犬細(xì)小病毒的遺傳標(biāo)記物及其特異性引物和探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，具體的，涉及犬細(xì)小病毒的遺傳標(biāo)記物及其特異性引 物和探針，本發(fā)明還涉及利用該靶序列進(jìn)行犬細(xì)小病毒檢測的方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 犬細(xì)小病毒(CanineParvovirus，CPV)可引起犬細(xì)小病毒病，是犬的一種高度接 觸性的烈性傳染病，臨床癥狀以出血性腸炎或非化膿性心肌炎為主要特征，是當(dāng)前危害我 國養(yǎng)犬業(yè)最嚴(yán)重的疫病之一。CPV屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬，線狀負(fù)鏈單股DNA病毒，基 因組長5323bp，編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2。
[0003] VP2是CPV的主要衣殼蛋白，編碼CPV的主要抗原決定簇，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗 體，也被認(rèn)為是受體的結(jié)合蛋白。VP2在病毒感染過程中起著極為重要的作用，CPV宿主范圍 由其結(jié)合細(xì)胞表面的受體或其他細(xì)胞配體的能力決定。VP2是病毒核心顆粒上的主要暴露 蛋白。
[0004] 目前，最常應(yīng)用的檢測犬細(xì)小病毒(CPV)的方法是血凝(HA)和血凝抑制試驗(yàn)(HI) 及PCR方法等。其中HA試驗(yàn)最為經(jīng)濟(jì)，但是其缺點(diǎn)在于，一方面獲取新鮮的紅細(xì)胞比較困難， 另一方面，該方法只適用于CPV感染后期樣本檢測，不適應(yīng)近年來早期、快速檢測的要求。實(shí) 時(shí)熒光定量PCR(real-timePCR)的出現(xiàn)，克服了普通PCR的不足，為目前較先進(jìn)的檢測方 法。該方法具有靈敏度高、特異性好、易操作、實(shí)效性好及重復(fù)性高等特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了檢測結(jié)果 和檢測樣品之間的定性和定量關(guān)系，并可根據(jù)需要對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
[0005]因此有必要對(duì)通過熒光定量PCR方法進(jìn)行犬細(xì)小病毒檢測的技術(shù)進(jìn)行深入研究和 開發(fā)，以滿足對(duì)患病動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品的快速檢測要求，防止犬細(xì)小病毒的傳播，而進(jìn)行熒光 定量PCR檢測的先決條件是找到特異的犬細(xì)小病毒的遺傳標(biāo)記物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供犬細(xì)小病毒(CanineParvovirus，CPV)的特異性遺傳標(biāo)記 物、焚光定量PCR引物、探針及檢測方法和試劑盒，以提尚對(duì)犬細(xì)小病毒的檢測能力，提尚檢 測效率。
[0007]為達(dá)到以上目的，本發(fā)明提供了一種犬細(xì)小病毒的遺傳標(biāo)記物，所述遺傳標(biāo)記物 含有如SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，該序列的特異性片段也 可以作為檢測犬細(xì)小病毒的遺傳標(biāo)記物。此外，含有本發(fā)明所述遺傳標(biāo)記物的特異性片段 的序列也可以作為檢測犬細(xì)小病毒的遺傳標(biāo)記物。
[0008] 進(jìn)一步的，所述遺傳標(biāo)記物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，或者，將SEQID NO. 1所示的核苷酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)堿基的取代和/或缺失和/或添加所獲得的具有相 同功能的序列。
[0009] 本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增所述犬細(xì)小病毒的特異性引物，所述特異性引物的核苷 酸序列為：
[0010] 上游引物F: 5 ' -GCACCATATTATTCTTTTGAG-3 '，
[0011] 下游引物R: 5 '-CCATGTTGTCTACCAAATG-3'。
[0012] 本發(fā)明還提供了與所述引物配合使用的熒光定量PCR探針，探針的5'標(biāo)記熒光基 團(tuán)，3'標(biāo)記淬滅基團(tuán)。
[0013]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述熒光定量PCR探針為：5'-F_ ATATCTTGGATCACCATCTGCTGCT-Q-3'。
[0014]可選的F為FAM、Hex、Tet、Joe、Vic、Fite、Cy3SCy5;QSTAMRA、Rox、Dabcy、BhqlS Bhq2〇
[0015]在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述F為FAM;Q為TAMRA。
[0016] 雖然引物和探針與靶序列完全互補(bǔ)是優(yōu)選的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在引物 與模板存在一定的不互補(bǔ)(尤其是引物的5'端)的情況下，也能夠特異性的擴(kuò)增出所需的片 段。含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，只要該引物擴(kuò) 增出的擴(kuò)增產(chǎn)物含有本發(fā)明的靶序列或其特異性片段。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種犬細(xì)小病毒的檢測方法，包括以樣品DNA或陽性質(zhì)粒為模板， 以所述遺傳標(biāo)記物為靶序列，利用本發(fā)明的引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，根據(jù)擴(kuò)增曲 線判定結(jié)果。熒光定量PCR擴(kuò)增同時(shí)設(shè)置無模板對(duì)照和陽性對(duì)照。
[0018] 可選的，實(shí)時(shí)熒光定量PCR25yL的反應(yīng)體系為：10ymol/LPremixExTaq2X buffer12.5yL，1Ομπιο1 /L的上、下游引物各0.5yL，5μπιο1 /L的探針lyL，模板2yL，dH20 8.5μ L〇
[0019] 可選的，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性30s，1個(gè)循環(huán);95°C變性 5s，55°C退火 10s，72°C延伸 20s，40 個(gè)循環(huán)。
[0020] 本發(fā)明每次檢測標(biāo)本時(shí)必須設(shè)立NTC對(duì)照(無模板對(duì)照)和P0S對(duì)照（陽性對(duì)照），兩 種對(duì)照對(duì)于結(jié)果判讀起決定性作用：
[0021]有效擴(kuò)增:NTC( -）AND P0S(+ );
[0022]無效擴(kuò)增:NTC(+)AND P0S(+ )提示體系污染；
[0023]無效擴(kuò)增:NTC( - )AND P0S( -）提示體系錯(cuò)誤或者試劑失效。
[0024]只有對(duì)照有效擴(kuò)增情況下的樣品檢測結(jié)果才可信，否則試驗(yàn)需要重復(fù)。
[0025]在檢測中兩種對(duì)照為有效擴(kuò)增時(shí)，樣本結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0026]Ct值小于等于38的標(biāo)本為陽性結(jié)果；
[0027]Ct值大于40的標(biāo)本為陰性結(jié)果；
[0028]Ct值在38-40之間的標(biāo)本需要重復(fù)，重復(fù)試驗(yàn)如Ct值依然低于40判定為陽性擴(kuò)增， 超過40判定為陰性擴(kuò)增。
[0029] 本發(fā)明提供了一種用于犬細(xì)小病毒檢測的試劑盒，其包括上述遺傳標(biāo)記物或其特 異性片段的特異性引物以及配合引物使用的探針。
[0030] 本發(fā)明試劑盒的引物序列為：
[0031 ]上游引物F: 5 '-GCACCATATTATTCTTTTGAG-3'，
[0032]下游引物R:5'-CCATGTTGTCTACCAAATG-3'。
[0033] 探針序列為：
[0034] 5 '-FAM-ATATCTTGGATCACCATCTGCTGCT-TAMRA-3'。
[0035]本發(fā)明提供的試劑盒，還包括熒光定量反應(yīng)液，陰性模板和陽性模板，所述陰性模 板為去核酸水，所述陽性模板為犬細(xì)小病毒基因組DNA。
[0036] 本發(fā)明還提供了含有上述引物和探針的檢測試劑。
[0037]利用本發(fā)明提供的引物和探針進(jìn)行犬細(xì)小病毒的熒光定量PCR檢測能夠進(jìn)一步簡 化犬細(xì)小病毒的檢測的程序、縮短檢測周期，能夠檢測犬細(xì)小病毒，可作為檢測臨床標(biāo)本的 手段，提高犬細(xì)小病毒檢測的陽性率。本發(fā)明的熒光定量PCR在反應(yīng)過程中可收集到很好的 信號(hào)，且檢測樣本的模板濃度均在建立方法的動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)，并與豬細(xì)小病毒和小鵝瘟病 毒無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。CPV臨床樣品檢測結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的陽 性檢出率達(dá)到98.1%。本發(fā)明建立的方法可用于犬細(xì)小病毒早期快速診斷，并且能夠?qū)崟r(shí) 地反映病毒的感染狀況，動(dòng)態(tài)地反映出病毒在機(jī)體組織中的分布情況。本發(fā)明提供的檢測 試劑盒，其反應(yīng)體系包含了本發(fā)明的上述引物、探針和陰性陽性對(duì)照，該試劑盒的推廣應(yīng)用 有利于快速、準(zhǔn)確地鑒定犬細(xì)小病毒的感染情況。
【附圖說明】
[0038]圖1為熒光定量PCR檢測的電泳檢測結(jié)果，其中Μ為100bp DNA Ladder，l和2為陽性 模板擴(kuò)增結(jié)果，片段大小為137bp，3為陰性對(duì)照。
[0039]圖2為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測犬細(xì)小病毒標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其中橫坐標(biāo)為陽性模板濃度 的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為反應(yīng)體系檢測不同濃度陽性模板的Ct值，圖中數(shù)字標(biāo)示的模板濃度為 1：1X107copies/yL；2：1X106copies/yL；3：1X105copies/yL；4：1X104copies/yL；5：1X 103(3〇ρ?θ8/μL，Κ2 = 0 · 983。
[0040]圖3為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測犬細(xì)小病毒特異性圖示，其中橫坐標(biāo)為陽性模板濃度 的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為反應(yīng)體系檢測不同濃度陽性模板的Ct值，圖中數(shù)字標(biāo)示的模板濃度為 1：1X107copies/yL；2：1X106copies/yL；3：1X105copies/yL；4：1X104copies/yL；5：1X 103copiesAiL，6:豬細(xì)小病毒DNA對(duì)照;7:小鵝瘟病毒DNA對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0042] 若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0043]實(shí)施例1犬細(xì)小病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法所用引物和探針的設(shè)計(jì)與合成
[0044] 根據(jù)GenBank公布的犬細(xì)小病毒病毒基因序列，通過序列比對(duì)選擇高度保守VP2基 因作為擴(kuò)增區(qū)域，設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物和1條探針，引物與探針由寶生物工程(大連)有限公司 合成，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為137bp。
[0045] 上述引物序列為：
[0046] 上游引物F:5'-GCACCATATTATTCTTTTGAG-3'（SEQIDN0.2)，
[0047]下游引物R:5'-CCATGTTGTCTACCAAATG-3'（SEQIDN0.3)。
[0048] 探針序列為：
[0049] 5 '-FAM-ATATCTTGGATCACCATCTGCTGCT-TAMRA-3 '
[0050] (SEQIDN0.4)〇
[0051] 擴(kuò)增目的基因序列為：
[0053] SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列可以作為檢測犬細(xì)小病毒的靶序列。
[0054] 實(shí)施例2犬細(xì)小病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立
[0055] 1.實(shí)驗(yàn)材料
[0056] 1.1毒種、菌株和載體
[0057] 犬