一種轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法，尤其是涉及 一種快速轉(zhuǎn)換釀酒酵母交配型的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又稱面包酵母或出芽酵母。釀酒酵母是 與人類關(guān)系最廣泛的一種酵母，不僅因?yàn)閭鹘y(tǒng)上它用于制作面包和饅頭等食品及釀酒，在 現(xiàn)代分子和細(xì)胞生物學(xué)中用作真核模式生物，其作用相當(dāng)于原核的模式生物大腸桿菌。釀 酒酵母具有單倍體和雙倍體兩種常見生活方式。單倍體的生活史較簡單，通過有絲分裂繁 殖。在環(huán)境壓力較大時(shí)通常則死亡。二倍體細(xì)胞(酵母的優(yōu)勢形態(tài))也通過簡單的有絲分裂 繁殖，但在外界條件不佳時(shí)能進(jìn)入減數(shù)分裂，生成一系列單倍體的孢子。單倍體可以交配， 重新形成二倍體。它們之間的轉(zhuǎn)換可通過交配（單倍體孢子融合產(chǎn)生雙倍體）和孢子形成 (雙倍體減數(shù)分裂產(chǎn)生單倍體孢子)來實(shí)現(xiàn)，而這些變化的發(fā)生則是由菌株的交配型所決 定。釀酒酵母的交配型是由位于酵母染色體m上MAT基因座控制的，MAT基因座包括兩個(gè)等 位基因 MATa和ΜΑΤα，因此將釀酒酵母單倍體菌株的交配型(mating-type)分為兩種:MATa和 ΜΑΤα。
[0003] 釀酒酵母MATa和MATa兩種交配型的轉(zhuǎn)換主要由Η0基因的產(chǎn)物引起的。Η0基因在自 身啟動子作用下表達(dá)Ho蛋白，該蛋白會在MAT基因座處產(chǎn)生雙鏈斷裂，激活ΙΠ 號染色體兩端 的沉默的HMLa或者HMRa基因座將自身的Υα或者Ya序列復(fù)制至MAT基因座處修補(bǔ)雙鏈斷裂。 在此過程中，釀酒酵母菌株的交配型發(fā)生了轉(zhuǎn)換(圖1)。
[0004] 大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室菌株的H0基因己積累了很多突變或者進(jìn)行了基因失活處理，故不能 自發(fā)的發(fā)生交配型的轉(zhuǎn)換過程，而交配型的相互轉(zhuǎn)化卻是酵母研究的重要手段。
[0005] 交配型轉(zhuǎn)換的傳統(tǒng)方法為將載有H0基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到這些細(xì)胞中，誘使這些細(xì)胞 發(fā)生交配型的轉(zhuǎn)換。不過利用H0基因誘導(dǎo)釀酒酵母細(xì)胞交配型的轉(zhuǎn)換后，異種交配型細(xì)胞 會立刻相互接觸從而產(chǎn)生二倍體細(xì)胞，因此還需要進(jìn)行生孢實(shí)驗(yàn)來獲得單倍體菌株，實(shí)驗(yàn) 周期較長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的問題提供一種快速轉(zhuǎn)換釀酒酵母交 配型的方法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 一種轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法，利用Cas9蛋白在MAT基因座處產(chǎn)生雙鏈斷裂，外源導(dǎo) 入的MAT片段對該雙鏈斷裂進(jìn)行修補(bǔ)，轉(zhuǎn)換釀酒酵母交配型。
[0009] 其中，本發(fā)明所述轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法具體操作為將釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞與轉(zhuǎn) 化體系混合進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化，然后篩選，分純；其中所述釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞為包含PRS415+ Cas9質(zhì)粒的釀酒酵母菌株，所述轉(zhuǎn)化體系包含質(zhì)粒DNA，所述質(zhì)粒DNA包括guide-RNA質(zhì)粒和 限制性內(nèi)切酶Ns i I消化的MAT基因表達(dá)盒質(zhì)粒片段。
[0010]優(yōu)選的，本發(fā)明所述轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法中所述感受態(tài)細(xì)胞的制備方法為挑取 攜帶pRS415+Cas9質(zhì)粒的酵母菌株單菌落于SC-Leu液體培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)，然后接種 過夜培養(yǎng)液到Y(jié)PD中30°C、220rpm條件下培養(yǎng)至0D 6QQ達(dá)到0.5，離心，收集細(xì)胞；用0.1M LiOAc重懸細(xì)胞，離心，吸除部分上清，剩余的LiOAc重懸細(xì)胞，置于冰上，得到感受態(tài)細(xì)胞。 [0011] 在一些實(shí)施方案中，所述感受態(tài)細(xì)胞為包含質(zhì)粒pRS415+Cas9的酵母菌株BY4741 感受態(tài)細(xì)胞。
[0012]在另一些實(shí)施方案中，所述感受態(tài)細(xì)胞為包含質(zhì)粒pRS415+Cas9的酵母菌株 BY4742感受態(tài)細(xì)胞。
[0013]優(yōu)選的，本發(fā)明所述轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法中所述guide-RNA質(zhì)粒的構(gòu)建方法包 括以下步驟：
[0014] a)選擇guide-RNA質(zhì)粒的protospacer，并合成引物；
[0015] b)退火粘合兩個(gè)引物，得到雙鏈DNA
[0016] c)限制性內(nèi)切酶Notl和CIP消化質(zhì)粒pRS426+SNR52p-gRNA，使之線性化；
[0017] d)Gibson組裝將pRS426+SNR52p-gRNA線性化質(zhì)粒和雙鏈DNA進(jìn)行組裝；
[0018] e)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于LB+Carb平板上，37°C培養(yǎng)12h，挑取單菌落 接種于LB+Carb液體培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒測序鑒定。
[0019] 在一些實(shí)施方案中，所述guide-RNA質(zhì)粒為pRS426+SNR52P-gRNA.MATa。
[0020] 其中，所述pRS426+SNR52P-gRNA.MATa質(zhì)粒的protospacer如SEQ ID NO: 1所示。
[0021] 所述pRS426+SNR52P-gRNA.MATa質(zhì)粒的引物如SEQIDN0:2和SEQIDN0:3所示。
[0022] 在另一些實(shí)施方案中，所述guide-RNA質(zhì)粒為pRS426+SNR52P-gRNA.MATa。
[0023] 其中，所述pRS426+SNR52P-gRNA·MATa質(zhì)粒的protospacer如SEQIDN0:4所示。
[0024] 所述pRS426+SNR52P-gRNA·MATα質(zhì)粒的引物如SEQIDN0:5和SEQIDN0:6所示。
[0025] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法中所述限制性內(nèi)切酶Nsil消化的MAT 基因表達(dá)盒質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括以下步驟：
[0026] a)合成引物：
[0027] b)以釀酒酵母基因組為模板，使用Thermo Scientific Phusi〇n?高保真DNA聚合 酶進(jìn)行PCR獲得DNA片段ΜΑΤα表達(dá)盒，電泳回收；
[0028] c)利用平末端質(zhì)?？寺。瑢ⅵˇ肠帘磉_(dá)盒連接到pTOPO平末端載體上，大腸桿菌轉(zhuǎn)化 后涂布于LB+Kan平板上，37°C過夜培養(yǎng)；
[0029] d)挑取單菌落接種于LB+Carb液體培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，提取質(zhì) 粒測序鑒定；
[0030] e)限制性內(nèi)切酶Ns i I消化的MAT基因表達(dá)盒質(zhì)粒。
[0031] 在一些實(shí)施方案中，所述MAT基因表達(dá)盒質(zhì)粒為ρΤ0Ρ0+ΜΑΤα。
[0032] 在另一些實(shí)施方案中，所述MAT基因表達(dá)盒質(zhì)粒為pT0P0+MATa。
[0033] 其中，所述MAT基因表達(dá)盒質(zhì)粒的引物如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示。
[0034] 所述ρΤ0Ρ0+ΜΑΤα質(zhì)粒的模板為釀酒酵母BY4742基因組。
[0035] 所述ρΤΟΡΟ+MATa質(zhì)粒的模板為釀酒酵母ΒΥ4741基因組。
[0036]本發(fā)明所述轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法所述轉(zhuǎn)化體系中所述質(zhì)粒DNA組成為每150yL 中含50ng guide-RNA質(zhì)粒和5yL MAT基因表達(dá)盒質(zhì)粒，余量為水。
[0037] 進(jìn)一步的，所述轉(zhuǎn)化體系還包括50%PEG3350、1M LiOAc和10mg/mL ssDNA。
[0038] 其中50%PEG3350、lMLi0Ac、10mg/mLssDNA和質(zhì)粒DNA的體積比為62:9:4:15。
[0039] 由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法，利用Cas9蛋白 在MAT基因座處產(chǎn)生雙鏈斷裂，外源導(dǎo)入的MAT片段對該雙鏈斷裂進(jìn)行修補(bǔ)，轉(zhuǎn)換釀酒酵母 交配型。本發(fā)明所述轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法可高效、快速轉(zhuǎn)換釀酒酵母單倍體交配型，不依 賴釀酒酵母自身染色體結(jié)構(gòu)HMLa和HMRa，無需經(jīng)過二倍體釀酒酵母階段，且無需對待轉(zhuǎn)換 釀酒酵母菌株進(jìn)行誘導(dǎo)等處理，直接獲得相反交配型釀酒酵母菌株，實(shí)驗(yàn)周期短。
【附圖說明】
[0040] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0041 ]圖1示基于H0基因轉(zhuǎn)換釀酒酵母交配型方法示意圖；
[0042]圖2示本發(fā)明所述轉(zhuǎn)換酵母交配型方法的示意圖；
[0043]圖3示實(shí)施例1將釀酒酵母菌株BY4741交配型轉(zhuǎn)換為ΜΑΤα的效率統(tǒng)計(jì)圖；
[0044]圖4示實(shí)施例2將釀酒酵母菌株ΒΥ4742交配型轉(zhuǎn)換為MATa的效率統(tǒng)計(jì)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0045] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的 實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0046] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0047] 一種轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法，利用Cas9蛋白在MAT基因座處產(chǎn)生雙鏈斷裂，外源導(dǎo) 入的MAT片段對該雙鏈斷裂進(jìn)行修補(bǔ)，轉(zhuǎn)換釀酒酵母交配型。
[0048]本發(fā)明所述轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法利用Cas9蛋白取代Ho蛋白在MAT基因座處產(chǎn)生 雙鏈斷裂，并利用外源導(dǎo)入的MAT片段對雙鏈斷裂進(jìn)行修補(bǔ)，對釀酒酵母交配型進(jìn)行轉(zhuǎn)換， 具體如圖2所示。
[0049] 其中，本發(fā)明所述轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法具體操作為將釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞與轉(zhuǎn) 化體系混合進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化，然后篩選，分純；其中所述釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞為包含PRS415+ Cas9質(zhì)粒的釀酒酵