因的質(zhì)粒pRS415+Cas9轉(zhuǎn)化入釀酒酵母菌株 BY4742中，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于SC-Leu平板上進(jìn)行篩選，30°C培養(yǎng)2天。挑取單克隆轉(zhuǎn)化子 在SC-Leu平板上劃線分純，備用。
[0136] 2、構(gòu)建靶位點(diǎn)為ΜΑΤα的guide-RNA質(zhì)粒，其構(gòu)建步驟如下：
[0137] a)izfei$protospacer^caaatcatacagaaacacag；
[0138] b)合成引物：
[0139] "GCAGTGAAAGATAAATGATCcaaatcatacagaaacacagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC'，和
[0140] "GCTATTTCTAGCTCTAAAACctgtgtttctgtatgatttgGATCATTTATCTTTCACTGC";
[0141] c)退火粘合兩個(gè)引物，得到雙鏈DNA;
[0142] d)利用限制性內(nèi)切酶Notl和CIP消化質(zhì)粒pRS426+SNR52p-gRNA，使之線性化；
[0143] e)利用Gibson組裝將線性化質(zhì)粒和雙鏈DNA進(jìn)行組裝；
[0144] f)將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化如DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于LB+Carb平板上，37°C培